Neste trabalho, foi estudada a transesterificação enzimática do óleo de soja com álcool catalisada por lipase comercial imobilizada. Inicialmente foram investigados os efeitos da temperatura, do tipo de enzima (Novozym 435, Lipozyme RM-IM e Lipozyme TL-IM) e do tipo de álcool (etanol ou butanol) na síntese de biodiesel utilizando óleo de soja refinado. A melhor temperatura observada para as reações empregando Lipozyme TL IM e Lipozyme RM IM foi de 50C, enquanto que para a Novozym 435, a temperatura ótima foi de 70C. O maior teor em biodiesel (~60%) foi obtido na etanólise do óleo de soja a 70C utilizando Novozym 435 a 5% m/m. Também foi avaliada a síntese de biodiesel por via enzimática a partir da etanólise de óleos ácidos com índice de acidez (IA) (de 8,5, 54,4 e 93,7). A conversão do ácido graxo livre foi superior a 90% nas reações conduzidas com Novozym 435 nas reações com os três óleos ácidos testados. O teor em biodiesel foi próximo a 50% na etanólise do óleo de soja com índice de acidez de 8,5 empregando Lipozyme TL IM, porém para índices de acidez maiores este rendimento diminuiu. Para as reações conduzidas com Lipozyme RM-IM, o teor em biodiesel manteve-se em torno de 30% para todos os óleos ácidos investigados. A etanólise do óleo de soja refinado empregando reator de leito fixo em modo contínuo, a 50C, foi investigada variando a velocidade espacial dos reagentes (0,255 e 0,508 h-1), o tipo de lipase (Novozym 435, Lipozyme RM-IM e Lipozyme TL-IM) e a possibilidade de reuso do biocatalisador após lavagem com butanol. Na reação com Novozym 435, o teor em biodiesel foi de aproximadamente 50% e se manteve estável durante 4,5 h para as duas velocidades espaciais testadas. A lipase Lipozyme TL-IM apresentou teor em biodiesel maior do que o obtido nas reações com os outros biocatalisadores (~80%), porém não apresentou a mesma estabilidade. Foi observada uma queda significativa na produção de biodiesel nas reações empregando o reuso do biocatalisador / In this work, the enzymatic transesterification of soybean oil with alcohol catalyzed by commercial immobilized lipase was studied. Initially the effects of temperature, type of enzyme (Novozym 435, Lipozyme RM-IM and Lipozyme TL-IM) and the type of alcohol (ethanol or butanol) in the synthesis of biodiesel using refined soybean oil were investigated. The best temperature observed for reactions employed Lipozyme TL-IM and Lipozyme RM-IM was 50C, while that for Novozym 435, the optimal temperature was 70C. The major biodiesel content (~60%) was obtained in the ethanolysis of soybean oil at 70C using 5% (w/w) of Novozym 435. It was also evaluated the enzymatic synthesis of biodiesel from the ethanolysis of acid oils with acidity index (AI) (8,5, 54,4 and 93,7). The conversion of free fatty acid was higher than 90% in reactions conducted with Novozym 435 in reactions with the three acid oils tested. The biodiesel content was close to 50% in ethanolysis of soybean oil with acidity index of 8,5 employing Lipozyme TL-IM, however for higher acidity indexes this yield decreased. For the reactions conducted with Lipozyme RM-IM, the biodiesel content remained around 30% for all acid oils investigated. The ethanolysis of refined soybean oil employing fixed bed reactor in continuous mode at 50C was investigated by varying the space velocity of reagents (0,255 and 0,508 h-1), the type of lipase (Novozym 435, Lipozyme RM-IM and Lipozyme TL-IM) and the possibility of reuse of the biocatalyst after washing with butanol. In the reaction with Novozym 435, the biodiesel content was approximately 50% and remained stable during 4,5 h for the two space velocity tested. The lipase Lipozyme TL-IM presented biodiesel content higher than that obtained in reactions with other biocatalysts (~80 %), but did not show the same stability. It was observed a significant decrease in the biodiesel production in the reactions employing reuse of the biocatalyst

A transferência de oxigênio é um fator limitante para grande parte dos cultivos em biorreatores que operam com organismos estritamente aeróbios devido à baixa solubilidade do oxigênio em meios de cultivo. A introdução de meios não convencionais, como polidimetilsiloxanos (PDMS), em biorreatores pode ser vista como uma melhoria para o ajuste desses processos. Este trabalho propõe uma investigação do emprego de polidimetilsiloxano fluido e emulsificado, usados como carreadores de oxigênio, em meios de cultivo na produção de lipases de Staphylococcus warneri EX17, cepa capaz de utilizar glicerol residual como substrato, visando melhorar a disponibilidade de oxigênio e aperfeiçoar a produtividade. Inicialmente, foram realizados estudos para selecionar o uso de glicerol residual, oriundo da síntese química de biodiesel como fonte de carbono. A atividade lipolítica foi semelhante com glicerol comercial e residual. Após a seleção do glicerol foram realizados experimentos em incubadora rotatória horizontal nas condições previamente otimizadas em trabalhos anteriores do grupo, adicionando PDMS. Dois tipos de PDMS foram testados, fluido e emulsificado. A produção de lipase foi significativamente maior no meio contendo PDMS. Assim, ferramentas de planejamento experimental, delineamento composto central (DCC) foram utilizadas para verificar a influencia do PDMS no coeficiente de transferência de oxigênio kLa em meio de cultivo produtor de lipase livre de células. O kLa aumentou significativamente no meio de cultivo contendo PDMS. Dois novos planejamentos foram desenhados, para otimizar a produção de lipase em meio de cultivo com células. Um para PDMS fluido e outro para PDMS emulsificado. No meio contendo PDMS fluido, a atividade lipolítica foi cinco vezes maior, enquanto que no meio contendo silicone emulsificado a atividade lipolítica foi três vezes maior. Este estudo demonstrou que a lipase de S. warneri EX17 pode ser produzida utilizando glicerol residual como fonte de carbono, e polidimetilsiloxanos como carreadores de oxigênio aumentando a transferência de oxigênio no meio e elevando a produção da enzima, que apresenta diversas possibilidades de aplicação, principalmente na indústria de alimentos. / The oxygen transfer is a limiting factor in many bioreactors cultivations, in which strictly aerobic organisms are grown due to the low solubility of oxygen in culture media. The introduction of unconventional media, such as polydimethylsiloxanes (PDMS) in bioreactors can be seen as a potential improvement for these processes. This work proposes an investigation of the use of polydimethylsiloxane in its two forms, fluid and emulsified, used as carriers of oxygen in culture media for the lipase production of Staphylococcus warneri EX17, strain capable of using glycerol as substrate, to improve the oxygen availability and improve enzyme productivity. Initially, studies were performed to select the use of residual glycerol, derived from the chemical synthesis of biodiesel as a source of carbon. The lipase activity was similar in both commercial and residual glycerol. Experiments were performed on orbital shaker, using conditions previously optimized in another work of the group, but with the addition of PDMS. Two types of PDMS were tested, the fluid and the emulsified. The lipase production was significantly higher in medium containing PDMS. Experimental design and central composite design (CCD) were used to evaluate the influence of PDMS on the oxygen transfer coefficient kLa in culture medium free of lipase-producing cells. The kLa increased significantly in the medium containing PDMS. Two new experimental plannings were designed to optimize the production of lipase in culture medium with cells. In the medium containing the PDMS fluid lipase activity was five times higher than medium without the oxygen carrier, while in the medium containing the emulsified silicone lipase activity was three times higher. This study showed that the lipase from S. warneri EX17 can be produced using residual glycerol as carbon source and that polydimethylsiloxanes works as interesting carrier of oxygen by increasing oxygen transfer rates, improving enzyme production, which has several possible applications, especially in the food industry.

