Orientador: Edgard Graner / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Odontologia de Piracicaba / Made available in DSpace on 2018-08-21T21:26:22Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Bastos_DeboraCampanella_D.pdf: 2999887 bytes, checksum: 8cc36631bdfe28b13c872fff12fdf00e (MD5) Previous issue date: 2012 / Resumo: A enzima ácido graxo sintase (FASN) é responsável pela síntese endógena de ácidos graxos e tem alta expressão em diversas neoplasias malignas. Cerulenina e orlistat são inibidores farmacológicos da atividade de FASN e têm sido descritos como potenciais agentes anti-tumorais. O sistema linfático constitui a via primária de metástases de diversas neoplasias malignas, dentre elas o melanoma. Em estudos prévios, realizados no Laboratório de Patologia Bucal da FOP-UNICAMP, a inibição da FASN com orlistat foi capaz de reduzir significantemente as metástases linfonodais em modelo murino de melanoma e no modelo ortotópico de carcinoma espinocelular oral. Além disso, o meio condicionado por células de melanoma humano tratadas com inibidores da FASN inibiu a formação de capilares in vitro em matrigel, efeito este mediado pela isoforma anti-angiogênica VEGF-A165b. A correlação entre a FASN e a linfangiogênese ainda não está descrita na literatura, neste trabalho investigamos os efeitos da inibição farmacológica da FASN sobre os fatores de crescimento endotelial vascular (VEGF-C e -D) em células de melanoma murino (B16-F10) e humano (SK-Mel-25) através de RT-PCR quantitativo e ELISA e verificamos os efeitos do bloqueio de FASN sobre a linfangiogênese por meio de culturas tridimensionais de células endoteliais linfáticas humanas (HDLEC) e culturas primárias de endotélio linfático de camundongo. Avaliamos também, o efeito da exposição de células SK-Mel-25 os inibidores da FASN sobre a proliferação de xviii células HDLEC. O tratamento de células B16-F10 e SK-Mel-25 com cerulenina ou orlistat modulou de forma diferencial a expressão de VEGF-C e -D, inibindo o primeiro ao mesmo tempo em que estimulou o último. Além disto, estas mesmas drogas reduziram em células endoteliais linfáticas a viabilidade, a proliferação, migração e formação de capilares em ensaio ex vivo, além de provocar apoptose. O tratamento com inibidores farmacológicos de FASN em células SK-Mel-25 também induziu um fenótipo anti-linfangiogênico, observado em experimentos com meio condicionado. Em conjunto, nossos resultados sugerem que a inibição farmacológica da FASN inibe a linfangiogênese por atuar ao mesmo tempo nas células dos vasos linfáticos e de melanoma. Esses resultados explicam, pelo menos em parte, a redução do número de metástases linfonodais em modelos animais tratados com orlistat e reforçam a teoria de que o bloqueio da FASN é um alvo terapêutico em potencial para os melanomas / Abstract: Fatty acid synthase (FASN) is responsible for de novo synthesis of long-chain fatty. FASN has emerged as a potential therapeutic target for human cancers since it's over expression is associated with depth of invasion and poor prognosis. Cerulenin and orlistat are pharmacological inhibitors of FASN and have been described as potential anti-tumor agents. Lymphatic vessels are the primary route of metastasis in several malignancies including melanomas. In previous studies performed in our laboratory, we demonstrated that FASN activity is essential for melanoma and oral squamous cell carcinoma progression, as its pharmacological inhibition with orlistat reduces lymphatic metastasis in both experimental intraperitoneal and subcutaneous melanomas and orthotopic tongue carcinomas. We also reported that cell culture medium previously conditioned by human melanoma cells in the presence of orlistat induces an anti-angiogenic phenotype mediated by VEGFA165b. Therefore, in order to understand a possible correlation between FASN and lymphangiogenesis, here we investigate the effects FASN inhibitors on the secretion of vascular endothelial growth factors (VEGF) -C and -D by murine (B16-F10) and human (SK-Mel-25) melanoma cells with the aid of qRT-PCR and ELISA assays. We also analyzed the effect of FASN blockage on tridimensional cultures of human lymphatic endothelial cells (HDLEC) and primary cultures of murine lymphatic endothelium. In addition, we also evaluated an indirect effect of the treatment with cerulenin and orlistat in SK-Mel-25 cells on HDLEC xx proliferation. The incubation of B16-F10 or SK-Mel-25 cells with cerulenin or orlistat modulated VEGF-C and -D expression by significantly inhibiting the former and increasing the latter. In addition, these drugs reduced the viability, proliferation, and migration as well as promoted apoptosis in human lymphatic endothelial cells (HDLEC). These compounds also inhibited lymphatic capillary formation in a murine ex vivo assay. Finally, conditioned media from orlistat-treated human melanoma cells resulted in an anti-lymphangiogenic phenotype. These data suggest that FASN inhibitiors reduce lymphangiogenesis by acting simultaneously in the lymphatic endothelium and melanoma cells. Taken together, the studies here presented explain, at least in part, the anti-metastatic effect of orlistat observed in experimental tumors and further suggest that FASN is a potential therapeutic target for melanomas / Doutorado / Patologia / Doutora em Estomatopatologia

