Orientador: Gabriela Alves Macedo / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos / Made available in DSpace on 2018-08-24T20:11:19Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Silva_EricaBenjamimda_M.pdf: 2288195 bytes, checksum: 5e5ae636ebf8e0749f7cc42bc309a508 (MD5) Previous issue date: 2014 / Resumo: A bioprospecção de micro-organismos nativos capazes de produzir enzimas com diferentes propriedades catalíticas é essencial para o desenvolvimento do setor biotecnológico brasileiro. A lipase é uma enzima com vasta aplicação biotecnológica, utilizada na resolução de fármacos quirais, modificação de gorduras, produção de biocombustíveis, cosméticos, agroquímicos, oleoquímicos e realçadores de sabor. A tanase é outra enzima com grande potencial de aplicação industrial por ser capaz de catalisar a hidrólise de taninos hidrolisáveis e de ésteres de ácido gálico. Desse modo, o objetivo desse trabalho foi isolar novas linhagens de micro-organismos capazes de produzir as enzimas tanase e lipase extracelulares e caracterizar, bioquimicamente, as enzimas selecionadas. Foram isoladas 131 linhagens de fungos e 109 linhagens de leveduras da Região Amazônica e da região da Mata Atlântica. Tais linhagens fúngicas juntamente com outras linhagens da Coleção de Micro-organismos do Laboratório de Bioquímica FEA-UNICAMP (n=348) foram analisadas em meio sólido diferencial. Foram obtidas 26 linhagens positivas para lipase e 105 para tanase. As linhagens positivas foram testadas quanto à capacidade de produzir lipase e tanase por fermentação em estado sólido. A atividade enzimática da tanase foi quantificada por espectrofotometria e a da lipase por titulometria de neutralização. A lipase da linhagem de Colletotrichum sp. apresentou atividade enzimática específica igual a 25,97 U/mg; Km= 6,3 %; Vm= 19,5 U/mg; pH ótimo de atividade de 6,5 a 7,0 e temperatura ótima de atividade de 25 °C à 35 °C. A tanase da linhagem de Aspergillus niger apresentou atividade enzimática de 0,79 U/mL e a produzida pela linhagem de Paecilomyces sp. atingiu atividade específica de 2,14 U/mg, pH e temperatura ótima de atividade de 5,5 e 60°C, respectivamente / Abstract: The bioprospection of native microorganisms capable of producing enzymes with diverse catalytic properties is essential to the development of the Brazilian biotechnological sector. Lipase is an enzyme with wide biotechnological application, it is used on chiral drugs resolution, fat modification and on the production of biofuels, cosmetics and flavor enhancers. Tannase is another enzyme with large potential to be applied at industries, it is capable of catalyze the hydrolysis of hydrolysable tannins and galic acid esters. Therefore, this work goal is to isolate novel microorganisms strains capable of producing extracellular lipase and tannase, and to characterize biochemically the selected strains. 131 fungal strains and 109 yeast strains were isolated from Amazon and Atlantic Rainforest regions. These fungal strains summed with others strains from the Microorganisms Collection of the Biochemistry Laboratory/ FEA-UNICAMP (n=348) by differential solid media. It was found 26 lipase producing strains and 105 tannase producing strains. The positive strains were evaluated regarding their capacity to produce lipase and tannase by solid state fermentation. Tannase¿s enzymatic activity was measured by spectrophotometry and lipases¿s enzymatic activity by neutralization titration. Lipase from Colletotrichum sp. strain showed specific activity of 25.97 U/mg; Km= 6.3 %; Vmax= 19.5 U/mg; pH optimum between 6.5 to 7.0 and temperature optimum from 25 °C to 35 °C. Tannase from Aspergillus niger strain presented enzymatic activity of 0.79 U/mL and tannase from Paecilomyces sp. strain reached 2.14 U/mg, pH and temperature optimum of 5.5 and 60 °C, respectively / Mestrado / Ciência de Alimentos / Mestra em Ciência de Alimentos

Orientador: Francisco Maugeri Filho / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos / Made available in DSpace on 2018-08-02T14:49:45Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Kamimura_ElianaSetsuko_D.pdf: 39877702 bytes, checksum: 6e962c13b3c97b540096fbbafbe3c116 (MD5) Previous issue date: 2000 / Resumo: O interesse na produção de lipases microbianas tem aumentado significativamente nas últimas décadas, devido ao seu amplo potencial em aplicações industriais, como aditivos em alimentos (modificação de "flavour"), reagentes industriais (hidrólise de glicerídeos) e detergentes (aditivos), bem como em aplicações no campo da medicina como remédios, digestivos e enzimas para diagnósticos. Então surge a necessidade de métodos de purificação de alta resolução, ou seja, as técnicas cromatográficas. Dentre estas técnicas a cromatografia por afinidade tem despertado grande interesse por proporcionar um alto grau de pureza em uma etapa. Para atingir o objetivo deste trabalho foi realizado a purificação de lipase de Geotrichum sp em coluna cromatográfica por afinidade, modelagem e simulação do processo de adsorção, tendo