Thèse (M.Sc.)--Université Laval, 2004. / Bibliogr.: f. 77-91. Publié aussi en version électronique.

Thèse (M.Sc.)--Université Laval, 2004. / Bibliogr.: f. 66-78. Publié aussi en version électronique.

Thèse (M.Sc.)--Université Laval, 2004. / Bibliogr.: f. [76]-95. Publié aussi en version électronique.

Thesis (doctoral)--Karolinska Institutet, Stockholm, 1982. / Extra t.p. with thesis statement inserted. Includes bibliographical references.

Les lymphocytes T (LT) CD8+ sont les médiateurs clés de la réponse immunitaire adaptative dirigée contre les pathogènes intracellulaires et les cellules tumorales. Lors d’une infection ou d’une immunisation, ils sont activés en réponse à leur antigène spécifique, prolifèrent et se différencient en cellules effectrices. Les LT CD8+ effecteurs participent à l’élimination du pathogène grâce à leurs fonctions cytotoxiques et à la production de cytokines. Les cellules activées subissent ensuite une phase de contraction à l’issue de laquelle ne subsistera qu’une petite population hétérogène de cellules mémoires qui contribuera à la protection à long terme de l’organisme lors d’infections ultérieures par le même pathogène. Les LT CD8+ peuvent également acquérir un phénotype de cellule mémoire dans des conditions physiologiques en l’absence de reconnaissance antigénique. Ces LT CD8+ mémoires non conventionnels peuvent apparaître dans le thymus (“LT CD8+ mémoires innés thymiques” (TIM) ou en périphérie (“LT CD8+ mémoires virtuels” (VM)). Ces sous-populations de LT CD8+ mémoires conventionnels et non conventionnels peuvent être activés sans reconnaissance antigénique par des cytokines inflammatoires, acquérir des fonctions cytotoxiques et produire des quantités importantes d’IFNγ. Elles contribuent ainsi à la première ligne de défense de l’organisme au même titre que d’autres cellules de l’immunité innée comme les cellules NK, NKT et γδ. Le programme transcriptionnel impliqué dans ces processus de différenciation alternative est mal connu. Eomesodermin (Eomes), un facteur de transcription apparenté à T-bet, joue un rôle central dans l’acquisition du phénotype mémoire et dans la fonction de ces cellules. Cependant, malgré le rôle crucial d’Eomes dans ce contexte, les signaux responsables de son induction et du maintien de son expression ne sont pas clairement établis. Dans ce travail, nous avons montré que les voies de signalisation induites par les interférons (IFN) de type I induisent directement l’expression d’Eomes tant dans les LT CD8+ naïfs que mémoires. Ce processus ne semble pas impacter la différenciation en cellules mémoires conventionnelles. Par contre, nous avons observé que l’absence de cette voie de signalisation affecte de façon importante le phénotype, la fonction et l’expansion au cours du vieillissement des cellules mémoires « virtuelles » (VM). De plus, les IFNs de type I induisent l’expansion de cette population in vivo et de façon dépendante de l’expression d’Eomes. Enfin, nous avons montré que le développement des LT CD8+ mémoires innés thymiques est régulé par les mêmes voies de signalisation induites par les IFNs de type I. Ainsi, ce travail révèle qu’en induisant Eomes, les IFNs de type I sont importants pour le développement, le maintien et la fonction des lymphocytes T CD8+ mémoires non conventionnels. De nombreuses questions subsistent concernant les conditions dans lesquelles se développent ces cellules, leurs fonctions dans la réponse immunitaire et leur présence possible chez l’humain. / Doctorat en Sciences médicales (Médecine) / info:eu-repo/semantics/nonPublished