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Introdução: Os carcinomas vulvares são tumores raros com morbidade elevada associada ao tratamento cirúrgico padrão e altos índices de recorrência loco-regional. Os vasos linfáticos são importantes vias de disseminação regional e o estado linfonodal é o principal indicador prognóstico. A densidade linfática do tumor, assim como moléculas relacionadas à linfangiogênese tem sido avaliadas em vários tumores para prever metástase linfonodal e para identificar possíveis alvos terapêuticos. Entre as moléculas relacionadas ao controle da linfangiogênese destaca-se a podoplanina, cuja expressão por células neoplásicas de tipo escamoso pode inibir a disseminação linfática. Não identificamos até o momento nenhum estudo que tenha avaliado o papel da densidade de vasos linfáticos intratumorais ou da expressão de podoplanina pelas células neoplásicas no comportamento de carcinomas escamosos vulvares. Objetivos: Nossos objetivos foram estudar a densidade intratumoral dos vasos linfáticos (DVL) e a expressão de podoplanina pelas células neoplásicas em carcinomas escamosos vulvares no sentido de determinar sua relação com o desfecho e fatores prognósticos clássicos, incluindo metástase linfonodal. Métodos: Selecionamos 35 pacientes com carcinoma de células escamosas vulvares submetidas à tratamento cirúrgico primário incluindo vulvectomia e dissecção regional de nódulos linfáticos. Após revisão dos dados dos prontuários médicos (idade da paciente, estadiamento, tipo de tratamento e tamanho do tumor), todas as lâminas foram reexaminadas para determinar o grau histológico, invasão linfática peritumoral e profundidade da infiltração. Foram selecionadas áreas do tumor para a construção de blocos de parafina com microarranjos de tecidos e identificação imunoistoquímica de podoplanina pelo anticorpo D2-40. A DVL intratumoral foi quantificada pela contagem de vasos marcados nas áreas de maior densidade. O número de vasos foi contado em 10 campos microscópicos de grande aumento e a média foi o valor atribuído para a DVL em cada caso. A expressão de podoplanina pelas células neoplásicas foi considerada positiva quando mais de 10% das células apresentaram coloração citoplasmática de intensidade moderada a intensa. Investigamos a associação das duas variáveis com as características prognósticas clássicas (idade, estadiamento, tamanho do tumor, grau histológico, embolização vascular peritumoral, nível de infiltração do tumor, comprometimento linfonodal), assim como sua associação com desfecho. Resultados: Valores mais elevados de DVL intratumoral foram identificados em tumores de baixo grau, em estádios iniciais, em tumores sem invasão linfática e naqueles com menor infiltração estromal. Na análise univariada, DVL intratumoral elevada foi associada a maior sobrevida geral . A expressão de podoplanina pelas células neoplásicas não se relacionou a nenhuma das variáveis prognósticas, comprometimento linfonodal ou sobrevida, assim como não se associou à DVL. Conclusões: A DVL intratumoral em carcinomas escamosos vulvares associa-se a características prognósticas favoráveis. Já a expressão de podoplanina pelas células neoplásicas não parece interferir na apresentação e comportamento destes carcinomas. / Introduction: Vulvar carcinomas are rare tumors presenting high morbidity associated to the standard surgical treatment and high rates of locoregional recurrence. Lymphatic vessels serves as major routes for regional dissemination and the lymph node status is the main prognostic indicator. Tumor lymphatic density as well as lymphangiogenesis-related molecules has being studied in various tumors in order to predict lymph node metastasis and to identify a possible candidate to target therapy. Among the molecules related to lymphangiogenesis in the group of squamous cell carcinomas podoplanin expression by neoplastic cells emerges as an inhibitor of lymphatic dissemination. To our knowledge, no study evaluated the role of intratumoral lymphatic vessels or podoplanin expression by neoplastic cells in the behavior of vulvar squamous carcinomas. Objectives: Our aims were to study the intratumoral lymphatic vessel density (LVD) and podoplanin expression by neoplastic cells in vulvar squamous carcinoma according their relationship with outcome and classical prognostic factors, including lymph node metastasis. Methods: We selected 35 cases of patients with vulvar squamous cell carcinoma submitted to primary surgical treatment that included vulvectomy and regional lymph nodes dissection. After revision of medical records data (age of patient, stage, type of surgery and tumor size), all the slides were reviewed to achieve histological grade, peritumoral lymphatic invasion and depth of infiltration. Areas of the tumor