Neste trabalho, foi estudada a transesterificação enzimática do óleo de soja com álcool catalisada por lipase comercial imobilizada. Inicialmente foram investigados os efeitos da temperatura, do tipo de enzima (Novozym 435, Lipozyme RM-IM e Lipozyme TL-IM) e do tipo de álcool (etanol ou butanol) na síntese de biodiesel utilizando óleo de soja refinado. A melhor temperatura observada para as reações empregando Lipozyme TL IM e Lipozyme RM IM foi de 50C, enquanto que para a Novozym 435, a temperatura ótima foi de 70C. O maior teor em biodiesel (~60%) foi obtido na etanólise do óleo de soja a 70C utilizando Novozym 435 a 5% m/m. Também foi avaliada a síntese de biodiesel por via enzimática a partir da etanólise de óleos ácidos com índice de acidez (IA) (de 8,5, 54,4 e 93,7). A conversão do ácido graxo livre foi superior a 90% nas reações conduzidas com Novozym 435 nas reações com os três óleos ácidos testados. O teor em biodiesel foi próximo a 50% na etanólise do óleo de soja com índice de acidez de 8,5 empregando Lipozyme TL IM, porém para índices de acidez maiores este rendimento diminuiu. Para as reações conduzidas com Lipozyme RM-IM, o teor em biodiesel manteve-se em torno de 30% para todos os óleos ácidos investigados. A etanólise do óleo de soja refinado empregando reator de leito fixo em modo contínuo, a 50C, foi investigada variando a velocidade espacial dos reagentes (0,255 e 0,508 h-1), o tipo de lipase (Novozym 435, Lipozyme RM-IM e Lipozyme TL-IM) e a possibilidade de reuso do biocatalisador após lavagem com butanol. Na reação com Novozym 435, o teor em biodiesel foi de aproximadamente 50% e se manteve estável durante 4,5 h para as duas velocidades espaciais testadas. A lipase Lipozyme TL-IM apresentou teor em biodiesel maior do que o obtido nas reações com os outros biocatalisadores (~80%), porém não apresentou a mesma estabilidade. Foi observada uma queda significativa na produção de biodiesel nas reações empregando o reuso do biocatalisador / In this work, the enzymatic transesterification of soybean oil with alcohol catalyzed by commercial immobilized lipase was studied. Initially the effects of temperature, type of enzyme (Novozym 435, Lipozyme RM-IM and Lipozyme TL-IM) and the type of alcohol (ethanol or butanol) in the synthesis of biodiesel using refined soybean oil were investigated. The best temperature observed for reactions employed Lipozyme TL-IM and Lipozyme RM-IM was 50C, while that for Novozym 435, the optimal temperature was 70C. The major biodiesel content (~60%) was obtained in the ethanolysis of soybean oil at 70C using 5% (w/w) of Novozym 435. It was also evaluated the enzymatic synthesis of biodiesel from the ethanolysis of acid oils with acidity index (AI) (8,5, 54,4 and 93,7). The conversion of free fatty acid was higher than 90% in reactions conducted with Novozym 435 in reactions with the three acid oils tested. The biodiesel content was close to 50% in ethanolysis of soybean oil with acidity index of 8,5 employing Lipozyme TL-IM, however for higher acidity indexes this yield decreased. For the reactions conducted with Lipozyme RM-IM, the biodiesel content remained around 30% for all acid oils investigated. The ethanolysis of refined soybean oil employing fixed bed reactor in continuous mode at 50C was investigated by varying the space velocity of reagents (0,255 and 0,508 h-1), the type of lipase (Novozym 435, Lipozyme RM-IM and Lipozyme TL-IM) and the possibility of reuse of the biocatalyst after washing with butanol. In the reaction with Novozym 435, the biodiesel content was approximately 50% and remained stable during 4,5 h for the two space velocity tested. The lipase Lipozyme TL-IM presented biodiesel content higher than that obtained in reactions with other biocatalysts (~80 %), but did not show the same stability. It was observed a significant decrease in the biodiesel production in the reactions employing reuse of the biocatalyst

Estudos vem mostrando resultados promissores na utilização da tecnologia de ultrassom para a produção enzimática de biodiesel. Estes são atribuídos ao fenômeno de cavitação gerado pelo equipamento de ultrassom, o qual promove um aumento da miscibilidade entre os reagentes, melhorando a transferência de massa e a taxa da reação, proporcionando reações mais rápidas, bem como um menor consumo de reagentes. Sendo assim, o objetivo deste trabalho foi otimizar as condições da reação de transesterificação do óleo de soja para a produção de biodiesel, utilizando o conceito de combi-lipase em um reator enzimático assistido por ultrassom. Foram otimizadas as condições do sistema de ultrassom: amplitude (30-70 %), pulso (30-70 %) e tempo de pulso (5-15 s), através de um delineamento composto central rotacional (DCCR). Os parâmetros reacionais: concentração de biocatalisador (5, 15 e 25 % em relação a massa de óleo) e razão molar do substrato (3:1, 6:1 e 9:1) foram estudados, assim como a influência do uso do solvente terc-butanol e de um sistema de agitação combinado ao