La génération et/ou le recrutement de cellules immuno-suppressives fait partie des mécanismes majeurs utilisés par les tumeurs afin d’échapper aux réponses anti-tumorales du système immunitaire. Parmi les cellules capables d’inhiber les réponses anti-tumorales, les lymphocytes T CD4+ régulateurs et les macrophages de type II tiennent un rôle de premier ordre dans le contexte tumoral. Au cours de ma thèse, j’ai pu étudier l’impact de ces deux populations dans la suppression des réponses immunitaires anti-tumorales dans le modèle MT/ret de mélanome spontané métastatique. L’ensemble de nos résultats met en avant plusieurs niveaux d’immuno-suppression dans le modèle MT/ret. D’une part, les lymphocytes T CD4+ régulateurs, de par leur localisation dans les ganglions drainants et dans la peau, semblent impliqués dans la suppression des réponses anti-tumorales aux localisations et aux moments où les tumeurs nécessitent une forte inhibition des effecteurs anti-tumoraux. D’un autre côté, les macrophages de type II présentent, en plus de leurs capacités immuno-suppressives, des fonctions importantes pour la croissance et la dissémination tumorale justifiant leur localisation dans le microenvironnement tumoral. Dans un second temps, nos données suggèrent pour la première fois un rôle des monocytes Ly-6Cfort dans le contrôle tumoral via la lyse de ces dernières ou encore le maintien de la dormance des cellules tumorales disséminées. En conséquence, nous proposons de les ajouter à la liste des acteurs immunitaires directement impliqués lors des phases d’élimination et d’équilibre de la théorie de l’immuno-éditing. De plus, nous mettons en évidence leur inhibition par les lymphocytes T CD4+ régulateurs, ce qui n’avait pas non plus été décrit précédemment. Ceci nous pousse à suggérer de prendre plus en compte l’impact des lymphocytes T CD4+ régulateurs sur d’autres populations immunitaires que les lymphocytes T dans le contexte tumoral / Pas de résumé en anglais