were selected to construction of tissue microarrays paraffin blocs and immunohistochemical identification of podoplanin by the D2-40 antibody. Intratumoral LVD was quantified by counting the stained vessels in hotspots areas. The number of vessels was counted in 10 high power microscopic fields and the mean was the value of the LVD for each case. Podoplanin expression by neoplastic cells was considered positive when more than 10% of the cells showed moderate to strong cytoplasmatic stained. We investigated the association of the two variables with classical prognostic features (age of patient, stage, tumor size, histologic grade, vascular involvement, depth of infiltration, lymph node involvement as well outcome. Results: Higher values of intratumoral LVD were identified in low grade and low stage tumors, in tumors without lymphatic invasion and those with lesser stromal infiltration. In univariate analysis, high intratumoral LVD was associated to higher overall survival. Podoplanin expression by neoplastic cells did not show association with any of the prognostic variable, nor with lymph node involvement or outcome. Conclusions: Intratumoral LVD in vulvar squamous carcinoma is associated with prognostic favorable features. On the other hand, podoplanin expression by neoplastic cells did not seem to influence the behavior of these carcinomas

Introdução: Os carcinomas vulvares são tumores raros com morbidade elevada associada ao tratamento cirúrgico padrão e altos índices de recorrência loco-regional. Os vasos linfáticos são importantes vias de disseminação regional e o estado linfonodal é o principal indicador prognóstico. A densidade linfática do tumor, assim como moléculas relacionadas à linfangiogênese tem sido avaliadas em vários tumores para prever metástase linfonodal e para identificar possíveis alvos terapêuticos. Entre as moléculas relacionadas ao controle da linfangiogênese destaca-se a podoplanina, cuja expressão por células neoplásicas de tipo escamoso pode inibir a disseminação linfática. Não identificamos até o momento nenhum estudo que tenha avaliado o papel da densidade de vasos linfáticos intratumorais ou da expressão de podoplanina pelas células neoplásicas no comportamento de carcinomas escamosos vulvares. Objetivos: Nossos objetivos foram estudar a densidade intratumoral dos vasos linfáticos (DVL) e a expressão de podoplanina pelas células neoplásicas em carcinomas escamosos vulvares no sentido de determinar sua relação com o desfecho e fatores prognósticos clássicos, incluindo metástase linfonodal. Métodos: Selecionamos 35 pacientes com carcinoma de células escamosas vulvares submetidas à tratamento cirúrgico primário incluindo vulvectomia e dissecção regional de nódulos linfáticos. Após revisão dos dados dos prontuários médicos (idade da paciente, estadiamento, tipo de tratamento e tamanho do tumor), todas as lâminas foram reexaminadas para determinar o grau histológico, invasão linfática peritumoral e profundidade da infiltração. Foram selecionadas áreas do tumor para a construção de blocos de parafina com microarranjos de tecidos e identificação imunoistoquímica de podoplanina pelo anticorpo D2-40. A DVL intratumoral foi quantificada pela contagem de vasos marcados nas áreas de maior densidade. O número de vasos foi contado em 10 campos microscópicos de grande aumento e a média foi o valor atribuído para a DVL em cada caso. A expressão de podoplanina pelas células neoplásicas foi considerada positiva quando mais de 10% das células apresentaram coloração citoplasmática de intensidade moderada a intensa. Investigamos a associação das duas variáveis com as características prognósticas clássicas (idade, estadiamento, tamanho do tumor, grau histológico, embolização vascular peritumoral, nível de infiltração do tumor, comprometimento linfonodal), assim como sua associação com desfecho. Resultados: Valores mais elevados de DVL intratumoral foram identificados em tumores de baixo grau, em estádios iniciais, em tumores sem invasão linfática e naqueles com menor infiltração estromal. Na análise univariada, DVL intratumoral elevada foi associada a maior sobrevida geral . A expressão de podoplanina pelas células neoplásicas não se relacionou a nenhuma das variáveis prognósticas, comprometimento linfonodal ou sobrevida, assim como não se associou à DVL. Conclusões: A DVL intratumoral em carcinomas escamosos vulvares associa-se a características prognósticas favoráveis. Já a expressão de podoplanina pelas células neoplásicas não parece interferir na apresentação e comportamento destes carcinomas. / Introduction: Vulvar carcinomas are rare tumors presenting high morbidity associated to the standard surgical treatment and high rates of locoregional recurrence. Lymphatic vessels serves as major routes for regional dissemination and the lymph node status is the main prognostic indicator. Tumor lymphatic density as well as lymphangiogenesis-related molecules has being studied in various tumors in order to predict lymph node metastasis and to identify a possible candidate to target