Thesis (Ph. D.)--University of Wisconsin-Madison, 1975. / Typescript. Vita. eContent provider-neutral record in process. Description based on print version record. Includes bibliographical references (leaves 224-237).

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<P> Mitochondria contain DNA which is distinct from nuclear DNA. The capacity of isolated rat liver mitochondria to synthesize RNA and the types of RNA synthesized were examined in order to determine the genetic function of mitochondrial DNA. </p> <p> It was demonstrated that isolated rat liver mitochondria synthesize RNA, incorporating [3H]UTP, [3H] ATP,[3H]CTP and [3H]GTP in a DNA-dependent reaction. In addition, the DNA-independent incorporation of [3H]CTP and [3H]ATP suggested metabolic turnover of the CCA end of mitochondrial tRNA. </p> <P> Analysis of the , newly-synthesized RNA by sucrose density gradient centrifugation and agarose-polyacrylamide gel electrophoresis demonstrated that mitochondrial ribosomal RNA was synthesized in a DNA-dependent process. It is concluded that one of the genetic functions of mitochondrial DNA is to code for mitochondrial ribosomal RNA. </p> / Thesis / Doctor of Philosophy (PhD)

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The elucidation of the molecular mechanism of the cell response to moderate heating is of importance for understanding the events that occur in the cell upon use of heating for therapeutic purpose or during illnesses that are associated with fever. The aim of this work was to investigate and to compare the effects of mild (fever) and severe hyperthermia on functional properties of oxidative phosphorylation system in normal tissue mitochondria. Modular kinetic analysis for the first time was applied to evaluate effects of hyperthermia on oxidative phosphorylation in rat heart and liver mitochondria. We demonstrated that changes in mitochondrial functions induced by mild hyperthermia (42 ºC) are reversible but more severe hyperthermia (45 ºC) causes partially irreversible uncoupling and inhibition of mitochondrial respiration in state 3, hyperthermia remarkably (3.6-2.1 fold) activates ROS generation in heart mitochondria and that maximal increase in rate of H2O2 production and lipid peroxidation is observed in the fever temperature range. We show that the response of liver mitochondria and hepatocytes to hyperthermia is to certain extent dependent on gender and temperature. Specific differences of male rat liver and heart mitochondrial components phase transitions have been revealed by DSC analysis. / Ląstelių atsako į nuosaikią hipertermiją molekulinio mechanizmo išaiškinimas yra labai svarbus norint suprasti procesus, kurie vyksta ląstelėse jas kaitinant gydymo tikslais ar organizmui karščiuojant. Šio darbo tikslas buvo nustatyti ir palyginti švelnios (karščiavimo) ir šiurkščios hipertermijos poveikį oksidacinės fosforilinimo sistemos funkcijoms normalių audinių mitochondrijose. Pirmą kartą panaudojome modulių kinetinę analizę hipertermijos poveikiui širdies ir kepenų mitochondrijų oksidacinio fosforilinimo sistemai tirti. Mes nustatėme, kad švelnios hipertermijos (42 ºC) poveikis širdies mitochondrijų funkcijoms yra grįžtamas, bet šiurkštesnė hipertermija (45 ºC) sukelia dalinai negrįžtamą kvėpavimo ir fosforilinimo atskyrimą bei mitochondrijų kvėpavimo greičio trečioje metabolinėje būsenoje slopinimą. Hipertermija didino ROS gamybos greitį ir lipidų peroksidaciją, kurie buvo didžiausi karščiavimo temperatūroje. Nustatėme, kad kepenų mitochondrijų ir hepatocitų atsakas į hipertermiją priklauso nuo žiurkės lyties ir temperatūros. Atlikome palyginamąjį širdies ir kepenų mitochondrijų sandų fazinių virsmų analizę diferencine skenuojamaja kalorimetrija ir nustatėme būdingus skirtumus.