ultrassom, na conversão de ésteres etílicos. Avaliou-se também a eficiência do combi-lipase (75 % Novozym 435 + 10 % Lipozyme TL-IM and 15 % Lipozyme RM-IM) frente ao uso dos biocatalisadores individualmente. Obteve-se como condições ótimas para o sistema de ultrassom: 30 % de amplitude, 50 % de pulso e 15 s de tempo de pulso, 15 % de enzima em relação a massa de óleo e uma razão molar de 3:1 etanol:óleo de soja Os rendimentos de conversão de ésteres etílicos na ausência do solvente terc-butanol foram similares aos resultados obtidos na presença deste reagente, sugerindo que a tecnologia de ultrassom é capaz de eliminar a necessidade do uso de solventes em reações de transesterificação enzimática. Entretanto, o uso combinado de um sistema de agitação com o ultrassom, reduziu o rendimento da reação. Em relação às enzimas, o combi-lipase mostrou melhores resultados para a síntese enzimática de ésteres etílicos, do que o uso das enzimas individualmente. Utilizando as condições ótimas avaliadas neste estudo e o conceito de combi-lipase em um reator assistido por ultrassom, obteve-se uma conversão de ésteres etílicos de aproximadamente 75 % em 5 horas de reação. / Studies have been showing promising results for the use of ultrasonic technology in enzymatic production of biodiesel, which are attributed to the cavitation phenomenon generated by the ultrasound equipment, that promotes increased miscibility between the reactants, improving mass transfer and reaction rate, providing faster reactions as well as a lower consumption of reagents. The aim of this work was to optimize ultrasonic (amplitude, pulse and time pulse) and reaction (molar ratio and enzyme concentration) parameters, as well as the influence of solvent (tert-butanol) and ultrasound combined with mechanical stirring, on the transesterification of soybean oil catalyzed by combi-lipase biocatalyst. It was also evaluated the efficiency of the combi-lipase (75 % Novozym 435 + 10 % Lipozyme TL-IM and 15 % Lipozyme RM-IM), compared to individual lipases. The optimum conditions for transesterification reaction, were observed being: enzyme concentration, 15 % (by oil mass); ethanol:oil molar ratio, 3:1; ultrasonic amplitude 30 %, pulse, 30 % and time pulse, 15 s. The yields of conversion of ethyl esters with and without solvent were very similar, indicating that ultrasonic technology is able to supply the need of solvents in enzymatic transesterification reactions. The combined use of a mechanical stirring system with ultrasound, reduced the yields of conversion of this reaction, while the combi-lipase showed better results than the use of individual lipases for soybean oil transesterification. Using the optimum conditions evaluated in this study and the concept of combi-lipase in an ultrasonic-assisted batch reactor, led to conversions of ethyl esters of about 75% in 5 hours.

Conselho Nacional de Desenvolvimento CientÃfico e TecnolÃgico / Lipases, triacilglicerol Ãster hidrolases E.C. 3.1.1.3, sÃo enziÂmas que atuam nas ligaÃÃes Ãsteres de triacilglicerÃis, liberando Ãcidos orgÃnicos e glicerol. Podendo, em condiÃÃes microaquosas, catalisar a reaÃÃo reversa. Uma limitaÃÃo da utilizaÃÃo destas enzimas em processos industriais reside na falta de estabilidade operacional e na impossibilidade de sua reutilizaÃÃo na forma livre. O uso do sistema de organo-gÃis consiste em uma alternativa para a imobilizaÃÃo de enzimas, e para sua utilizaÃÃo na catÃlise enzimÃtica em meio orgÃnico. Neste sistema a enzima està localizada no centro micelar (centro aquoso) do organo-gel, eliminando o problemas como de estabilizar a enzima contra inativaÃÃo por um solvente nÃo-aquoso. O objetivo deste trabalho foi desenvolver derivados de lipases de Rhizomucor miehei imobilizadas em organo-gÃis à base de polÃmeros, visando à sÃntese de Ãsteres etÃlicos a partir de reaÃÃes de esterificaÃÃo de matÃrias-primas com elevado teor de Ãcidos graxos livres. Os suportes foram obtidos atravÃs de diferentes combinaÃÃes entre os componentes. Utilizaram-se polÃmeros gelatina (Gel), alginato (Alg) ou quitosana (Qui), fases orgÃnicas hexano (Hex) ou heptano (Hep) e os tensoativos dodecilsulfato de sÃdio (SDS) ou brometo de acetilmetilamÃnio (CTABr). Verificou-se a estabilidade tÃrmica da enzima na sua forma livre, determinando seu tempo de meia-vida. Na primeira etapa, foram produzidos derivados com e sem ativaÃÃo via glutaraldeÃdo 2% (v/v). A atividade enzimÃtica foi avaliada atravÃs hidrÃlise do p-nitrofenilbutirato (pNPB). Os derivados foram caracterizados quanto: fator de estabilidade a 60ÂC em relaÃÃo à enzima livre, eficiÃncia e rendimento de imobilizaÃÃo para assim determinar os melhores biocatalisadores. Dentre os catalisadores obtidos, os melhores apresentaram eficiÃncia de 4,1% e fator de estabilidade 30 vezes (Gel/SDS/Hex), eficiÃncia de 6,0% e fator de estabilidade 1,3 vezes (Alg/SDS/Hep) e eficiÃncia de 1,0% e fator de estabilidade de 2,3 vezes (Qui/SDS/Hep). Os suportes produzidos ativados com glutaraldeÃdo 