therapy. Among the molecules related to lymphangiogenesis in the group of squamous cell carcinomas podoplanin expression by neoplastic cells emerges as an inhibitor of lymphatic dissemination. To our knowledge, no study evaluated the role of intratumoral lymphatic vessels or podoplanin expression by neoplastic cells in the behavior of vulvar squamous carcinomas. Objectives: Our aims were to study the intratumoral lymphatic vessel density (LVD) and podoplanin expression by neoplastic cells in vulvar squamous carcinoma according their relationship with outcome and classical prognostic factors, including lymph node metastasis. Methods: We selected 35 cases of patients with vulvar squamous cell carcinoma submitted to primary surgical treatment that included vulvectomy and regional lymph nodes dissection. After revision of medical records data (age of patient, stage, type of surgery and tumor size), all the slides were reviewed to achieve histological grade, peritumoral lymphatic invasion and depth of infiltration. Areas of the tumor were selected to construction of tissue microarrays paraffin blocs and immunohistochemical identification of podoplanin by the D2-40 antibody. Intratumoral LVD was quantified by counting the stained vessels in hotspots areas. The number of vessels was counted in 10 high power microscopic fields and the mean was the value of the LVD for each case. Podoplanin expression by neoplastic cells was considered positive when more than 10% of the cells showed moderate to strong cytoplasmatic stained. We investigated the association of the two variables with classical prognostic features (age of patient, stage, tumor size, histologic grade, vascular involvement, depth of infiltration, lymph node involvement as well outcome. Results: Higher values of intratumoral LVD were identified in low grade and low stage tumors, in tumors without lymphatic invasion and those with lesser stromal infiltration. In univariate analysis, high intratumoral LVD was associated to higher overall survival. Podoplanin expression by neoplastic cells did not show association with any of the prognostic variable, nor with lymph node involvement or outcome. Conclusions: Intratumoral LVD in vulvar squamous carcinoma is associated with prognostic favorable features. On the other hand, podoplanin expression by neoplastic cells did not seem to influence the behavior of these carcinomas

Este estudo avaliou a densidade vascular linfática (DVL) em relação a expressão do fator de crescimento endotelial vascular-C (VEGF-C) pelas células tumorais, bem como verificou a associação com variáveis clínicas e microscópicas de pacientes portadores de carcinoma espinocelular de boca (CEC). Oitenta e sete pacientes com CECs primários, clinicamente T1N0M0 ou T2N0M0, com metástase linfonodal oculta (pN+) e sem (pN0), foram analisadas após tratamento no Hospital do Câncer A.C. Camargo, São Paulo, Brasil. Amostras dos tumores emblocados em parafina foram seccionadas e coradas com os anticorpos primários anti-podoplanina e anti-VEGF-C humanos. Os vasos linfáticos foram contados nas regiões intratumoral (DLI) e peritumoral (DLP) em vinte campos microscópicos (400X) sequenciais e em cinco campos microscópicos (400X) por hot spot de cada tumor. As médias das densidades linfáticas, intratumoral e peritumoral, foram obtidas isoladamente e usadas como pontos de corte da amostra, dividindo-a em tumores com alta densidade linfática e baixa densidade linfática. As associações entre DLI / DLP e a expressão de VEGF-C ou em relação aos parâmetros clínicos e microscópicos avaliados foram obtidas pelo teste do qui-quadrado ou teste exato de Fisher. As taxas de sobrevidas, acumuladas em cinco e dez anos, foram calculadas pelo método de Kaplan-Meier e comparadas pelo teste log-rank (=5%). Não houve associação estatisticamente significativa entre a expressão de VEGF-C nos CECs de boca e os parâmetros clinicopatológicos avaliados. Os pacientes com alta DLP apresentaram maiores taxas de sobrevida específica por câncer (p=0,044) e sobrevida livre de doença (p=0,016). Houve associação estatística significativa entre a alta DLI e a maior ocorrência de recidiva regional nos pacientes da amostra (p=0,047). Entretanto, a alta DLI não foi suficiente para influenciar a sobrevida livre de doença desses pacientes do ponto de vista estatístico. DLP e DLI não se mostraram fatores preditivos para a ocorrência de metástases ocultas nos linfonodos regionais dos pacientes com CEC de boca em estádios clínicos precoces. / This study evaluated the lymphatic vesssel density (LVD) in correlation with the vascular endothelial growth factor-C (VEGF-C) expression by tumors cells and with clinical and pathological variables in patients with oral squamous cell carcinomas (OSCC). Eighty-seven patients with primary OSCC, clinically T1N0M0 or T2N0M0, with occult lymph-node metastases (pN+) and without (pN0), were analysed after treated in the A. C. Camargo Cancer Hospital, São Paulo, Brazil. Archived paraffin-embedded tumor specimens were sectioned and stained with anti- human podoplanin