Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / La resistencia a antimicrobianos es una de las amenazas más relevantes a la salud pública mundial. Actualmente es común encontrar bacterias multirresistente, con resistencia extrema e incluso panresistentes dejando escasas alternativas para el tratamiento de las infecciones. Los animales son considerados como reservorios de resistencia a antimicrobianos, transfiriendo genes a otras bacterias patógenas que pueden afectar al ser humano. Es por esto que se han desarrollado diversos programas de vigilancia bajo el concepto “Una Salud”, utilizando bacterias comensales como Escherichia coli para monitorear los niveles de resistencia. El objetivo de este trabajo fue conocer el estado actual de resistencia antimicrobiana en terneros de lechería del sur de Chile, junto con determinar posibles factores de riesgo para la mantención de esta. Se recolectaron heces de terneros sanos, con diarrea y de las camas de las ternereras de 20 predios y se les realizó cultivo para el aislamiento de E. coli y antibiograma con los 7 antimicrobianos más utilizados en bovinos según los reportes del SAG en el año 2015. Adicionalmente se aplicó una encuesta de manejos a los productores. Los resultados muestran que existen niveles elevados de resistencia (sobre el 20%) a oxitetraciclina, amoxicilina, sulfametoxazol-trimetoprim, enrofloxacino y florfenicol, manteniendo bajos niveles de resistencia a gentamicina y ceftiofur. Los terneros con diarrea presentaron mayores niveles de multirresistencia y extrema resistencia. Además, se encontró que, del total de las muestras, un 18,9% de las muestras presentó resistencia a 5 o más antimicrobianos. En relación con los factores de riesgo analizados a partir de la encuesta, no se encontró asociación entre las variables evaluadas y los niveles de resistencia. Por otra parte, se encontró que los terneros de menor edad tenían mayores niveles de resistencia que los terneros mayores (p<0,001). El presente trabajo da cuenta de que existen elevados niveles de resistencia antimicrobiana en los terneros de lechería del sur del país, dejando en evidencia un problema serio y que requiere de acciones urgentes para enfrentarlo dado el potencial riesgo que representa para la salud pública / Antimicrobial resistance is one of the most significant threats to global public health. It is now common to find multiresistant bacteria and even extreme resistance leaving few alternatives for the treatment of infections. Livestock are considered as reservoirs of resistance, transferring genes to other pathogenic bacteria that can even affect the human population. Therefore, several surveillance programs have been developed under the "One Health" concept, using commensal bacteria like E. coli to monitor the resistance levels. Calves found in dairy systems are not exempt from the problem, and it is suggested that there are factors involved in the maintenance and diffusion of resistance. The objective of this work was to assess the current state of antimicrobial resistance in dairy calves of southern Chile and to determine possible risk factors associated with it. Twenty fecal samples were collected from healthy calves, calves with diarrhea and from the closer environment. These were cultured and an antimicrobial resistance testing was performed. A questionnaire was also applied to all the participating producers. The results show that there are high levels of resistance to oxytetracycline, amoxicillin, sulfamethoxazole-trimethoprim, enrofloxacin and ceftiofur, but maintaining low levels of resistance to gentamicin and florfenicol. Calves with diarrhea presented higher levels of resistance and multiresistance. In addition, it was found that 18.9% of the samples presented resistance to 5 or more antimicrobials. In relation to the risk factors evaluated through the questionnaire thought to be involved in the observed antimicrobial resistance levels, none showed statistically significant association. Nevertheless, it was found that younger calves had higher levels of resistance than the older calves (p<0,001). The present work allowed to describe the actual situation on E. coli antimicrobial resistance in dairy calves in southern Chile and defined which are the potentially relevant elements that can participate in the antimicrobial resistance in this complex environment / Financiamiento: Proyecto U-Inicia VID 121017019102106