como etapa inicial o preparo da resina bioespecífica, utilizando o ácido oleico como ligante. A lipase de Geotrichum sp foi produzida em fermentador, utilizando o meio para inóculo e fermentação composto por 5% de água de maceração, 0,5% de nitrato de amônio e 1% de óleo de oliva à temperatura de 30°C, 400 rpm e 1 vvm, fornecendo uma lipase com uma atividade enzimática em torno de 20 U/ml depois de 10 horas de fermentação. A purificação do filtrado do caldo bruto foi feita utilizando o sistema FPLC (Fast Protein Liquid Chromatography) com a coluna cromatográfica por afinidade, que apresentou um fator de purificação de 91,16 vezes superior ao caldo bruto e recuperação na atividade de 19,33%. A puriifcação desta lipase foi foi feita também em troca iônica fornecendo um fator de purificação 4,44 vezes superior ao filtrado do caldo bruto e recuperação de 55,13% na atividade ¿Observação: O resumo, na íntegra poderá ser visualizado no texto completo da tese digital. / Abstract: There is a growing interest on microbiallipases production due to its great potential in industrial applications as food additives, industrial reagents and stain removers, as well as for medical applications. Specially for medical applications high degree of purity is required which is accomplished with high resolution chromatographic techniques. In this work, the purification of lipase from Geotrichum sp was performed in a column packed with an affinity resin. Affinity chromatography is known as very high resolution chromatographic technique. The Response Surface Method (RSM) was chosen to study the column efficiency. This method allows to understanding the interaction among the variables with advantages over conventional methods, which involves changing one variable while fixing others at certain levels. The resin was prepared using EAH sepharose 48 gel (Pharmacia), making it to react with oleic acid as especific ligand. Lipase from Geotrichum sp was produced in a complex medium composed by 5% of com steep liquor, 0.5% ammonium nitrate and 1% olive oil, temperature of 30°C, aeration 1vvm and agitation 400 rpm in a 5 liters fermenter. The lipase activity was about 20 U/ml after 9 hours of fermentation. The purification of lipase was carried out also with an ionic exchange and affinity resins. The purification results were 9.16 fold and a recovery activity of 19.33% for affinity resin and 4.44 fold and activity recovery of 55.13% for the ionic exchange resin ...Note: The complete abstract is available with the full electronic digital thesis or dissertations. / Doutorado / Doutor em Engenharia de Alimentos

Orientador: Maria Isabel Rodrigues / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos / Made available in DSpace on 2018-08-03T14:23:26Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Burkert_JanainaFernandesdeMedeiros_D.pdf: 9150119 bytes, checksum: 05d911513e3637048890ed7ef1eb3867 (MD5) Previous issue date: 2003 / Resumo: O interesse na produção de lipases microbianas tem aumentado significativamente nas últimas décadas, devido ao seu amplo potencial de aplicações industriais, seja na indústria de alimentos como aditivos (modificação de aromas), química fina (síntese de ésteres), detergentes (hidrólise de gorduras), tratamento de efluentes (decomposição e remoção de substâncias oleosas), couro (remoção de lipídios das peles dos animais), farmacêutica e na área médica (remédios, digestivos e enzimas para diagnósticos). A produção de lipase pode ser influenciada por diferentes variáveis, como o microrganismo produtor da enzima, as fontes de carbono, nitrogênio e lipídio, as condições de aeração e agitação, o tipo do impulsor, e até mesmo a geometria do reator. Na primeira etapa deste trabalho foram realizados testes com diferentes indutores (óleo de soja, óleo de milho, óleo de girassol, óleo de canola e óleo de oliva) para produção de lipase utilizando o microrganismo Geotrichum candidum NRRL- Y552, obtendo como melhor indutor o óleo de soja. Em seguida, um estudo para padronização do inóculo foi realizado possibilitando o início da otimização do meio de cultura, em frascos agitados, obtendo como meio otimizado 3,58% de peptona e 0,64% de óleo de soja, com pH inicial de 7,0 a 30°C e 250 rpm, alcançando 16 U/mL em 48 horas de fermentação. Utilizando as condições de produção otimizadas, a enzima foi caracterizada quanto a pH ótimo, temperatura ótima e de estabilidade, a influência de sais minerais na atividade enzimática e a determinação dos parâmetros cinéticos KM e Vmáx. Seqüencialmente, com o meio de cultura otimizado, foi verificada a influência dos impulsores turbina de Rushton, hélice naval e pás inclinadas na produção da lipase em fermentadores de bancada, atingindo em tomo de 25 g/L de biomassa para todos os impulsores e 19 U/mL em 30 horas, 12 U/roL em 30 horas e 22 U/mL em 54 horas, respectivamente, de atividade lipolítica. Utilizando o agitador tipo pás inclinadas foi investigado o efeito clã agitação e aeração no processo fermentativo, sendo obtida as condições de 300 