and VEGF-C antibodies. Lymphatic vessels were counted in intratumoral (ILVD) and peritumoral (PLVD) areas in twenty sequential high-power fields and in five hot spot high-power fields from each tumor. Average values were obtained and used as cutoff point. The correlations between ILVD/PLVD and VEGF-C expression as well as clinicopathological parameters were obtained by chi-square test or Fishers exact test. The 5 and 10-year survival rates were calculated by the Kaplan-Meier method and compared by log-rank test. No statistically significant difference was found between VEGF-C expression in OSCC in regard to clinicopathological parameters. An association between the ILVD and regional recurrence was found (p=0.047) and the PLVD showed associations with disease-specific survival (p=0.044) and disease-free survival (p=0.016). These findings indicate that high ILVD may influences the regional recurrence in neck lymph nodes of patients with early OSCC, however this data was not enough to influence the disease-free survival of these patients with a statistically significant association. PLVD or ILVD did not show predictive value for occult lymph-node metastases in the early stages of OSCC.

Este estudo avaliou a densidade vascular linfática (DVL) em relação a expressão do fator de crescimento endotelial vascular-C (VEGF-C) pelas células tumorais, bem como verificou a associação com variáveis clínicas e microscópicas de pacientes portadores de carcinoma espinocelular de boca (CEC). Oitenta e sete pacientes com CECs primários, clinicamente T1N0M0 ou T2N0M0, com metástase linfonodal oculta (pN+) e sem (pN0), foram analisadas após tratamento no Hospital do Câncer A.C. Camargo, São Paulo, Brasil. Amostras dos tumores emblocados em parafina foram seccionadas e coradas com os anticorpos primários anti-podoplanina e anti-VEGF-C humanos. Os vasos linfáticos foram contados nas regiões intratumoral (DLI) e peritumoral (DLP) em vinte campos microscópicos (400X) sequenciais e em cinco campos microscópicos (400X) por hot spot de cada tumor. As médias das densidades linfáticas, intratumoral e peritumoral, foram obtidas isoladamente e usadas como pontos de corte da amostra, dividindo-a em tumores com alta densidade linfática e baixa densidade linfática. As associações entre DLI / DLP e a expressão de VEGF-C ou em relação aos parâmetros clínicos e microscópicos avaliados foram obtidas pelo teste do qui-quadrado ou teste exato de Fisher. As taxas de sobrevidas, acumuladas em cinco e dez anos, foram calculadas pelo método de Kaplan-Meier e comparadas pelo teste log-rank (=5%). Não houve associação estatisticamente significativa entre a expressão de VEGF-C nos CECs de boca e os parâmetros clinicopatológicos avaliados. Os pacientes com alta DLP apresentaram maiores taxas de sobrevida específica por câncer (p=0,044) e sobrevida livre de doença (p=0,016). Houve associação estatística significativa entre a alta DLI e a maior ocorrência de recidiva regional nos pacientes da amostra (p=0,047). Entretanto, a alta DLI não foi suficiente para influenciar a sobrevida livre de doença desses pacientes do ponto de vista estatístico. DLP e DLI não se mostraram fatores preditivos para a ocorrência de metástases ocultas nos linfonodos regionais dos pacientes com CEC de boca em estádios clínicos precoces. / This study evaluated the lymphatic vesssel density (LVD) in correlation with the vascular endothelial growth factor-C (VEGF-C) expression by tumors cells and with clinical and pathological variables in patients with oral squamous cell carcinomas (OSCC). Eighty-seven patients with primary OSCC, clinically T1N0M0 or T2N0M0, with occult lymph-node metastases (pN+) and without (pN0), were analysed after treated in the A. C. Camargo Cancer Hospital, São Paulo, Brazil. Archived paraffin-embedded tumor specimens were sectioned and stained with anti- human podoplanin and VEGF-C antibodies. Lymphatic vessels were counted in intratumoral (ILVD) and peritumoral (PLVD) areas in twenty sequential high-power fields and in five hot spot high-power fields from each tumor. Average values were obtained and used as cutoff point. The correlations between ILVD/PLVD and VEGF-C expression as well as clinicopathological parameters were obtained by chi-square test or Fishers exact test. The 5 and 10-year survival rates were calculated by the Kaplan-Meier method and compared by log-rank test. No statistically significant difference was found between VEGF-C expression in OSCC in regard to clinicopathological parameters. An association between the ILVD and regional recurrence was found (p=0.047) and the PLVD showed associations with disease-specific survival (p=0.044) and disease-free survival (p=0.016). These findings indicate that high ILVD may influences the regional recurrence in neck lymph nodes of patients with early OSCC, however this data was not enough to influence the disease-free survival of these patients with a statistically significant association. PLVD or ILVD did not show predictive value for occult lymph-node metastases in the early stages of OSCC.