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / Se ha demostrado en estudios anteriores el traspaso de antibióticos a las plumas de pollos, presentando un comportamiento de eliminación más lento que en otros tejidos comestibles, como hígado y músculo, encontrándose en altas concentraciones, incluso después de respetar los periodos de resguardo establecidos para otros tejidos. Esto cobra relevancia debido a que las plumas son luego incorporada como una fuente de proteína en las dietas de animales de producción. Dado este escenario, es necesario un método analítico que permita la extracción de manera confiable, precisa, y reproducible en laboratorio para el analito Lincomicina en tejidos comestibles y plumas, dando paso posteriormente a un estudio de depleción en estas matrices, ya que no existen estudios anteriores para este antibiótico. Por lo que el objetivo de este estudio fue el desarrollo de una metodología analítica mediante LC-MS/MS, para la detección de Lincomicina en músculo, hígado y plumas, la cual se implementó y validó en el Laboratorio de Farmacología Veterinaria (FARMAVET). Se escogió como estándar interno Lincomicina d-3, metanol como solvente para la extracción y la columna SPE Florisil como paso de limpieza. Los resultados obtenidos indican que la metodología analítica implementada es válida, ya que cumple con los criterios de aceptación de los parámetros establecidos por la Comisión de decisión 2002/657/CE y por la FDA: VICH GL49, siendo específica, lineal, con recuperación adecuada y precisa. Se determinó un límite de detección de 20 μg/kg-1, y se calcularon límites de cuantificación entre 20,7 y 23,6 μg/kg-1 para las tres matrices. Para la linealidad, todas las curvas de calibración mostraron un coeficiente de determinación (R2) mayor a 0,99. Los rangos de recuperación estuvieron entre 98% y 101% para todas las concentraciones estudiadas. Basándose en estos resultados, es posible la utilización de esta metodología analítica como base para realizar estudios a futuro de depleción de Lincomicina en tejidos comestibles y plumas. / The transfer of antibiotics to chicken feathers has been demonstrated in previous studies, showing a slower elimination than in other edible tissues such as liver and muscle, being found in high concentrations, even after respecting the established withdrawal times for other tissues. This becomes relevant because the feathers are incorporated as a source of protein in the diets of farm species. Given this scenario, an analytical method that allows the reliable, accurate and reproducible extraction in laboratory of Lincomycin analyte in edible tissues and feathers is needed, providing an analytical methodology to study the depletion in these matrices, since there are no previous studies for this antibiotic available in the literature. Therefore, the objective of this study was the development an analytical methodology through LC-MS/MS, for the detection of Lincomycin in muscle, liver and feathers, which was implemented and validated in the Veterinary Pharmacology Laboratory (FARMAVET). Lincomycin d-3 was used as the internal standard, methanol as drug solvent and Florisil SPE column for matrix clean up step. The results indicated that the analytical methodology implemented is valid, since it fulfills the acceptance criteria of the parameters established by Commission Decision 2002/657/CE and by FDA: VICH GL49, being specific, linear, with an adequate recovery and precise. A detection limit of 20 μg/kg-1 and a quantification limits between 20.7 and 23.6 μg/kg-1 were determined for the three matrices. For linearity, all calibration curves showed a coefficient of determination (R2) higher than 0.99. Recovery ranges were between 98% and 101% for all studied concentrations. Based on these results, it is possible to use this analytical methodology as a basis for future studies of depletion of Lincomycin in edible tissues and feathers. / Proyecto Fondecyt de iniciación en Investigación 11140530