rpm e 1 vvm a 30°C como ótimas para produção da lipase, alcançando aproximadamente 22 U/mL em 54 horas de processo. Ainda foi investigado o efeito de diferentes taxas de aeração em um reator não convencional "air lift" que permitiu obter cerca de 20 U/mL de atividade lipolítica em 30 horas de fermentação, possibilitando nesta geometria de reator uma produtividade 40% maior em relação aos reatores convencionais. Estes resultados para o processo de produção da lipase foram superiores em relação aos relatados na literatura para o mesmo microrganismo / Abstract: The interest in microbial lipase production increased significantly in the last decades, because of the large potential in industrials applications such as: additives in foods (flavor modification), fine chemicals (synthesis of esters), detergents (hydrolysis of fats), waste water treatment (decomposition and removal of oily substances), leather (removal of lipids of animal skins), pharmaceutical and medical areas (remedies, digestives and enzymes for diagnostics). The lipase production can be influenced by different variables such as the microorganism, the carbon sources, nitrogen and lipid, the aeration and agitation conditions, the impeller type, and also including the geometry of the reactor. In the first stage of this work tests was carried out with different inductors (soy oil, com oil, sunflower oil, canola oil and olive oil) for lipase production by Geotrichum candidum NRRL- Y552, getting as the best inductor the soy oil. After that, a study for standardization of inoculum was carried out, making possible the beginning of the optimization of the culture medium, in shaker-flasks, getting as half optimized 3.58% of peptona and 0.64% of soy oil, with initial pH of 7,0, 30°C and 250 rpm that conditions allow reaching 16 U/mL in 48 hours of fermentation. Using the optimized conditions of production, the enzyme was characterized concerning to optimum pH, optimum temperature and stability temperature, the influence of salts in the enzymatic activity and the determination the kinetic parameters KM and Vmáx, Sequentially, with the optimized medium culture, the influence of the impellers it was verified for Rushton turbine, helix naval and pitched blade up in the production of lipase in fermenter, reaching around 25 g/L of biomass for all impellers and 19 U/mL in 30 hours, 12 U/mlL in 30 hours and 22 U/mlL in 54 hours, respectively. Using the impeller type pitched blade up the effect of the agitation and aeration in the of lipase production was investigated, being the optimum conditions 300 rpm and 1 vvm at 30°C for enzyme production, reaching approximately 21 U/mL in 54 hours of fermentation. The effect of different aeration rates in a not conventional reactor air lift was also investigated, resulting in about 20 U/mL of lipolytic activity ín 30 hours of fermentation, making possible to obtain with this geometry of reactor a larger productivity (40% greater ín comparison to the conventional reactors). These results for the process of lipase production are larger than the reported ones in the literature for the same microorganism / Doutorado / Doutor em Engenharia de Alimentos

Orientador: Glaucia Maria Pastore / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos / Made available in DSpace on 2018-08-03T18:25:06Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Koblitz_MariaGabrielaBello_D.pdf: 1821532 bytes, checksum: 8374e5c67da3b6773d2f44dda8e21748 (MD5) Previous issue date: 2003 / Resumo: O presente trabalho teve por objetivo purificar e caracterizar a fração lipolítica produzida por linhagem de Rhizopus sp. e aplicar a lipase na produção de monoacilgliceróis. Apenas três etapas de purificação foram necessárias para se atingir a homogeneidade em SDS-PAGE, obtendo-se uma banda com massa molecular de 37,5KDa e atividade específica de l446U/mg de proteína. A fração purificada continha 2 isoformas da lipase, ambas com temperatura ótima de atividade de 50°C, valores para pH ótimos de 5,6 e 7,0, pH de 4,3 e 4,5 e estabilidade a valores de pH entre 6,5 e 7,5 e a temperaturas inferiores a 50°C, além de manter sua atividade em hexano. A lipase foi inativada por Hg+2 e por n-bromosuccinimida e ativada por Na+. Os estudos de purificação por diferentes métodos cromatográficos mostraram que, embora a lipase seja mais seletivamente retida por coluna de troca aniônica, ela perde parte de sua atividade no processo, o que não acontece em colunas de interação hidrofóbica. A lipase purificada por coluna de FENIL Sepharose apresentou faixa mais larga de pH de atividade, podendo variar entre 3,5 e 9,0, dependendo da temperatura de reação, porém menor estabilidade térmica do que a fração purificada por DEAE Sepharose. Entre os métodos testados, a síntese se mostrou mais promissora para obtenção de monoacilgliceróis. Após planejamento estatístico multivariável verificou-se que a remoção de água do meio reacional é fator preponderante para conversão e que a enzima testada utiliza tanto glicerol quanto monoacilgliceróis como