Ląstelių atsako į nuosaikią hipertermiją molekulinio mechanizmo išaiškinimas yra labai svarbus norint suprasti procesus, kurie vyksta ląstelėse jas kaitinant gydymo tikslais ar organizmui karščiuojant. Šio darbo tikslas buvo nustatyti ir palyginti švelnios (karščiavimo) ir šiurkščios hipertermijos poveikį oksidacinės fosforilinimo sistemos funkcijoms normalių audinių mitochondrijose. Pirmą kartą panaudojome modulių kinetinę analizę hipertermijos poveikiui širdies ir kepenų mitochondrijų oksidacinio fosforilinimo sistemai tirti. Mes nustatėme, kad švelnios hipertermijos (42 ºC) poveikis širdies mitochondrijų funkcijoms yra grįžtamas, bet šiurkštesnė hipertermija (45 ºC) sukelia dalinai negrįžtamą kvėpavimo ir fosforilinimo atskyrimą bei mitochondrijų kvėpavimo greičio trečioje metabolinėje būsenoje slopinimą. Hipertermija didino ROS gamybos greitį ir lipidų peroksidaciją, kurie buvo didžiausi karščiavimo temperatūroje. Nustatėme, kad kepenų mitochondrijų ir hepatocitų atsakas į hipertermiją priklauso nuo žiurkės lyties ir temperatūros. Atlikome palyginamąjį širdies ir kepenų mitochondrijų sandų fazinių virsmų analizę diferencine skenuojamaja kalorimetrija ir nustatėme būdingus skirtumus. / The elucidation of the molecular mechanism of the cell response to moderate heating is of importance for understanding the events that occur in the cell upon use of heating for therapeutic purpose or during illnesses that are associated with fever. The aim of this work was to investigate and to compare the effects of mild (fever) and severe hyperthermia on functional properties of oxidative phosphorylation system in normal tissue mitochondria. Modular kinetic analysis for the first time was applied to evaluate effects of hyperthermia on oxidative phosphorylation in rat heart and liver mitochondria. We demonstrated that changes in mitochondrial functions induced by mild hyperthermia (42 ºC) are reversible but more severe hyperthermia (45 ºC) causes partially irreversible uncoupling and inhibition of mitochondrial respiration in state 3, hyperthermia remarkably (3.6-2.1 fold) activates ROS generation in heart mitochondria and that maximal increase in rate of H2O2 production and lipid peroxidation is observed in the fever temperature range. We show that the response of liver mitochondria and hepatocytes to hyperthermia is to certain extent dependent on gender and temperature. Specific differences of male rat liver and heart mitochondrial components phase transitions have been revealed by DSC analysis.

INTRODUÇÃO: A lesão de isquemia/reperfusão hepática ocorre durante cirurgias hepáticas de grande porte, transplante de fígado e no trauma abdominal. A lesão de isquemia/reperfusão hepática ocasiona lesões no fígado e pode desencadear uma síndrome inflamatória sistêmica com lesões de órgãos a distância. Estudos anteriores demonstraram que o diazóxido protege outros órgãos (coração, rins, cérebro) da lesão de isquemia/reperfusão destes órgãos. OBJETIVO: Investigar o efeito da administração do diazóxido na lesão de isquemia/reperfusão hepática. MÉTODOS: Ratos Wistar machos foram divididos em 3 grupos. Em 2 grupos, os animais foram submetidos à isquemia hepática parcial realizada por clampeamento do pedículo dos lobos mediano e lateral anterior esquerdo durante uma hora sob ventilação mecânica. Grupo Salina (n=26): ratos receberam solução salina e Grupo Diazóxido (n=26): ratos receberam diazóxido EV ( 3.5mg/kg ) 15 minutos antes da reperfusão hepática. No terceiro grupo, Grupo Controle (n = 22 ), os ratos foram submetidos apenas à anestesia e manipulação cirúrgica. Quatro e 24 horas após os procedimentos, amostras de sangue foram recolhidas para determinações de AST, ALT, TNF-alfa, IL-6, IL-10, de nitrito/nitrato, creatinina. Amostras teciduais do fígado foram analisadas para dosagem do malondialdeído (MDA), para o estudo das funções oxidativas e fosforilativas mitocondriais, e para a análise histológica. Pela coleta de tecido pulomonar, a permeabilidade vascular pulmonar e a atividade da mieloperoxidade (MPO) também foram determinados. RESULTADOS: Quatro horas após, a reperfusão o Grupo Diazóxido apresentou elevações de AST, ALT, TNF-alfa, IL-6, IL-10 e níveis séricos de nitrito/nitrato significativamente menores que o Grupo Controle (p < 0,05). Observou-se uma redução significativa da disfunção mitocondrial hepática no Grupo Diazóxido em comparação com o Grupo Controle (p < 0,05). Não foram observadas diferenças no conteúdo de MDA fígado, na creatinina sérica e na permeabilidade vascular pulmonar, e na atividade da MPO entre os grupos. Vinte e quatro horas após, a reperfusão o Grupo Diazóxido registrou uma redução de AST, ALT quando comparado ao Grupo Controle (p < 0,05). CONCLUSÃO: O Diazóxido mantém a função mitocondrial do fígado, aumenta a tolerância fígado à lesão de Isquemia/Reperfusão e reduz a resposta inflamatória sistêmica. Esses efeitos requerem comprovações adicionais para o uso na prática clínica / INTRODUCTION: Significant liver ischemia/reperfusion injury can occur during hepatic surgeries, liver transplantation and abdominal trauma. Hepatic ischemia/reperfusion can trigger a local and systemic inflammatory syndrome. Previous