2% (v/v) apresentaram baixas atividades e eficiÃncias, apesar de obterem valores bons de tempo de meia-vida e fator de estabilidade. Os derivados produzidos com o tensoativo CTABr apresentaram baixas atividades, eficiÃncias, tempo de meia-vida e fator de estabilidade. Na segunda fase, os derivados selecionados foram estudados quanto à carga mÃxima (50 U.g-1 a 500 U.g-1) de imobilizaÃÃo e eficiÃncia, nas temperaturas de 15ÂC e 25ÂC. Avaliou-se a aplicaÃÃo dos biocatalisadores na reaÃÃo de esterificaÃÃo do oleato de etila a partir de Ãcido oleico e etanol, variando a razÃo molar Ãcido/Ãlcool e utilizaÃÃo de agente dessecante (zeÃlitas). Verificou-se a estabilidade de estocagem sob 10ÂC por um perÃodo de 100 dias. Todos os derivados apresentaram melhores eficiÃncias utilizando carga de 50 U.g-1, apresentando valores de 4,2% e 4,8% (Gel/SDS/Hex), 2,0% e 2,3% (Alg/SDS/Hep) e 0,9% e 1,1% (Qui/SDS/Hep ) nas temperaturas de 15ÂC e 25ÂC, respectivamente. Nas reaÃÃes de esterificaÃÃo os derivados Gel/SDS/Hex e Alg/SDS/Hep obtiveram maiores conversÃes na razÃo molar Ãcido/Ãlcool 1:10, 72,9% e 16,9%, respectivamente. O derivado Qui/SDS/Hep obteve 80,0% de conversÃo na razÃo de 1:1. Com utilizaÃÃo de zeÃlitas o derivado Gel/SDS/Hex aumentou a conversÃo para 79,0% nas razÃes 1:1 e 1:5, os derivados Alg/SDS/Hep e Qui/SDS/Hep apresentaram decrÃscimo nas conversÃes. Durante os 100 dias de estocagem sob 10ÂC, os derivados Gel/SDS/Hex e Qui/SDS/Hep mantiveram atividade hidrolÃtica atà 40 dias, tendo um decrÃscimo ao longo do tempo. O derivado Alg/SDS/Hep obteve um tempo maior de 60 dias, apresentando tambÃm um decrÃscimo. / Lipases, triacylglycerol ester hydrolases EC 3.1.1.3, are enzymes that act on ester bonds of triacylglycerols, releasing organic acids and glycerol. May in microaquosas conditions, catalyze the reverse reaction. A limitation of using these enzymes in industrial processes is the lack of operational stability and the inability to re-use the free form. The use of organo-gels system is an alternative for the immobilization of enzymes and to their use in enzyme catalysis in organic media. In this system the enzyme is located in the micelle center (aqueous center) of the organo-gel, eliminating problems such as stabilizing the enzyme against inactivation by a non-aqueous solvent. The aim of this work was immobilize lipases from Rhizomucor miehei into organo - gels based on polymers for future application in ethyl esters synthesis through esterification of raw materials with high free fatty acids content. Supports were obtained using different combinations of components. It was used gelatin polymers (Gel), alginate (Alg) and / or chitosan (Chi), organic phases such as hexane (Hex) and heptane (Hep) and surfactants sodium dodecyl sulfate (SDS) or acetylmetylamonium bromide (CTABr). In the first step, derivatives were produced with and without glutaraldehyde 2% (v/v) activation. Enzymatic activity was measured by hydrolysis of p â nitrophenyl butyrate (PNPb). Biocatalysts were characterized as: stability at 60  C and compared to free enzyme, immobilization efficiency and yield factor, thus determining the best biocatalysts. Among the catalysts obtained, (Gel/SDS/Hex) showed the best efficiency of 4.1% , 30 âfold more stable; (Alg/SDS/Hep) with 6.0% efficiency , 1.3 âfold more stable and (Qui/SDS/Hep) with efficiency of 1.0 % , 1.3 âfold more stable than free lipase. Obtained supports activated with glutaraldehyde 2 % (v/v) showed lower activities and efficiencies, in despite of having good values for stability factor. Produced derivatives using surfactant CTABr presented low activity, efficiency and stability factor. In the second step, derivatives were analyzed as maximum load (50 U.g-1 a 500 U.g-1) enzyme immobilization and efficiency at 15  C and 25  C. It was evaluated biocatalysts application in ethyl oleate achievement in an esterification reaction, using oleic acid and ethanol, by varying molar ratio acid / alcohol with and without using of desiccant agent (zeolite) at 37  C and 24 h of reaction. Derivatives were submitted storage stability under 10  C studies, for a period of 100 days. All derivatives showed higher efficiencies using an initial enzyme loading of 50 U.g -1, with values of 4.2% and 4.8% (Gel/SDS/Hex), 2.0 % and 2.3 % (Alg/SDS/ Hep) and 0.9 % to 1.1% (Qui/SDS/Hep) at 15  C and 25  C, respectively. In esterification reactions, Gel/SDS/Hex and Alg/SDS/Hep derivatives showed higher conversions 72.9 % and 16.9 %, respectively, with molar acid / alcohol 1:10. The chemical derivative Qui/SDS/Hep presented 80.0 % conversion with molar acid / alcohol 1:1 ratio. Using zeolites, Gel/SDS/Hex conversion increased to 79.0 % using ratios of 1:1 and 1:5, the Alg/SDS/Hep and Qui/SDS/Hep presented a decreasing in conversions. During 100 days of storage at 10  C, Gel/SDS/Hex and Qui/SDS/Hep hydrolytic activity maintained up to 40 days and a decreasing during this period, however, Alg/SDS/ Hep achieved more than 60 days with activity.