La reprogrammation métabolique est un événement critique dans la fonction et la différenciation des lymphocytes T. Les lymphocytes T quiescents reposent principalement sur la phosphorylation oxydative qui leur permet de produire de grandes quantités d’énergie. Cependant, après activation antigénique, les lymphocytes T subissent une reprogrammation métabolique caractérisée par une augmentation de la glycolyse. Cette situation unique permet aux lymphocytes T activés de diriger rapidement les intermédiaires métaboliques vers la synthèse de macromolécules requises pour leur prolifération et leur fonction effectrice. Néanmoins, l’exposition à un antigène persistant modifie très fortement la fonction lymphocytaire. Les lymphocytes T CD4+ stimulés chroniquement développent un état de non-réponse caractérisé par une perte apparente de leur capacité proliférative et de leurs fonctions effectrices. Le récepteur inhibiteur PD-1 (Programmed cell Death-1) a été identifié comme un régulateur majeur de cet état de non-réponse. L’objectif de notre travail a été de caractériser le métabolisme énergétique des lymphocytes T CD4+ stimulés chroniquement par un antigène. Nous avons, pour cela, développé un modèle murin d’exposition antigénique chronique dans lequel des lymphocytes T CD4+ anti-mâle de souris femelles sont adoptivement transférés dans des receveurs mâles. L’analyse du profil protéomique des lymphocytes T anti-mâle stimulés chroniquement par leur antigène a montré que plusieurs enzymes impliquées dans le métabolisme cellulaire étaient sous-exprimées par ces cellules en comparaison avec des cellules naïves. Nous avons ensuite montré que ces lymphocytes T stimulés chroniquement présentaient un flux glycolytique bas et une capacité respiratoire limitée comparativement à des lymphocytes T effecteurs. De plus, l'expression du transporteur de glucose GLUT1 ainsi que la masse mitochondriale étaient réduites dans ces lymphocytes T CD4+ stimulés chroniquement. Suite à leur activation, ces cellules présentaient une capture de glucose et une synthèse d’ATP limitées. Le blocage de la voie inhibitrice PD-1/PD-L1 a permis de restaurer rapidement la fonction effectrice, et en particulier la sécrétion d’interféron gamma, des lymphocytes T CD4+ soumis à une stimulation antigénique chronique. Cependant, ce blocage n’a induit aucune reprogrammation métabolique en faveur de la glycolyse aérobique dans ces cellules. Par contre, l'absence de régulation médiée par PD-1 a entraîné une perturbation de la chaîne mitochondriale de transport des électrons, une augmentation de la production de superoxyde mitochondrial et une réduction de la survie et de la capacité effectrice des lymphocytes T CD4+ exposés à un antigène persistant. En conclusion, nos observations démontrent que l'inhibition médiée par PD-1 limite la production de superoxyde mitochondrial dans les lymphocytes T CD4+ stimulés chroniquement, améliorant ainsi leur viabilité et leur capacité à développer des fonctions effectrices. / Doctorat en Sciences biomédicales et pharmaceutiques (Médecine) / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Les lymphocytes T régulateurs (Treg) jouent un rôle primordial dans l'établissement de la tolérance au soi et le contrôle des réactions inflammatoires. Dans les modèles expérimentaux, ainsi qu'en pathologie humaine, un défaut de cette population de Treg favorise le développement d'affections auto-immunes, soulignant ainsi le potentiel thérapeutique de ces Treg. Afin de mieux exploiter ce potentiel, il est donc indispensable de caractériser les mécanismes moléculaires qui influencent le développement et les fonctions suppressives de ces cellules. Mon projet de thèse a donc consisté à caractériser à grande échelle le protéome des Treg via une approche protéomique de quantification sans marquage et de le comparer à celui des lymphocytes T conventionnels (Tconv) afin de définir une signature spécifique des Treg. L'analyse protéomique globale de ces deux sous-populations a été réalisée par nanoLC-MS/MS sur un spectromètre de masse de type orbitrap à séquençage rapide. L'optimisation du fractionnement peptidique via des colonnes chromatographiques de 50 cm en amont de l'analyse a permis d'augmenter la profondeur d'analyse du protéome jusqu'à plus de 3000 protéines par échantillon, et plus de 4000 protéines ont pu être identifiées à partir de l'analyse de 7 réplicats biologiques. En plus des protéines déjà décrites dans la littérature, de nombreuses protéines ont été mises en évidence comme étant surexprimées ou sous-exprimées dans les Treg par rapport aux Tconv, dont la fonction n'a jamais été étudiée dans les Treg. Parmi ces protéines, nous avons identifié la protéine Themis1 comme particulièrement sous-exprimée dans les Treg. En utilisant un modèle de souris transgénique surexprimant Themis1, nous avons pu étudier le rôle de cette protéine dans le contrôle des fonctions suppressives des Treg à l'aide de tests de suppression in vitro et dans un modèle in vivo de colite. Nos résultats montrent que la surexpression de Themis1 dans les Treg augmente leurs fonctions suppressives, suggérant que Themis1 régule positivement la fonction des Treg. Themis1 est une protéine impliquée dans le contrôle de la signalisation du récepteur T (TCR), ainsi elle pourrait être spécifiquement sous-exprimée dans ces cellules de façon à " freiner " la signalisation du récepteur T (TCR), afin d'éviter une fonction excessive des Treg qui pourrait avoir des effets délétères comme par exemple le développement de cancers. / Regulatory T cells (Treg) play a key role in establishing self-tolerance and controling inflammatory responses. In experimental models and in human diseases, a defect of this population promotes the development of autoimmune diseases, highlighting the therapeutic potential of Treg. To better exploit this potential, it is essential to characterize the molecular mechanisms that influence the development and the suppressive functions of these cells. My thesis project was therefore to perform a large-scale mass spectrometry study of the Treg proteome, and compare it to the proteome of conventionnal T cells (Tconv) using label-free quantitative methods, in order to identify new Treg markers and functionally important proteins. The comprehensive proteomic analysis of Treg and Tconv subpopulations was performed by single-run nanoLC-MS/MS on a fast-sequencing Orbitrap mass spectrometer. The optimization of peptide fractionation on 50 cm chromatographic columns increased the depth of the proteomic analysis to over 3000 proteins per sample, and in total more than 4000 proteins could be identified from the analysis of 7 biological replicates. Besides "historical" proteins that characterize Treg, many proteins have been identified as being over-expressed or under-expressed in Treg compared to Tconv, whose function has never been studied in Treg. Among them, we identified the Themis1 protein as particularly under-expressed in Treg. Using a transgenic mouse model overexpressing Themis1, we studied the role of this protein in the control of the suppressive functions of Treg, both in vitro through co-culture tests and in vivo in a mouse model of inflammatory bowel disease. Our results show that the overexpression of Themis1 in Treg increases their suppressive functions, suggesting that Themis1 positively regulates the function of Treg. Themis1 is a protein implicated in the control of T cell receptor (TCR) signaling. Thus Themis1 could be specifically under-expressed in these cells to tune down TCR signaling in order to moderate their suppressive action, and permit the development of efficient immune responses against pathogens and tumors.