studies have shown that diazoxide protects other organs (heart, kidneys, brain) from ischemia/reperfusion injury. AIM: To investigate the effect of diazoxide administration on liver ischemic/reperfusion injury. METHODS: Wistar male rats were divided into 3 groups. In two groups the rats underwent partial liver ischemia performed by clamping the pedicle from medium and left anterior lateral segments during an hour under mechanical ventilation. Saline Group (n=26): rats received saline and Diazoxide Group (n=26): rats received IV diazoxide (3.5mg/kg) 15 minutes before liver reperfusion. The third group, the Control Group (n=22) the rats underwent only anesthesia and surgical manipulation. Four and 24 hours after the procedure blood were collected for determinations of AST, ALT, TNF-alfa, IL-6, IL-10, nitrite/nitrate, creatinine. Liver tissues were assembled for mitochondrial oxidation and phosphorylation, malondialdehyde (MDA) content, and histologic analysis. Pulmonary vascular permeability and myeloperoxidade (MPO) were also determined. RESULTS: Four hours after reperfusion Diazoxide Group presented elevation of AST, ALT, TNF-alfa, IL-6, IL-10 and nitrite/nitrate serum levels significantly lower than Control Group (p < 0.05). A significant reduction on liver mitochondrial dysfunction were observed in Diazoxide Group compared to Control Group (p < 0.05). No differences in liver MDA content,serum creatinine and in pulmonary vascular permeability and MPO activity were observed between groups. Twenty four hours after reperfusion Diazoxide Group showed a reduction of AST, ALT and TGF?1 serum levels when compared to Control group (p < 0.05). CONCLUSION: Diazoxide maintains liver mitochondrial function, increases liver tolerance to I/R injury, and reduces systemic inflammatory response. These effects require further evaluations for using in a clinical setting

O presente estudo tem por objetivo principal avaliar as alterações funcionais precoces de mitocôndrias hepáticas de ratos wistar submetidos ao estímulo de sepse através da técnica de ligadura cecal e punção (cecal ligation and puncture-CLP) e indução de tolerância ao lipopolissacarídeo (LPS) de Escherichia coli. As mitocôndrias exercem papel na alteração do metabolismo celular de pacientes sépticos. Os objetivos do presente trabalho foram: (1) padronizar a técnica de indução a tolerância para ratos wistar com LPS de E. coli (2) avaliar a função mitocondrial fosforilativa e oxidativa; (3) quantificar DNA mitocondrial em tecido hepático de animais submetidos à CPL e tolerância; (4) verificar a expressão dos genes responsáveis pela biogênese mitocondrial e replicação do DNA mitocondrial: nuclear respiratory factor (NRF-1), mitochondrial transcription factor A (TFAM) e peroxisome proliferator-activated receptor gamma coactivator 1-alpha (PGC-1alfa); (5) avaliar a função dos complexos respiratórios I e IV. Os resultados encontrados no presente estudo revelaram que: (a) a taxa de mortalidade dos animais submetidos a tolerância foi de 10% quando submetidos à dose letal de LPS, enquanto a taxa de mortalidade dos animais controle foi de 100% quando submetidos à dose letal de LPS; (b) observou-se que o grupo do controle respiratório que recebeu doses controladas de LPS e foi submetido à CLP apresentou razão igual ao grupo Controle, sugerindo que a fosforilação oxidativa se manteve igual ao basal, enquanto o grupo que foi submetido ao procedimento de CLP sem indução a tolerância apresentou piora da razão do controle respiratório em relação ao grupo controle; (c) a quantificação de DNA mitocondrial mostrou-se maior nos animais submetidos a CLP sem prévia indução a tolerância, com igual aumento da expressão dos fatores de biogênese mitocondrial em relação aos demais grupos; (d) houve diferença significativa na avaliação da funcionalidade dos complexo I, porém o complexo IV se manteve igual em todos os grupos. Concluiu-se que a indução a tolerância altera positivamente a função mitocondrial em animais submetidos à CLP / The aim of this study was to evaluate the early functional alterations of hepatic mitochondria of wistar rats submitted to the stimulation of sepsis through the technique of cecal ligation and puncture (CLP) and induction of tolerance to lipopolysaccharide (LPS) of Escherichia coli. Mitochondria play a role in altering the cellular metabolism of septic patients. The objectives of the present study were: (1) to standardize the tolerance induction technique for wistar rats with E. coli LPS (2) to evaluate the mitochondrial phosphorylation and oxidative function; (3) quantify mitochondrial DNA in hepatic tissue of animals submitted to CPL and tolerance; (4) to verify the expression of genes responsible for mitochondria biogenesis and mitochondrial DNA replication nuclear mitochondrial biogenesis (NRF-1), mitochondrial transcription factor A (TFAM) and peroxisome proliferator-activated receptor gamma coactivator 1-alpha (PGC-1alpha); (5) to evaluate the function of respiratory complexes I and IV. The results found in the present study revealed that: (a) the mortality rate of the animals submitted to tolerance was 10% when submitted to the lethal dose of LPS, whereas