[ES] La ingeniería tisular ha evolucionado hacia el modelado de la fisiología humana in vitro. El microambiente de la médula ósea (BM) es también hogar de procesos malignos. El mieloma múltiple (MM) es una neoplasia hematológica caracterizada por proliferación y acumulación en la BM de células plasmáticas monoclonales. Los tratamientos han mejorado, sin embargo, sigue siendo incurable. Moléculas de la matriz extracelular como fibronectina (FN) o ácido hialurónico (HA) tienen un papel reconocido en la resistencia a fármacos (DR). La inadecuación de los modelos preclínicos bidimensionales es una de las bases del problema de DR. Se han intentado diferentes enfoques in vitro, sin embargo, se basan en hidrogeles y andamios celulares diseñados para células adherentes, mientras que las células de MM presentan crecimiento en suspensión. El objetivo principal de esta Tesis es desarrollar, optimizar y validar una plataforma de cultivo 3D, denominada microgel, basada en microesferas en un medio líquido y que coexisten con células de MM creciendo dinámicamente en suspensión. Se desarrollaron y caracterizaron diferentes microesferas con diferentes funcionalizaciones. Optimizamos un protocolo de polimerización en suspensión para la obtención de microesferas a base de acrilatos con dos composiciones diferentes (presencia (10%) o ausencia (0%) de ácido acrílico (AA)) i dos distribuciones de tamaño diferentes (< 60 y > 70 ¿m). La FN se adsorbió en la superficie de la microesfera, mientras que el HA, colágeno I y diferentes secuencias peptídicas se injertaron covalentemente. Se modificaron las microesferas comerciales Cytodex 1 para adaptar sus características a la plataforma. Se utilizaron técnicas capa por capa (LbL) para introducir HA y sulfato de condroitina (CS) en su superficie. Por tanto, se ha generado un amplio repertorio de microesferas para desarrollar microgeles. Se optimizaron y validaron las condiciones de cultivo para la plataforma de microgel. Las condiciones óptimas se establecieron como 150 rpm de velocidad de agitación utilizando un agitador orbital y microesferas de < 60 ¿m. Los microgeles con diferentes composiciones y funcionalizaciones permitieron una buena proliferación de las líneas RPMI8226, U226 y MM1.S. Todos los sistemas respetaron el patrón de crecimiento en suspensión, factor que ha demostrado ser clave para su buen desempeño en cultivo 3D. En estudios iniciales de DR, la línea celular RPMI8226 cultivada en microgeles que contenían AA mostró una resistencia significativamente mayor a la dexametasona que sus cultivos en suspensión. Y las líneas RPMI8226, U226 y MM1.S cultivadas en microgeles que contenían AA mostraron una resistencia significativamente mayor a bortezomib que sus cultivos en suspensión. Por lo tanto, la presencia de AA en la matriz polimérica mostró un efecto positivo en la generación de DR in vitro y requerirá más estudios. Se ha validado la reducción de escala del sistema para trabajar con volúmenes más pequeños de microesferas y números reducidos de células, lo que es de gran relevancia para su traslación clínica. Finalmente, se han realizado cultivos preliminares con la línea celular RPMI8226 en los microgeles basados en Cytodex 1. Las microesferas de Cytodex 1 sin modificación tuvieron un efecto negativo sobre la viabilidad de las células de MM. La modificación mediante LbL con los pares quitosano/CS y quitosano/HA aumentó la viabilidad y proliferación. Sin embargo, estos sistemas no respetaron el carácter no adherente de las células MM. Hemos desarrollado y validado un novedoso sistema de cultivo basado en un medio 3D semisólido definido por microesferas y células de MM especialmente diseñado para células en suspensión. Este sistema constituye una herramienta versátil que debe explorarse más a fondo para el cultivo 3D de neoplasias hematológicas y para estudios de resistencia a fármacos in vitro. / [CAT] L'enginyeria tissular ha evolucionat cap al modelat de la fisiologia humana in vitro. El complex microambient de la medul·la òssia (BM) és també llar d'alguns processos malignes. El mieloma múltiple (MM) és una neoplàsia hematològica caracteritzada per una proliferació i acumulació a la BM de cèl·lules plasmàtiques monoclonals. Els tractaments han millorat, no obstant, el MM segueix sent incurable. Molècules de la matriu extracel·lular com fibronectina (FN) o àcid hialurònic (HA) tenen un paper reconegut en la generació de resistència a fàrmacs (DR) en MM. La inadequació dels models preclínics bidimensionals és una de les bases del problema de DR. Per això, s'han intentat diferents aproximacions in vitro, tanmateix es basen en hidrogels i andamis cel·lulars dissenyats per a cèl·lules adherents, mentre que les cèl·lules de MM presenten creixement en suspensió. L'objectiu principal d'aquesta Tesi és desenvolupar, optimitzar i validar