substratos para síntese, o que torna indispensável a separação do produto do meio reacional para obtenção de taxas de conversão satisfatórias / Abstract: The aim of the present study was the purification and characterization of the lipolytic fraction secreted by a strain of Rhizopus sp. and to apply this lipase to the production of monoacylglycerols. On1y 3 steps of purification were necessary to achieve SDS-PAGE homogeneity. One band with 37.5 KDa molecular mass and with 1446 U/mg specific activity was obtained. The purified fraction presented 2 lipase isoforms; both showed optimum activity at 50°C, but at pH values of 5.6 and 7.0 and isoelectric points of 4.3 and 4.5. The lipase was stable between 6.5 and 7.5 pH values and at temperatures below 50°C and also kept its activity in hexane. The lipase was inactivated by Hg+2 and by n-bromosuccinimide and activated by Na+. The studies on purification by different chromatographic methods showed that, although the lipase is more selectively retained by the anionic exchange column, it loses part of its activity in the process, which does not happen in the hydrophobic interaction column. The lipase purified by the PHENYL Sepharose column showed activity in a larger pH range, that could vary from 3.5 to 9.0 depending on the reaction temperature, but also showed lower thermal stability when compared to the fraction purified by DEAE Sepharose column. Among the methods tested, the synthesis seemed to be the most promising for the production of monoacylglycerols. After the experimental design assays it could be verified that water removal from the reaction medium is a preponderant factor for the conversion and that the enzyme tested uses glycerol but also monoacylglycerol as synthesis substrate, what makes the separation of the product from the reaction medium indispensible for obtaining satisfactory conversion rates / Doutorado / Doutor em Ciência de Alimentos

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Helicoverpa armigera et Epiphyas postvittana, deux insectes nuisibles pour l'agriculture, ont développé des résistances contre la plupart des insecticides connus. Les lipides étant les constituants majeurs de leur régime alimentaire, les fonctions digestives des lipases deviennent alors une cible privilégiée pour l'élaboration de nouveaux insecticides. L'identification récente de gènes codant pour l'expression de protéines potentiellement actives et inactives apparentées aux lipases pancréatiques (PLRP) dans le tractus digestif de ces deux insectes et dont le niveau de transcription varie en fonction de leur régime alimentaire a ouvert un nouveau champ de recherche. Dans le but de contribuer à cette thématique, nous avons construit cinq lipases recombinantes d'E. postvittana (EpLIPs) et testé leur expression dans trois systèmes différents (E.coli, P.pastoris et bacculovirus). Le tractus digestif de Helicoverpa armigera a été étudié par chromatographie échangeuse d'ions et les différentes protéines séparées ont été testées en spectrométrie de masse et sur pHstat pour l'activité. Les résultats obtenus ont permis de mettre en évidence, pour la première fois, la présence à la fois d'une lipase active et d'une lipase inactive dans le tractus digestif d'un lépidoptère. Par ailleurs, la caractérisation biochimique d'un mutant GPLRP2-Δ β9 a été faite dans le but de comprendre l'effet de cette boucle, partiellement délétée dans les lipases d'insectes, dans la spécificité du substrat. Nous avons pu montrer que cette boucle β9 est essentielle pour la stabilisation de la chaîne acyle durant la réaction de lipolyse. / Helicoverpa armigera and Epiphyas postvittana, two major pest crops, have developed resistances against most of the known insecticides. Lipids being a major component of insect diet, digestive function of lipase are a target of choice for new insecticide design. The recent identification of active and inactive pancreatic lipase related protein (PLRP) genes in those two insects midgut, with a level of transcription depending on the diet, opened the field of insect digestive lipase study. In order to contribute to this thematic, we built five recombinants lipase from E. postvittana (EpLIPs) and tested their expression in three different systems (E.coli, P.pastoris and bacculovirus). Protein structure prediction of EpLIPs allowed us to develop some functional hypothesis enlightening the role of inactive lipase in lipid transport. H. armigera midgut contents were separated through a one step purification chromatography and the different fractions were tested for activity and mass spectrometry. The results obtained gave the first evidence of the presence of both an active and an inactive lipase in lepidopteran midgut. In addition to this work, a biochemical characterisation of a β9 GPLRP2 mutant was carried out to understand the effect of this loop, partially deleted in insect lipase, in substrate specificity. The result shows that β9 loop is essential for stabilizing the leaving acyl chain during the lipolysis reaction.