the mortality rate of the control animals was 100% when submitted to the lethal dose of LPS; (B) it was observed that the group receiving controlled doses of LPS and submitted to CLP presented a ratio equal to the control group, suggesting that oxidative phosphorylation remained the same at baseline, whereas the group that underwent CLP procedure without induction of tolerance presented worsening of the respiratory control ratio in relation to the control group; (C) the mitochondrial DNA quantification was higher in the animals submitted to CLP without prior tolerance induction, with an equal increase in mitochondrial biogenesis factors expression in relation to the other groups; (D) there was significant difference in the evaluation of the functionality of complexes I, but no difference in complex IV in all groups. It was concluded that induction of tolerance positively alters mitochondrial function in animals submitted to CLP

O presente estudo tem por objetivo principal avaliar as alterações funcionais precoces de mitocôndrias hepáticas de ratos wistar submetidos ao estímulo de sepse através da técnica de ligadura cecal e punção (cecal ligation and puncture-CLP) e indução de tolerância ao lipopolissacarídeo (LPS) de Escherichia coli. As mitocôndrias exercem papel na alteração do metabolismo celular de pacientes sépticos. Os objetivos do presente trabalho foram: (1) padronizar a técnica de indução a tolerância para ratos wistar com LPS de E. coli (2) avaliar a função mitocondrial fosforilativa e oxidativa; (3) quantificar DNA mitocondrial em tecido hepático de animais submetidos à CPL e tolerância; (4) verificar a expressão dos genes responsáveis pela biogênese mitocondrial e replicação do DNA mitocondrial: nuclear respiratory factor (NRF-1), mitochondrial transcription factor A (TFAM) e peroxisome proliferator-activated receptor gamma coactivator 1-alpha (PGC-1alfa); (5) avaliar a função dos complexos respiratórios I e IV. Os resultados encontrados no presente estudo revelaram que: (a) a taxa de mortalidade dos animais submetidos a tolerância foi de 10% quando submetidos à dose letal de LPS, enquanto a taxa de mortalidade dos animais controle foi de 100% quando submetidos à dose letal de LPS; (b) observou-se que o grupo do controle respiratório que recebeu doses controladas de LPS e foi submetido à CLP apresentou razão igual ao grupo Controle, sugerindo que a fosforilação oxidativa se manteve igual ao basal, enquanto o grupo que foi submetido ao procedimento de CLP sem indução a tolerância apresentou piora da razão do controle respiratório em relação ao grupo controle; (c) a quantificação de DNA mitocondrial mostrou-se maior nos animais submetidos a CLP sem prévia indução a tolerância, com igual aumento da expressão dos fatores de biogênese mitocondrial em relação aos demais grupos; (d) houve diferença significativa na avaliação da funcionalidade dos complexo I, porém o complexo IV se manteve igual em todos os grupos. Concluiu-se que a indução a tolerância altera positivamente a função mitocondrial em animais submetidos à CLP / The aim of this study was to evaluate the early functional alterations of hepatic mitochondria of wistar rats submitted to the stimulation of sepsis through the technique of cecal ligation and puncture (CLP) and induction of tolerance to lipopolysaccharide (LPS) of Escherichia coli. Mitochondria play a role in altering the cellular metabolism of septic patients. The objectives of the present study were: (1) to standardize the tolerance induction technique for wistar rats with E. coli LPS (2) to evaluate the mitochondrial phosphorylation and oxidative function; (3) quantify mitochondrial DNA in hepatic tissue of animals submitted to CPL and tolerance; (4) to verify the expression of genes responsible for mitochondria biogenesis and mitochondrial DNA replication nuclear mitochondrial biogenesis (NRF-1), mitochondrial transcription factor A (TFAM) and peroxisome proliferator-activated receptor gamma coactivator 1-alpha (PGC-1alpha); (5) to evaluate the function of respiratory complexes I and IV. The results found in the present study revealed that: (a) the mortality rate of the animals submitted to tolerance was 10% when submitted to the lethal dose of LPS, whereas the mortality rate of the control animals was 100% when submitted to the lethal dose of LPS; (B) it was observed that the group receiving controlled doses of LPS and submitted to CLP presented a ratio equal to the control group, suggesting that oxidative phosphorylation remained the same at baseline, whereas the group that underwent CLP procedure without induction of tolerance presented worsening of the respiratory control ratio in relation to the control group; (C) the mitochondrial DNA quantification was higher in the animals submitted to CLP without prior tolerance induction, with an equal increase in mitochondrial biogenesis factors expression in relation to the other groups; (D) there was significant difference in the evaluation of the functionality of complexes I, but no difference in complex IV in all groups. It was concluded that induction of tolerance positively alters mitochondrial function in animals submitted to CLP