una plataforma de cultiu 3D, denominada microgel, basada en microesferes en un medi líquid i que coexisteixen amb cèl·lules de MM que creixen dinàmicament en suspensió. S'han produït i caracteritzat diferents microesferes amb diferents funcionalitzacions. S'ha optimitzat un protocol de polimerització en suspensió per a l'obtenció de microesferes d'acrilats amb dues composicions diferents (presència (10%) o absència (0%) d'àcid acrílic (AA)) i amb dos distribucions de diàmetres diferents (< 60 y > 70 ¿m). La FN es va adsorbir, mentre que el HA, el col·lagen I i diferents seqüències peptídiques es van unir covalentment. S'han modificat microesferes comercials Cytodex 1 per tal d'adaptar les seves característiques a la plataforma del microgel. Mitjançant tècniques capa a capa (LbL) s'han introduït HA i sulfat de condroïtina (CS) a la seua superfície. Per tant, s'ha generat un ampli repertori de microesferes per desenvolupar microgels. Es van optimitzar i validar les condicions de cultiu per a la plataforma de microgel. Les condicions òptimes de cultiu es varen establir com a 150 rpm de velocitat d'agitació utilitzant un agitador orbital i microesferes de < 60 ¿m. Els microgels amb diferents composicions i funcionalitzacions van permetre una bona proliferació de les línies RPMI8226, U226 i MM1.S. Tots els sistemes van respectar el patró de creixement en suspensió, factor que ha demostrat ser clau per al seu bon rendiment en cultius 3D. En estudis inicials de DR línia cel·lular RPMI8226 cultivada en microgels que contenien AA va mostrar una resistència significativament major a la dexametasona que els seus cultius en suspensió convencionals. Línies RPMI8226, U226 y MM1.S cultivades en microgels que contenien AA mostraren una resistència significativament major a bortezomib que els seus cultius en suspensió convencionals. Per tant, la presencia d'AA a la matriu polimèrica de les microesferes va mostrar un efecte positiu en termes de generació de DR in vitro, cosa que requerirà estudis futurs. S'ha validat la reducció de l'escala del sistema per treballar amb volums més petits de microesferes i menys cèl·lules, el que és de gran rellevància per a la seva translació clínica. Finalment, s'han realitzat cultius preliminars amb la línia cel·lular RPMI8226 en els microgels basats en les Cytodex 1. Les microesferes de Cytodex 1 sense modificar van mostrar efecte negatiu sobre la viabilitat de les cèl·lules de MM. La modificació mitjançant LbL amb els parells quitosà/CS i quitosà/HA va augmentar la viabilitat i proliferació de cèl·lules MM. No obstant, aquests sistemes no respectaren el caràcter no adherent de les cèl·lules de MM. S'ha desenvolupat i validat un nou sistema de cultiu cel·lular basat en un medi 3D semisòlid definit per microesferes i cèl·lules de MM, especialment dissenyat per a cèl·lules no adherents. Aquest sistema constitueix una eina versàtil que ha de ser explorada per al cultiu 3D de neoplàsies hematològiques i per a estudis de resistència a fàrmacs in vitro. / [EN] Tissue engineering has evolved towards modeling of human physiology in vitro. The bone marrow (BM) microenvironment is likewise the home of some malignant processes. Multiple myeloma (MM) is a hematological neoplasia characterized by proliferation and BM accumulation of monoclonal plasma cells. Treatments have improved; however, MM remains incurable. Extracellular matrix molecules such as fibronectin (FN) or hyaluronic acid (HA) have a recognized role in drug resistance (DR). The inadequacy of two-dimensional preclinical models is one cause of the DR problem, different in vitro approaches have been developed, however, all these studies are based on hydrogels and scaffolds designed for adherent cells while MM cells are suspension growing cells. The main objective of this Thesis is to develop, optimize and validate a 3D culture platform, termed as microgel, based on microspheres suspended in a liquid media and coexisting with MM cells growing dynamically in suspension. Different microspheres with different functionalities were developed and characterized. We optimized a suspension polymerization protocol for the obtention of acrylates-based microspheres with two different compositions: with presence (10%) or absence (0%) of acrylic acid (AA). We obtained two different size distributions (< 60 and > 70 ¿m). FN was adsorbed on microsphere surface, while HA, collagen I and different peptide