Esta tese é composta de estudos realizados com a finalidade de encontrar condições experimentais e gerar informações confiáveis que possam ser utilizadas em síntese de peptídeos mediada por lipases. Inicialmente, foram caracterizadas por eletroforese do tipo PAGE-SDS e medida de atividade em óleo de oliva duas lipases purificadas de Candida cylindracea (CCL) e duas pancreáticas suínas, purificada (pPPL) e bruta (cPPL). As CCLs apresentaram atividades lipásicas e graus de purezas superiores às PPLs. Dentre os contaminantes das PPLs, foram identificadas a tripsina e a α-quimotripsina (α-QT). Em seguida, foi realizado um estudo sistemático da síntese do dipeptídeo modelo Ac-Tyr-Gly-NH2. A melhor condição experimental encontrada foi: mistura de n-hexano/tampão Tris-HCl, 0,5M, pH 8,0, (80/20,v/v), 50mg/mL de cPPL, 0,05M de Ac-Tyr-OEt, 0,5M de Gly¬NH2, 37°C e agitação de 300 rpm, que forneceu rendimento de ~90 % em 5 min de reação. Porém, nesta condição foi observada a hidrólise secundária do produto formado, a qual foi extinta pelo tratamento da cPPL com um inibidor específico de α-QT. A condição otimizada de síntese de Ac-Tyr-Gly-NH2 também se mostrou adequada à preparação de Z¬Asp-Gly-NH2 a partir de Z-Asp-OMe e de Gly-NH2. Quando se estudou a influência da percentagem de n-hexano na eficiência da formação de ligação peptídica, ela também foi a melhor condição. Tendo escolhido a lipase e o meio reacional, iniciou-se um estudo sistemático da hidrólise do éster de onze Z-aminoácidos-OMe, o qual visou gerar informações que possibilitassem prever quais aminoácidos deveriam compor o doador de acila esterificado a ser empregado em síntese de peptídeos catalisada por cPPL. A ordem de preferência desta preparação enzimática na hidrólise de ésteres dos Z-aminoácidos-OMe testados foi a seguinte: (Lys, Arg e His)>(Phe e Tyr)>(Asp, Glu, Gln, Ser, Thr e Leu). Também foi estudada a influência da natureza do éster e do protetor de grupo α-amino na hidrólise de ésteres de Nα-acil-Asp ou -Glu. A cPPL preferiu hidrolisar o éster benzílico de Z ou Boc-Asp e de Z-Glu. Em algumas incubações para a hidrólise do éster de Z-aminoácidos-OMe foi observada uma reação secundária com possível aplicação na química de peptídeos: a remoção do grupo Z com formação do aminoácido livre correspondente. Esta ocorreu mesmo quando a tripsina e a α-QT foram inibidas irreversivelmente. Assim, Z-aminoácidos foram incubados com a cPPL e os resultados obtidos demonstraram que ela foi capaz de remover o grupo Z de onze deles com velocidades iniciais que obedecem a seguinte ordem: Tyr>Phe>Ser>Gln>Lys>His>Trp>Leu>Met>Arg>Ile. A remoção em questão também foi observada quando o dipeptídeo Z-Gly-Phe foi incubado em presença de cPPL. A formação de glicina no meio reacional decorreu da hidrólise da ligação peptídica. Sumarizando, as contribuições mais relevantes deste trabalho são: 1) a proposição inédita de um sistema bifásico para a formação da ligação peptídica catalisada por cPPL; 2) a demonstração inequívoca da presença de tripsina e α-QT e a sugestão de contaminação por carboxipeptidase A na cPPL. Estes contaminantes podem contribuir para a eficiência das sínteses de peptídeos catalisadas por esta preparação enzimática; 3) a constatação de que apesar de mais impura, a cPPL catalisou mais eficientemente do que as CCLs a formação de ligação peptídica via aminólise de ésteres; 4) a obtenção de resultados de um estudo sistemático de hidrólise de ésteres de Z-aminoácidos que podem auxiliar na escolha de doadores de acila a serem usados em sínteses de peptídeos catalisadas por cPPL; 5) a observação inédita de remoção do grupo Z de alguns Z-aminoácidos em presença de cPPL que indicou a possibilidade de novas aplicações desta preparação enzimática em química de peptídeos e, provavelmente, em síntese orgânica. / This work aimed to determine experimental conditions and reliable information to be used in peptide synthesis mediated by lipases. Thus, two Candida cylindracea lipases (CCL) and two porcine pancreatic lipases, a purified (pPPL) and a crude (cPPL), were characterized by PAGE-SDS electrophoresis and activity in olive oil. CCLs presented higher purities and enzymatic activities than PPLs. Trypsin (T) and α-chymotrypsin (α¬CT) were identified among the cPPL contaminants. A systematic investigation of Ac-Tyr¬Gly-NH2 was then performed using the CCLs, the PPLs and several experimental conditions. The best combination was: 0.05M Ac-Tyr-OEt, 0.5M Gly-NH2, 50mg/mL cPPL, mixture of n-hexane/Tris-HCl buffer 0.5M, pH 8.0, (80/20,v/v), temperature of 37176;C, shaking at 300 rpm (yield near 90% in 5 min of reaction). As secondary hydrolysis occurred in long-lasting reactions, cPPL was treated with the irreversible inhibitor of α-CT and had the amidase activity extinguished. The optimized synthesis conditions were also suitable for the preparation of Z-Asp-Gly-NH2. When the effect of the n-hexane content on coupling efficiency was examined, those were confirmed as the best conditions to be used. A further systematic investigation aiming to determine which esterified Nα-acyl-amino acids are good substrates for cPPL was then conducted using Z-amino acids-OMe. The results obtained in the monitoring of the ester hydrolysis indicated the following preference: (Z-Lys-OMe, -Arg-, -His-)>(Z-Phe-OMe, Tyr-)>(Z-Asp-OMe, -Glu-, -Gln-, ¬Ser-, -Thr-, Leu-). The natures of the ester and N-protecting group influenced the ester hydrolyses of Nα-acyl-Asp and Glu. The best substrates were Z or Boc-Asp-OBzl and Z-Glu-OBzl. Surprisingly, Z-group removal occurred in a few ester hydrolysis reactions since the resulting Z-amino acids were consumed and the corresponding free amino acids were formed. This unexpected reaction was not avoided when cPPL was treated with irreversible inhibitors of T or of α-QT. Incubation of cPPL with 11 of the 20 Z-amino acids tested gave Z-group removal initial rates that followed the order: Tyr>Phe>Ser>Gln>Lys>His>Trp>Leu>Met>Arg>Ile. In the presence of cPPL the Z-group was also removed from the dipeptide Z-Gly-Phe. Interestingly, free Gly was also detected in the reaction medium. In summary, the most relevant contributions of the present work are: 1) the proposal of a biphasic solvent system suitable for peptide bond formation catalyzed by cPPL; 2) the unequivocal demonstration that T and α-QT are contaminants of cPPL and the suggestion that carboxypeptidase A can also be present in it (all of them may interfere in the efficiency of peptide formation catalyzed by cPPL); 3) the verification that, although impure, cPPL catalyzed dipeptide synthesis more efficiently than the CCLs; 4) the performance of the first systematic study of ester hydrolysis of Z-amino acids catalyzed by cPPL; 5) the observation of Z group removal during some Z-amino acid ester hydrolyses catalyzed by cPPL and the confirmation that this is also feasible for some Z¬amino acids and a Z-dipeptide.