Orientador: Humberto Márcio Santos Milagre / Resumo: A grande relevância dos β-amino-α-hidroxiácidos quirais na Síntese Orgânica é estabelecida pela presença destes compostos na estrutura de fármacos de importância primária para a sociedade. Como principais exemplos, podem-se citar os medicamentos envolvendo taxanos, uma classe de diterpenos largamente utilizada como agentes antineoplásicos para tratamento de diversos tipos de câncer. Visando a proposição de uma rota sintética eficiente e estereosseletiva para esses blocos construtores, as reações de epoxidação de alcenos (reação de Prilezhaev) como o trans-cinamato de etila e derivados foram escolhidas como alternativa. Na primeira etapa do trabalho, testamos duas metodologias, uma química e outra biocatalítica, para o trans-cinamato de metila. Enquanto a primeira metodologia resultou em conversão completa ao epóxido em 5 horas, o sistema biocatalítico apresentou uma cinética bastante lenta e com formação de produtos laterais. Para a segunda etapa, a execução da rota sintética racêmica partindo do ácido trans-cinâmico foi realizada em quatro etapas: i) esterificação do ácido trans-cinâmico 3 para a trans-cinamato de etila 4, ii) epoxidação de 4 para o 3-fenil-1-glicidato de etila 5, iii) abertura do epóxido e síntese da oxazolina utilizando benzonitrila, resultando no 3,4-difenil-4-oxazolina-2-carboxilato de etila 6 e, por fim, iv) abertura de 6 em meio ácido para obtenção do 3-fenil-2-hidroxi-3-benzamido propianato de etila 7. A caracterização completa dos produtos de cada et... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Chiral β-amino-α-hydroxyacids have a great relevance in the field of Organic Synthesis, primarily because of their role as building blocks for the production of anticancer drugs. The most remarkable example figures in formulations containing taxane derivatives, a class of diterpenes used as antineoplasic drugs for the treatment of solid tumors. In this work, we aim for an efficient and stereoselective synthetic route for chiral β-amino-α-hydroxyacids and we chose the epoxidation of alkenes (Prilezhaev reaction), such as trans-ethyl cinnamate and its derivatives, as an alternative. In the first part, we tested two epoxidation methodologies for trans-methyl cinnamate: a chemical one, that gave us to total conversion in 5 hours of reaction, and a biocatalytic one, that we observed only 2% conversion in 72 hours, with the formation of byproducts. For the second part, we completely executed the synthetic route with four steps, starting from trans-cinnamic acid: i) esterification of trans-cinnamic acid 3 to trans-ethyl cinnamate 4, ii) epoxidation of 4 to ethyl 3-phenyl-1-glicidate 5, iii) epoxide opening with benzonitrile to yield the oxazoline 6 and iv) oxazoline opening in acid media to reach the β-amino-α-hydroxyester 7. The products of each step were successfully characterized. In the final part, two chiral biocatalytic epoxidation methods were tested utilizing trans-ethyl cinnamate as model substrate. We used a chemoenzymatic system consisting of a lipase, UHP and N-benzyl-L-... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Orientador: Paulo César de Jesus. / Dissertação (mestrado) - Universidade Regional de Blumenau, Centro de Ciências Exatas e Naturais, Programa de Pós-Graduação em Química.

Orientador: Paulo Cesar de Jesus. / Dissertação (mestrado) - Universidade Regional de Blumenau, Centro de Ciências Exatas e Naturais, Programa de Pós-Graduação em Química.