sequences were covalently grafted. Commercial Cytodex 1 microspheres were modified to adapt their characteristics to the microgel platform. Layer-by-layer (LbL) technics were used to introduce HA and chondroitin sulfate (CS) on Cytodex 1 surface. Therefore, a wide repertoire of microspheres has been generated to develop microgels. The culture conditions for the microgel platform were optimized and validated. Agitation is needed to keep microspheres and cells in suspension. Optimal culture conditions were 150 rpm of stirring speed using orbital shaker and < 60 ¿m diameter microspheres. Microgels with different compositions (0% AA, 10% AA) and functionalizations (none, HA, FN, collagen 1 and peptide sequences) allowed good proliferation of RPMI8226, U226 and MM1.S cells under 3D conditions. All the 3D systems respected the suspension growth pattern which appears as key factor for their good performance in 3D culture. In the initial DR studies, we found that MM cell line RPMI8226 cultured in microgels containing AA showed significantly higher resistance to dexamethasone than their conventional suspension cultures. And that MM cell lines RPMI8226, U226 and MM1.S cultured in microgels containing AA showed significantly higher resistance to bortezomib than their conventional suspension cultures. Thus, AA in the polymeric microsphere matrix showed a positive effect on the generation of DR in vitro and will require further studies. The scale-down of the system to work with smaller volumes of microspheres and reduced cell numbers has been validated, this is of great relevance for their clinical application. Finally, preliminary cultures with the cell line RPMI8226 have been performed with the Cytodex 1-based microgels. Cytodex 1 microspheres without modification had a negative effect on MM cells viability. LbL modification with the pairs chitosan/CS and chitosan/HA increased MM cells viability and proliferation. However, these systems did not respect the non-adherent character of MM cells. We have developed and validated a novel cell culture system based on a semi-solid 3D media defined by microspheres and MM cells which is specially designed for cells in suspension. It represents a versatile tool that should be further explored for the 3D culture of hematological malignancies and drug resistance studies in vitro. / Me gustaría agradecer al Servicio de Microscopía de la UPV y a sus técnicos por su valiosa ayuda con las técnicas de microscopía electrónica, a la Agencia Estatal de Investigación (proyecto PID2019-106099RB-C41 / AEI / 10.13039/501100011033) y al Ministerio de Ciencia, Innovación y Universidades (ayuda predoctoral FPU17/05810) que han financiado esta Tesis. / Clara Trujillo, S. (2022). Development of a 3D in Vitro Disease Model for Multiple Myeloma [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/186054 / TESIS

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Entretanto, tal fato não sugere ausência de violência, tensão e conflitos, sobretudo nas regiões de fronteira, em espaços onde o Estado não atua completamente. A violência estrutural, com a permanência de conflitos históricos, somados a questões ligadas ao cultivo, produção e tráfico de drogas, gera o desenvolvimento de economias paralelas, bem como gera deslocamentos internos e transnacionais, corroendo estruturas do Estado e de suas fronteiras. Acredita-se, portanto, que são as ameaças não tradicionais que oferecem obstáculos à consolidação da Zona de Paz na América do Sul. A presente pesquisa explora este fenômeno por meio da metodologia comparativa estrutural focada e tem a Colômbia, com suas questões ligadas ao conflito armado interno e às drogas, como estudo de caso. Nesse sentido, o espaço fronteiriço entre a Colômbia e a Venezuela se tornou, especialmente nos últimos 15 anos, um espaço profícuo para operações de grupos ligados ao tráfico de drogas e armas, bem como um lócus estratégico para o refúgio e retaguarda de grupos armados ilegais e paramilitares. Esta intensificação decorre, em grande parte, das operações militares colombianas de erradicação de cultivos, desmobilização de paramilitares, combate a grupos irregulares, por meio de operações de contra insurgência, ligadas ao Plano Colômbia, o que acabou por gerar um transbordamento de atividades transnacionais no espaço limítrofe, aqui denominado Zona Estratégica e Estrutural para os Trânsitos Ilícitos ZEETI. Tais regiões