<p>Увод: Туморска лимфангиогенеза је подручје активног истраживања у циљу проналаска параметара који би омогућили прецизније предвиђање понашања меланома него што то омогућавају традиционални хистолошки и клинички параметри. Иако су импресивна открића о улози лимфангиогенезе у промовисању метастазирања меланома коже, ипак су остала отворена бројна питања и још увек нису усаглашене препоруке које би биле примењиване у дијагностици и терапији. Циљ истраживања је био испитати да ли параметри лимфангиогенезе и Шилдсов индекс имају значај за прогнозу код пацијената са меланомом коже. Материјал и методе: У истраживање је укључено 100 пацијената са меланомом коже (52 без метастаза и 48 са метастазама у лимфним чворовима). За приказ ендотела лимфних судова исечци тумора су бојени имунохистохемијском методом са D2-40 антителима. Квантитативни параметри лимфангиогенезе &ndash; густина и површина лимфних судова добијени су компјутерском морфометријском анализом. За детекцију инвазије лимфних судова туморским ћелијама меланома урађено је дупло бојење D2-40 и S-100 антигена. Имунохистохемијски је испитана експресија васкуларног ендотелног фактора раста (VEGF)-C и VEGF-D у туморским ћелијама, макрофагима и фибробластима меланома. Шилдсов индекс је рачунат као логаритам производа дебљине меланома, квадриране перитуморске густине лимфних судова (ГЛС) и броја 2 за присутну лимфатичну инвазију. Резултати: Параметри који су статистички значајно доприносили појави метастаза меланома у лимфним чворовима, на униваријантној анализи, били су интратуморска ГЛС, перитуморска ГЛС, експресија VEGF-C и VEGF-D у туморским ћелијама, дебљина тумора, улцерација, дубља инвазија по Кларку, нодуларни тип меланома и мушки пол. Мултиваријантна анализа је показала да су значајни независни прогностички фактори за настанак метастаза позитивна експресија VEGF-C у туморским ћелијама, повећана дебљина тумора, повећана интратуморска ГЛС и перитуморска ГЛС. Као најјачи предиктор појаве метастаза показала се позитивна експресија VEGF-C у туморским ћелијама. Пацијенти са &lt;20% VEGF-C позитивних туморских ћелија имали су 20 пута већи ризик за развој метастаза него пацијенти са негативном експресијом. Параметри са утицајем на меланом-специфично преживљавање на униваријантној анализи су били интратуморска ГЛС, перитуморска ГЛС, експресија VEGF-C и VEGF-D у туморским ћелијама, док је мултиваријантна анализа издвојила повећану интратуморску и перитуморску ГЛС као независне факторе ризика за смртни исход. Интратуморска и перитуморска површина лимфних судова, лимфатична инвазија и експресија VEGF-C и VEGF-D у макрофагима и фибробластима нису биле значајно повезане са појавом метастаза нити са краћим меланом-специфичним преживљавањем. Ниједан параметар лимфангиогенезе није био значајно повезан са краћим преживљавањем без рецидива болести. Анализа оперативне карактеристичне криве (ROC) је показала да је Шилдсов индекс веома добар параметар за процену настанка метастаза, са сензитивношћу 81,3% и специфичношћу 75%. Већа површина испод ROC криве код Шилдсовог индекса (0,857) у поређењу са површином код других параметара, указује да је индекс најтачнији прогностички параметар за настанак метастаза, затим следи интратуморска ГЛС (површина 0,795), перитуморска ГЛС (површина 0,772), дебљина меланома (површина 0,762) и American Joint Committee on Cancer систем класификације (површина 0,752). Закључак: Истраживање туморске лимфангиогенезе идентификује нове параметре као значајније предикторе исхода болести од дебљине тумора, улцерације и осталих клиничко-патолошких параметара. Помоћу интратуморске и перитуморске ГЛС, експресије VEGF-C и VEGF-D у туморским ћелијама, као и прорачуна Шилдс индекса, може се предвидети метастатски капацитет меланома. Рутинска патохистолошка анализа меланома требало би да укључи квантитативну анализу мреже лимфних судова и семиквантитативну евалуацију експресије VEGF-C и VEGF-D у туморским ћелијама.