A transferência de oxigênio é um fator limitante para grande parte dos cultivos em biorreatores que operam com organismos estritamente aeróbios devido à baixa solubilidade do oxigênio em meios de cultivo. A introdução de meios não convencionais, como polidimetilsiloxanos (PDMS), em biorreatores pode ser vista como uma melhoria para o ajuste desses processos. Este trabalho propõe uma investigação do emprego de polidimetilsiloxano fluido e emulsificado, usados como carreadores de oxigênio, em meios de cultivo na produção de lipases de Staphylococcus warneri EX17, cepa capaz de utilizar glicerol residual como substrato, visando melhorar a disponibilidade de oxigênio e aperfeiçoar a produtividade. Inicialmente, foram realizados estudos para selecionar o uso de glicerol residual, oriundo da síntese química de biodiesel como fonte de carbono. A atividade lipolítica foi semelhante com glicerol comercial e residual. Após a seleção do glicerol foram realizados experimentos em incubadora rotatória horizontal nas condições previamente otimizadas em trabalhos anteriores do grupo, adicionando PDMS. Dois tipos de PDMS foram testados, fluido e emulsificado. A produção de lipase foi significativamente maior no meio contendo PDMS. Assim, ferramentas de planejamento experimental, delineamento composto central (DCC) foram utilizadas para verificar a influencia do PDMS no coeficiente de transferência de oxigênio kLa em meio de cultivo produtor de lipase livre de células. O kLa aumentou significativamente no meio de cultivo contendo PDMS. Dois novos planejamentos foram desenhados, para otimizar a produção de lipase em meio de cultivo com células. Um para PDMS fluido e outro para PDMS emulsificado. No meio contendo PDMS fluido, a atividade lipolítica foi cinco vezes maior, enquanto que no meio contendo silicone emulsificado a atividade lipolítica foi três vezes maior. Este estudo demonstrou que a lipase de S. warneri EX17 pode ser produzida utilizando glicerol residual como fonte de carbono, e polidimetilsiloxanos como carreadores de oxigênio aumentando a transferência de oxigênio no meio e elevando a produção da enzima, que apresenta diversas possibilidades de aplicação, principalmente na indústria de alimentos. / The oxygen transfer is a limiting factor in many bioreactors cultivations, in which strictly aerobic organisms are grown due to the low solubility of oxygen in culture media. The introduction of unconventional media, such as polydimethylsiloxanes (PDMS) in bioreactors can be seen as a potential improvement for these processes. This work proposes an investigation of the use of polydimethylsiloxane in its two forms, fluid and emulsified, used as carriers of oxygen in culture media for the lipase production of Staphylococcus warneri EX17, strain capable of using glycerol as substrate, to improve the oxygen availability and improve enzyme productivity. Initially, studies were performed to select the use of residual glycerol, derived from the chemical synthesis of biodiesel as a source of carbon. The lipase activity was similar in both commercial and residual glycerol. Experiments were performed on orbital shaker, using conditions previously optimized in another work of the group, but with the addition of PDMS. Two types of PDMS were tested, the fluid and the emulsified. The lipase production was significantly higher in medium containing PDMS. Experimental design and central composite design (CCD) were used to evaluate the influence of PDMS on the oxygen transfer coefficient kLa in culture medium free of lipase-producing cells. The kLa increased significantly in the medium containing PDMS. Two new experimental plannings were designed to optimize the production of lipase in culture medium with cells. In the medium containing the PDMS fluid lipase activity was five times higher than medium without the oxygen carrier, while in the medium containing the emulsified silicone lipase activity was three times higher. This study showed that the lipase from S. warneri EX17 can be produced using residual glycerol as carbon source and that polydimethylsiloxanes works as interesting carrier of oxygen by increasing oxygen transfer rates, improving enzyme production, which has several possible applications, especially in the food industry.

Orientador: Telma Teixeira Franco / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia Quimica / Made available in DSpace on 2018-08-11T16:05:07Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Fonseca_EricaVagetti_M.pdf: 992372 bytes, checksum: 21c68e3e6cf626421f55f2bf6ffd2a90 (MD5) Previous issue date: 2008 / Resumo: O presente trabalho visou o desenvolvimento de um processo de aplicação para o ácido acrílico através de um bioprocesso, o qual envolveu a esterificação enzimática do mesmo em meio orgânico, catalisada por lipases e proteases para obtenção de acrilatos de açúcar. O interesse na produção de ésteres contendo moléculas de açúcar se dá devido à sua promissora aplicação como materiais absorventes de água, aditivos para o tratamento de água e para fins biomédicos. Além disso, os carboidratos são a fonte renovável mais abundante na terra e, conseqüentemente, uma das mais promissoras substâncias da química sustentável para o desenvolvimento de compostos de alta biodegradabilidade. Como reagentes, os ésteres acrílicos de frutose foram obtidos por esterificação direta da frutose com ácido acrílico em terc-butanol na presença de lipases e proteases comerciais. Foram investigados alguns parâmetros que interferem nesse bioprocesso, tais como: razão molar dos reagentes e tipo de catalisador. Verificou-se que meios reacionais contendo excesso de ácido acrílico, favorecem as maiores conversões molares de frutose. Dentre as enzimas testadas, a única a catalisar a reação de esterificação do ácido acrílico com a frutose em terc-butanol foi a lipase Novozym 435. Sendo assim, um planejamento fatorial completo com dois níveis e com repetição foi proposto para verificar a influência simultânea das variáveis x1 (razão molar de frutose/ácido acrílico nos valores de 1:5 e 1:20) e x2 (umidade inicial do sistema nos valores de 0,16% e 0,40%) na conversão molar de frutose, na conversão molar de ácido acrílico e na produção de seus ésteres empregando a lipase Novozym 435. A análise estatística dos dados indicou que ambos os fatores tiveram efeitos significativos na síntese dos ésteres de frutose. Assim, uma aplicação de acido acrílico para a produção de ésteres degradáveis e com redução do impacto ambiental nos parece ser um caminho convergente dentro do âmbito da química sustentável (química verde) / Abstract: In the present work the reaction conditions for