apresentam baixa governabilidade estatal, altos índices de corrupção, economia informal e exportam insegurança para o exterior. Por gerar constantes mobilizações das Forças Armadas na fronteira, bem como um ambiente de desconfiança e hostilidade entre os chefes de Estado, constata-se que as ZEETI, são para a América do Sul, o principal obstáculo atual para que se consolide uma efetiva Zona de Paz na região. / América del Sur ha observado durante dos décadas la ausencia de guerras entre Estados. Sin embargo, este hecho no sugiere ausencia de violencia, tensión y conflictos, sobre todo en las regiones fronterizas, en las zonas donde el Estado no actúa por completo. La violencia estructural, con la permanencia de conflictos históricos, además de las cuestiones relacionadas con el cultivo, la producción y el tráfico de drogas, genera el desarrollo de las economías paralelas y genera movimientos internos y transnacionales, erosionando las estructuras del estado y sus fronteras. Se cree, por lo tanto, son las amenazas no tradicionales que ofrecen obstáculos para la consolidación de la Zona de Paz en América del Sur. Esta investigación explora este fenómeno a través de la metodología comparativa estructural y Colombia, con sus temas de conflicto armado interno y las drogas, se presenta como caso de estudio. En este sentido, la zona fronteriza entre Colombia y Venezuela se ha convertido, sobre todo en los últimos 15 años, en un espacio fructífero para las operaciones de los grupos relacionados con el tráfico de drogas y armas, así como un lugar estratégico para el refugio de los grupos armados ilegales y paramilitares. Este incremento se debe, en gran parte, a las operaciones militares en Colombia para erradicar los cultivos, la desmovilización de los paramilitares que luchan grupos irregulares a través de operaciones de contrainsurgencia vinculados al Plan Colombia, que terminaron por generar un desbordamiento de las actividades transnacionales en el espacio limítrofe, aquí llamado zona estratégico y estructural de tránsito ilícito ZEETI. Estas regiones tienen una baja gobernabilidad del Estado, altos niveles de corrupción, economía informal y la inseguridad de exportación en el extranjero. En la recurrencia de generar la movilización constante de las fuerzas armadas en la frontera, así como un ambiente de desconfianza y hostilidad entre los jefes de estado, parece que el ZEETI representan, para América del Sur, el principal obstáculo actual para consolidar una Zona efectiva de Paz . / South America observed for two decades the absence of inter-State wars between the states. However, this fact does not suggest absence of violence, tension and conflicts, especially in border regions, in areas where the state does not act completely. Structural violence, with the permanence of historical conflicts, in addition to issues related to the cultivation, production and trafficking of drugs, generates the development of parallel economies and generates internal and transnational movements, eroding state and its borders structures. It is believed, therefore, are the non-traditional threats that provide obstacles to the consolidation of the Zone of Peace in South America. This research explores this phenomenon through the structural focused comparative methodology and has Colombia, with its issues of internal armed conflict and drugs, as a case study. In this sense, the border area between Colombia and Venezuela has become, especially in the last 15 years, a fruitful space for operations of groups linked to drug trafficking and weapons, as well as a strategic locus for refuge of illegal armed groups and paramilitaries. This increase is due, in large part, the Colombian military operations to eradicate crops, demobilization of paramilitaries fighting irregular groups through counter insurgency operations linked to Plan Colombia, which ended up generating an overflow of transnational activities in borderline space, here called Strategic and Structural Zone for Illicit Transit ZEETI. These regions have low state governance, high levels of corruption, informal economy and export insecurity abroad. In recurrence of generating constant mobilization of the armed forces at the border, as well as an environment of mistrust and hostility between the heads of state, it appears that the ZEETI represent to South America, the main current obstacle to consolidate an effective Zone of Peace.