</p> / <p>Uvod: Tumorska limfangiogeneza je područje aktivnog istraživanja u cilju pronalaska parametara koji bi omogućili preciznije predviđanje ponašanja melanoma nego što to omogućavaju tradicionalni histološki i klinički parametri. Iako su impresivna otkrića o ulozi limfangiogeneze u promovisanju metastaziranja melanoma kože, ipak su ostala otvorena brojna pitanja i još uvek nisu usaglašene preporuke koje bi bile primenjivane u dijagnostici i terapiji. Cilj istraživanja je bio ispitati da li parametri limfangiogeneze i Šildsov indeks imaju značaj za prognozu kod pacijenata sa melanomom kože. Materijal i metode: U istraživanje je uključeno 100 pacijenata sa melanomom kože (52 bez metastaza i 48 sa metastazama u limfnim čvorovima). Za prikaz endotela limfnih sudova isečci tumora su bojeni imunohistohemijskom metodom sa D2-40 antitelima. Kvantitativni parametri limfangiogeneze &ndash; gustina i površina limfnih sudova dobijeni su kompjuterskom morfometrijskom analizom. Za detekciju invazije limfnih sudova tumorskim ćelijama melanoma urađeno je duplo bojenje D2-40 i S-100 antigena. Imunohistohemijski je ispitana ekspresija vaskularnog endotelnog faktora rasta (VEGF)-C i VEGF-D u tumorskim ćelijama, makrofagima i fibroblastima melanoma. Šildsov indeks je računat kao logaritam proizvoda debljine melanoma, kvadrirane peritumorske gustine limfnih sudova (GLS) i broja 2 za prisutnu limfatičnu invaziju. Rezultati: Parametri koji su statistički značajno doprinosili pojavi metastaza melanoma u limfnim čvorovima, na univarijantnoj analizi, bili su intratumorska GLS, peritumorska GLS, ekspresija VEGF-C i VEGF-D u tumorskim ćelijama, debljina tumora, ulceracija, dublja invazija po Klarku, nodularni tip melanoma i muški pol. Multivarijantna analiza je pokazala da su značajni nezavisni prognostički faktori za nastanak metastaza pozitivna ekspresija VEGF-C u tumorskim ćelijama, povećana debljina tumora, povećana intratumorska GLS i peritumorska GLS. Kao najjači prediktor pojave metastaza pokazala se pozitivna ekspresija VEGF-C u tumorskim ćelijama. Pacijenti sa &lt;20% VEGF-C pozitivnih tumorskih ćelija imali su 20 puta veći rizik za razvoj metastaza nego pacijenti sa negativnom ekspresijom. Parametri sa uticajem na melanom-specifično preživljavanje na univarijantnoj analizi su bili intratumorska GLS, peritumorska GLS, ekspresija VEGF-C i VEGF-D u tumorskim ćelijama, dok je multivarijantna analiza izdvojila povećanu intratumorsku i peritumorsku GLS kao nezavisne faktore rizika za smrtni ishod. Intratumorska i peritumorska površina limfnih sudova, limfatična invazija i ekspresija VEGF-C i VEGF-D u makrofagima i fibroblastima nisu bile značajno povezane sa pojavom metastaza niti sa kraćim melanom-specifičnim preživljavanjem. Nijedan parametar limfangiogeneze nije bio značajno povezan sa kraćim preživljavanjem bez recidiva bolesti. Analiza operativne karakteristične krive (ROC) je pokazala da je Šildsov indeks veoma dobar parametar za procenu nastanka metastaza, sa senzitivnošću 81,3% i specifičnošću 75%. Veća površina ispod ROC krive kod Šildsovog indeksa (0,857) u poređenju sa površinom kod drugih parametara, ukazuje da je indeks najtačniji prognostički parametar za nastanak metastaza, zatim sledi intratumorska GLS (površina 0,795), peritumorska GLS (površina 0,772), debljina melanoma (površina 0,762) i American Joint Committee on Cancer sistem klasifikacije (površina 0,752). Zaključak: Istraživanje tumorske limfangiogeneze identifikuje nove parametre kao značajnije prediktore ishoda bolesti od debljine tumora, ulceracije i ostalih kliničko-patoloških parametara. Pomoću intratumorske i peritumorske GLS, ekspresije VEGF-C i VEGF-D u tumorskim ćelijama, kao i proračuna Šilds indeksa, može se predvideti metastatski kapacitet melanoma. Rutinska patohistološka analiza melanoma trebalo bi da uključi kvantitativnu analizu mreže limfnih sudova i semikvantitativnu evaluaciju ekspresije VEGF-C i VEGF-D u tumorskim ćelijama.