La tolérance des lymphocytes TCD8+ est essentielle pour empêcher l'apparition d'auto-immunité mais représente un obstacle pour le développement de réponses cytotoxiques contre les tumeurs. La lymphodéplétion est utilisée comme adjuvant pour l'immunothérapie par transfert adoptif de cellules T cytotoxiques car elle améliore leur efficacité en favorisant la rupture de la tolérance périphérique. En condition lymphopénique aiguë, les lymphocytes T naïfs prolifèrent en absence apparente de stimulation antigénique et vont acquérir un phénotype et une fonctionnalité semblable aux cellules mémoires (LIP pour Lymphopenia Induced Proliferation). Les cellules mémoires ayant un seuil d'activation inférieur cellules naïves, il a été proposé que la différentiation des cellules TCD8+ potentiellement autoréactives en cellules de type mémoire dans des conditions lymphopéniques pouvait conduire à la rupture de la tolérance. Pendant ma thèse, j'ai étudié si la LIP est nécessaire pour la rupture de la tolérance croisée des cellules TCD8+ chez des souris transgéniques irradiées exprimant un antigène modèle dans les cellules β du pancréas. De manière surprenante, nous avons constaté que le blocage de la LIP ne permet pas d'inhiber l'apparition d'auto-réactivité : les lymphocytes TCD8+ qui ne transitent pas par un stade de différenciation de type mémoire parviennent à se différencier en cellules effectrices suite à la présentation croisée de l'antigène et à migrer vers le pancréas. Néanmoins, la LIP est requise pour induire de l'auto-réactivité lorsque la fréquence de lymphocytes T CD8+ est faible ; non pas à cause du déséquilibre de la population de cellules T régulatrices, mais dû à une nette augmentation du nombre de cellules TCD8+ autoréactives. Ainsi, bien que la LIP améliore les réponses auto- réactives des cellules TCD8+, la différentiation en cellules de type mémoire n'est pas indispensable pour la rupture de la tolérance croisée en condition lymphopénique induite par irradiation. / The immune system has evolved multiple mechanisms of peripheral tolerance to control CD8+ T cell responses and to prevent autoimmunity. However, they also represent a barrier for the development of cytotoxic responses against tumors. Lymphodepleting protocols are currently used as adjuvants for adoptive cytotoxic T cell immunotherapy because they enhance their potency. These protocols are thought to promote the breakdown of peripheral CD8+ T cell tolerance. Under acute lymphopenic conditions, naive T cells proliferate, in the apparent absence of antigenic stimulation at least in part due to a greater availability of the cytokine IL-7. Proliferating CD8+ T cells acquire a phenotype and functionality that is similar to memory cells and are termed memory-like cells. Since memory cells have a lower activation threshold than naïve cells, it has been proposed that differentiation of potentially autoreactive CD8+ T cells into memory-like cells under lymphopenic conditions could drive the breakdown of peripheral tolerance. Here we studied whether lymphopenia induced proliferation and differentiation are required for the breakdown of CD8+ T cell cross-tolerance in irradiated transgenic mice expressing a model antigen in the beta cells of the pancreas. Surprisingly, we found that blocking lymphopenia-induced proliferation and differentiation into memory-like cells did not prevent self-reactivity. CD8+ T cells that did not differentiate into memory-like cells still became effectors upon antigen cross-presentation and migrated to the site of antigen expression. Nonetheless, LIP did enhance CD8+ T cell mediated self-reactivity at low T cell frequencies. This effect could not be explained by a Treg imbalance but by a net increase in autoreactive CD8+ T cell numbers. Thus, although LIP enhances CD8+ T cell anti-self responses, differentiation into memory-like cells is not essential for the breakdown of cross-tolerance under the lymphopenic conditions provided by irradiation.

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