the direct enzymatic esterification of sugars with acrylic acid catalyzed by lipases and proteases in organic media was studied. There has been an increasing interest in the production of sugar esters because of their possible use as water absorbent materials, as additives in water treatment and as a biocompatible material. In addition, carbohydrates are the most abundant natural resources on earth and an ideal feedstock for the development of biodegradable materials. The esterification reaction of fructose with acrylic acid in tert-butyl alcohol was catalyzed by the commercial lipases Novozym 435, Lipozyme RM IM and Lipozyme TL IM and the proteases Novozym 539 HPF and Esperase HP F. The effects fructose/acrylic acid molar ratio and type of catalyst on the reaction were investigated. The esterification reaction was dependent on fructose/acrylic acid molar ratio, as follows: the higher the amount of acrylic acid to fructose ratio the higher the fructose conversion. Only lipase Novozym 435 catalyzed the esterification of acrylic acid with fructose. A full 22 factorial design was used to study the simultaneous influence of the effects of molar ratio (1:5 and 1:20) and initial moisture of the system (0,16 and 0,40%) on fructose conversion, acrylic acid conversion and amount of esters produced with the lipase Novozym 435 as catalyst. Statistical analysis of the data indicated that both factors had significant effects on the synthesis of sugar esters. Therefore, an application to acrylic acid in the production of biodegradable esters seems to be an interesting trend according with the white chemistry. The feasibility of the direct synthesis of sugar acrylates was shown in this work as well as the best reaction conditions for the production of sugar acrylates / Mestrado / Desenvolvimento de Processos Químicos / Mestre em Engenharia Química

Submitted by Alisson Mota (alisson.davidbeckam@gmail.com) on 2015-07-20T19:34:46Z No. of bitstreams: 1 Dissertação - Kethellin Miranda Galeno de Carvalho.pdf: 654175 bytes, checksum: 62e84f2b966219c4227a24119b3bb4f1 (MD5) / Approved for entry into archive by Divisão de Documentação/BC Biblioteca Central (ddbc@ufam.edu.br) on 2015-07-23T13:46:43Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Dissertação - Kethellin Miranda Galeno de Carvalho.pdf: 654175 bytes, checksum: 62e84f2b966219c4227a24119b3bb4f1 (MD5) / Approved for entry into archive by Divisão de Documentação/BC Biblioteca Central (ddbc@ufam.edu.br) on 2015-07-23T14:19:42Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Dissertação - Kethellin Miranda Galeno de Carvalho.pdf: 654175 bytes, checksum: 62e84f2b966219c4227a24119b3bb4f1 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-07-23T14:19:42Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertação - Kethellin Miranda Galeno de Carvalho.pdf: 654175 bytes, checksum: 62e84f2b966219c4227a24119b3bb4f1 (MD5) Previous issue date: 2014-05-05 / CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Astrocaryum aculeatum G. F. W. Meyer popularly known as tucumã (do Amazonas)is an Arecaceae species, an Amazon palm tree, which is considered an oilseed species with high potential for the production of biofuels. Biofuels have many advantages over fossil fuels such as the reduced toxicity and lower emission of greenhouse gases, due to the carbon cycling. This has stimulated its use and study so far. In large scale, is normally produced from vegetable oils or animal fats and methanol through the transesterification process by the homogenous alkalis catalysis. However this process is possible only to oils of fats with low contents of free fatty acids, which is not observed for most of oil sources available in the Amazon. This works aimed to study the production of biodiesel by an alternative process based on two-steps process of hydrolysis-esterification, with focus on the hydrolysis step performed by enzyme catalysis. Two lots of tucumã kernel oil were studied. The physicalchemical parameters from both lots were determined. Lot 01 has acid value of 55.06 mg NaOH/gand lot 02 11.09 mg NaOH/g. The fatty acid composition was determined by FAME (Fatty Acid Methyl Ester) conversion and GC-FID analysis and showed that tucumã oil has lauric, myristic and palmitic acid as major constituents. The use of lipases was initially studied by the determination of hydrolytic capacity of 11 different commercial lipases using tricaprylin as substrate. Considering the observed results and the costs of acquisition of each enzyme, two enzymes were selected for further studies, Candida rugosa (free enzyme) and Thermomyces lanuginosus (immobilized). The quantification of enzyme conversion of oil into free fatty acids was determined by two methods. The first, was developed in this work, and was based on TLC-densitometry and the other RP-HPLC was used to validate the results obtained by TLC-densitometry. This analytical method showed accuracy, precision and linearity to quantify the lipid conversion and was used to determine the enzyme activity in different experiments performed to determine the best catalytic conditions. The best conditions observed for de Candida rugosa lipase were 0.3 % of enzyme, 1 % of surfactant, phosphate buffer at pH 7.50, oil:buffer ratio of 1:1 (V:V), temperature of 40 ºC, stirring at 700 rpm for 10 hours. Then, the hydrolysis was performed in larger scale in a glass reactor and the products of both lots were converted into biodiesel by heterogeneous catalysis with ferric sulfate, in separate experiments using methanol and ethanol. Overall the best conversion was observed for the ethylic biodiesel, whose composition showed high purity that was confirmed by GC-MS analysis. The studied process based on enzymatic hydrolysis followed by esterification by heterogeneous catalysis showed very promising results that could, in theory,be applied in the conversion ofany oil source with high free fatty acid content, which is one of the most important challenges in the production of biodiesel. / Astrocaryum aculeatum G. F. W. Meyer é conhecido popularmente como tucumã do Amazonas e pertence à família Arecaceae. Uma palmeira, cujas amêndoas dos seus frutos possuem grande potencial de óleo, podendo ser utilizado como matéria-prima na produção de biodiesel. O biodiesel apresenta grandes vantagens frente aos combustíveis fósseis, como a ciclagem de carbono, baixa toxicidade e o seu uso contribui para a diminuição do efeito estufa, proporcionando um ganho ambiental para todo o planeta pela diminuição da poluição atmosférica entre outras características que justificam sua utilização. Comercialmente é produzido pela reação de transesterificação