</p> / <p>Introduction: Tumor lymphangiogenesis is a field of active research with the aim of finding parameters which would enable the more precise prediction of melanoma behavior in comparison to the prediction of traditional histological and clinical parameters. Although scientific findings about the role of lymphangiogenesis in developing cutaneous melanoma are impressive, there are unresolved questions and recommendations to be applied in diagnostics and therapy, which are still not in compliance. The aim of this research is to examine if parameters of lymphangiogenesis and the Shields Index are important for the prognosis in patients with cutaneous melanoma. Material and methods: The research included a hundred patients with cutaneous melanoma (52 without metastasis and 48 with metastasis of lymphatic nodes). To present endothelial lymphatic vessels, specimens were stained by an immunohistochemical method with D2-40 antibodies. Quantitative parameters of lymphangiogenesis &ndash; lymphatic vessel density (LVD) and area (LVA) were calculated by computer-assisted morphometric analysis. In order to detect the invasion of lymphatic vessels by melanoma tumor cells, a double staining of D2-40 and S-100 antigens was performed. The expression of vascular endothelial growth factor (VEGF)-C and VEGF-D was tested by an immunohistochemical method in tumor cells, macrophages and fibroblasts melanoma. The Shields Index was calculated as a logarithm by multiplying the melanoma thickness, square of peritumoral LVD and the number 2 for present lymphatic invasion. Results:Parameters that statistically had a significant contribution to the emergence of melanoma metastases in lymph nodes, during the univariate analysis, were intratumoral LVD, peritumoral LVD, VEGF-C and VEGF-D expression in tumor cells, tumor thickness, ulceration, deeper Clarkꞌs level of invasion, nodular type of melanoma and a male sex. The multivariate analysis showed that positive expression of VEGF-C in tumor cells, tumor thickness, increased intratumoral LVD and peritumoral LVD are significant independent prognostic factors. The most important predictor of metastases is a positive expression of VEGF-C in tumor cells. Patients with &lt;20% VEGF-C positive tumor cells were 20 times more at risk of developing metastases than patients with a negative expression. Parameters that influence melanoma-specific survival at the univariate analysis were intratumoral LVD, peritumoral LVD, VEGF-C and VEGF-D expression in tumor cells, while the multivariate analysis singled out an increased intratumoral and peritumoral LVD as independent factors of the death risk. Intratumoral and peritumoral LVA, lymphatic invasion and VEGF-C and VEGF-D expression in macrophages and fibroblasts were not significantly correlated either with the emergence of metastases or with melanoma-specific survival. Non-parameter of lymphangiogenesis was significantly related with shorter disease-free survival. The analysis of receiver operator characteristic (ROC) curve showed that the Shields Index is a very good parameter for the estimation of the appearance of metastases, with the sensitivity of 81.3% and specificity of 75%. A bigger area under the ROC curve with the Shields Index (0.857) in comparison to the area in other parameters shows that the index is the most accurate prognostic parameter for an emergence of metastases, followed by intratumoral LVD (area 0.795), peritumoral LVD (area 0.772), the thickness of melanoma (area 0.762), and the American Joint Committee on Cancer classification system (area 0.752). Conclusion: The research of tumor lymphangiogenesis identifies new parameters as significant predictors of the disease outcome more so than the parameters like tumor thickness, ulceration, and other clinical-pathological parameters. By intratumoral and peritumoral LVD, VEGF-C and VEGF-D expression in tumor cells, as well as by the calculation of Shields Index, metastatic capacity of melanoma can be predicted. A routine pathohistological analysis of melanoma should include quantitative analysis of the lymphatic vessels network and semiquantitative evaluation of VEGF-C and VEGF-D expression in tumor cells.</p>