por catálise básica com álcoois de cadeia curta. Contudo para que esse processo seja utilizado com rendimentos satisfatórios é fundamental que os óleos possuam baixos teores de ácidos graxos livres, o que para a maior parte dos óleos e gorduras, extraídos de espécies amazônicas, não é possível. Este trabalho teve como objetivo estudar o processo alternativo à transesterificação, dehidrólise seguida de esterificação, com especial ênfase a etapa de hidrólise, que foi realizada pela catálise enzimática. Foram utilizados dois lotes de óleos extraídos das amêndoas de tucumã. Inicialmente realizou-se a caracterização físico-química do óleo, onde o lote 01 apresentou índice de acidez de 55,06 mg NaOH/g e o lote 02 de 11,09 mg NaOH/g. Foi realizada também a determinação da composição da cadeia graxa por CG-FID. De acordo com essa análise os ácidos graxos majoritário foram: ácido láurico, mirístico e palmítico. Foi realizada uma triagem com 11 lipases comerciais livres para definir a atividade catalítica de cada enzima utilizando o mesmo substrato, a tricaprilina (C8:0). Considerando a atividade observada e o custo de aquisição das enzimas, foram selecionadas para as reações de hidrólise a lipase de Candida rugosa (livre) e a lipase Thermomyces lanuginosus (imobilizada). Os ácidos graxos produzidos nas reações de hidrólise foram quantificados por um método desenvolvido por CCD-densitometria. Os ácidos graxos também foram quantificados por CLAE em fase reversa para comparar os resultados e validar os resultados. A técnica de CCD-densitometria mostrou ser rápida, eficaz e precisa na quantificação de lipídios. Todas as reações foram monitoradas e quantificadas por essa técnica, com o intuito de estabelecer as melhores condições da atividade catalítica e o melhor resultado foi obtido utilizando a lipase de Candida rugosa nas seguintes: 0,3% do biocatalisador, tensoativo 1%, tampão fosfato de sódio pH 7,50; 0,1M, proporção óleo:tampão1:1, temperatura de 40 ºC, agitação 700 rpm em 10 horas de reação. Os dois lotes de óleo foram hidrolisados enzimaticamente em quantidades maiores num reator de vidro com as duas enzimas e em seguida foram esterificados empregando o catalisador heterogêneo de sulfato férrico, tanto pela via metílica como etílica. Pelas análises realizadas, o biodiesel etílico apresentou melhoresconversões frente ao biodiesel metílico. As amostras de biodiesel foram analisadas também por CG-EM para confirmar a formação do produto etílico. O processo de hidrólise enzimática associada à esterificação por catálise heterogênea apresentou resultados bastante promissores, que podem permitir o uso de matérias-primas com elevado índice de acidez, que é um dos principais desafios atuais na produção desse biocombustível.

Les flavonoïdes sont des composés poly-hydroxylés d’origine végétale, connus pour leurs vertus pour la santé. Afin d’obtenir des dérivés plus stables et solubles dans des formulations hydrophobes tout en conservant les activités biologiques des molécules d’origine, une solution consiste à acyler ces composés de manière régiosélective. Ceci peut être accompli en utilisant des lipases comme catalyseurs, en milieu organique. Grand nombre d’études expérimentales sur ces bioprocédés sont disponibles, mais aucune d’entre elles n’apporte d’explication, au niveau moléculaire, de la sélectivité de ces réactions d’acylation. Le but de cette étude est d’appliquer différents outils de simulation moléculaire pour mieux comprendre, au niveau moléculaire, les propriétés de sélectivité de l’acétylation de trois flavonoïdes (quercétine et ses dérivés glycosylés isoquercitrine et rutine), en utilisant les lipases CALB et PCL. D’abord, des simulations de docking ont été appliquées, afin d’obtenir les positions et les orientations les plus probables des flavonoïdes dans la cavité des lipases préalablement acétylées. Ensuite, des simulations de dynamique moléculaire ont été exécutées sur les complexes obtenus par docking, afin d’étudier stabilité structurale des complexes sur une période de temps et notamment la stabilité des interactions enzyme-substrats. Enfin, des simulations basées sur une approche de chimie quantique (DFT) ont été appliquées pour évaluer la réactivité chimique des flavonoïdes dockées dans les complexes. Les premières tendances observées aux cours des simulations ont présenté une bonne corrélation avec les résultats expérimentaux d’acétylation. Globalement, les résultats obtenus ont montré que la sélectivité de ces réactions dépend de l’orientation des substrats (flavonoïde et acétate) dans la cavité catalytique de la lipase, des interactions intermoléculaires stabilisant ces substrats et de la réactivité chimique intrinsèque des groupements OH des flavonoïdes se situant à proximité des résidus catalytiques / Flavonoids are plant-produced polyhydroxylated compounds, well-known for their beneficial health effects. In order to obtain more stable and soluble derivatives for incorporation in hydrophobic formulations without damaging the biological activities of the native molecules, a solution consists to perform a regioselective acylation of these molecules. This can be accomplished by using lipase biocatalysts, in organic media. Several experimental studies dealing with such processes are available, but none of them give any explanation, at the molecular level, for the regioselectivity of such reactions. This study aimed to apply different molecular modelling tools in order to better understand, at the molecular level, the selectivity properties of the acetylation of three flavonoids (quercetin and its glycosylated derivatives isoquercitrin and rutin), by using the lipases CALB and PCL. Firstly, docking simulations were applied, in order to obtain the most probable positions and orientations of the flavonoids in the cavities of acetylated lipases. Then, molecular dynamics simulations were performed, aiming to study the structural stability of the complexes upon a period of time and specially the stability of the enzyme-substrates interactions. Finally, quantum chemical simulations (DFT) were applied to evaluate the chemical reactivity of the flavonoids as docked in the complexes. The trends observed during the simulations were well correlated with previous experimental results on the acetylation reaction of these flavonoids. Overall, the results showed that the selectivity in such reactions depends upon the substrates (flavonoid and acetate) orientations in the enzyme catalytic cavity, the intermolecular interactions that stabilize these substrates and the intrinsic chemical reactivity of the flavonoids OH groups reaching the catalytic residues