Le lymphome de Hodgkin est caractérisé, d’un point de vue histologique, par la présence de rares cellules tumorales nommées cellules de Reed et Sternberg, au sein d’un infiltrat cellulaire polymorphe, inflammatoire et réactionnel. Cette dernière résulte de la transformation tumorale de cellules lymphocytaires B qui acquièrent des propriétés d’échappement au système immun, de prolifération, de résistance à l’apoptose et une instabilité chromosomique. Néanmoins, la rareté des cellules tumorales, impliquant des problèmes techniques mais aussi de caractérisation des évènements primaires dans l’initiation de cette instabilité chromosomique, a été bien débattue dans la littérature. Mais les mécanismes impliqués dans l’instabilité chromosomique dans le lymphome de Hodgkin demeurent obscurs.La première partie de cette thèse a été consacrée à l’étude des mécanismes impliqués dans l’instabilité génomique du lymphome de Hodgkin via l’instabilité des microsatellites et l’instabilité chromosomique en utilisant 7 lignées de lymphome de Hodgkin. Nous avons montré pour la première fois l’implication des microsatellites dans l’instabilité génomique des lymphomes de Hodgkin (MSI-H (microsatellite instability-high) dans 3/7 lignées). De plus, nous avons montré que deux mécanismes favorisent l’émergence d’une instabilité chromosomique : le premier implique une instabilité télomérique qui est présente essentiellement dans les petites cellules tumorales induisant la formation des chromosomes dicentriques, des amplifications des gènes (Jak2 comme exemple) et des arrangements chromosomiques complexes. Le deuxième mécanisme est lié essentiellement à un défaut de réparation des cassures double-brin avec l’apparition des chromosomes dicentriques sporadiques et une fréquence importante des micronoyaux avec la formation des ponts anaphasiques.La deuxième partie de cette thèse a été consacrée à l’étude des mécanismes de maintenance des télomères dans les ganglions tumoraux du lymphome de Hodgkin (50 patients) comme dans les lignées tumorales. Nous avons montré qu’il existe une cohabitation entre les deux mécanismes importants de maintenance des télomères, l’activation de la télomérase d’une part et le mécanisme ALT (alternative lengthening of telomeres) d’autre part. Nous avons identifié la présence de petites cellules dans les ganglions hodgkiniens comme dans les lignées tumorales avec une forte activité de la télomérase par contre la cellule de Reed Sternberg est caractérisée par un profil ALT avec la présence des corps PML et une très faible activité de télomérase. La fréquence des cellules télomérase ou ALT varie d’un ganglion à un autre et d’une lignée à une autre. Un drastique raccourcissement télomérique a été observé dans les cellules exprimant la télomérase. Pour les cellules ALT, une grande hétérogénéité de la taille des télomères ainsi que la présence des chromosomes dicentriques sporadiques ont été détectées. Le suivi des patients à long terme pendant 10 ans, nous a permis d’établir une corrélation entre le profil ALT et la survenue de mortalités et de morbidités. De plus, l’étude de la radiosensibilité des lignées tumorales a montré que les lignées ALT sont plus résistantes que les lignées télomérases.La troisième partie de cette thèse a été consacrée à la validation de ces deux concepts d’instabilité chromosomique via l’instabilité télomérique et à celle des mécanismes de maintenance des télomères, en utilisant un modèle de lymphome de Hodgkin établi dans le laboratoire à partir de la lignée L428.Ces données auront une retombée clinique importante non seulement dans la compréhension et le traitement des lymphomes de Hodgkin mais aussi dans d’autres pathologies malignes. / The study of Hodgkin lymphoma (HL), with its unique microenvironment and long clinical outcomes, has provided exceptional insights into several areas of tumour biology. Findings in HL have not only improved our understanding of human carcinogenesis, but have also pioneered its translation into the clinic.Tumoral cells in HL, called Hodgkin and reed Sternberg cells (HRS), are characterized by a highly altered genomic landscape with a wide spectrum of genomic alterations, including somatic mutations, copy number alterations, complex chromosomal rearrangements, and aneuploidy. Moreover, the scarcity of HRS cells and the resulting technical problems of their in situ characterization, the primary cytogenetic events and the clonality of these possible aberrations has been a matter of debate in the past. As a consequence, a few accepted and established HL cell lines are widely used in the majority of research projects conducted worldwide.In this thesis, first we have first investigated the possible mechanisms underlying genomic instability including microsatellite and chromosomal instability in HL cell lines. We provide the first evidence that the genomic instability observed in HL is related to microsatellite instability and chromosomal instability related to two major mechanisms: first, telomere fusion leading to dicentric chromosomes formation and breakage/fusion/bridge (B/F/B) cycles involving the repeated fusion and breakage of chromosomes following the loss of telomeres in small cells associated with the lower expression of TRF2, as well as an elevated copy number of the Jak2 gene and the presence of nucleoplasmic bridges containing telomere and centromere sequences. The second mechanism is related to defective DNA repair via non homologous end-joining (NHEJ) repair with the presence of nucleoplasmic bridges without telomere or centromere sequences, accompanied by the micronucleus without centromere sequences and a higher frequency of sporadic dicentric chromosomes.The second part of this thesis has focused on investigating telomere maintenance mechanisms (TMMs) not only in HL cell lines but also in lymph nodes of HL patients. A telomerase-independent mechanism for TMM in HL has been proposed in the absence of detectable telomerase activity (TA) in some cases. The major finding of this work has been the demonstration of the presence of both telomerase and ALT mechanism in lymph nodes of HL patients as well as in HL cell lines. We have identified a subset of tumors with some small cells expressing telomerase and Reed Sternberg cells containing ALT-associated PML bodies. A significant correlation was observed between telomere length and TMMs. Drastic telomere shortening was observed in cells with telomerase expression and elevated heterogeneity of telomere length was found in ALT profile cells. Interestingly, complex chromosomal rearrangements, included sporadic dicentric formation, were observed in ALT profile cell lines. Interestingly, the relationship between TMMs and all-cause mortality and morbidity during 10 years of follow-up of HL patients using cox proportion hazard models demonstrated a poor clinical outcome for HL patients exhibiting primarily ALT mechanisms. Similarly, higher radiation sensitivity was observed for cell lines with high telomerase activity compared to cell lines with the ALT profile.

L'objectif de notre travail est de mieux comprendre le rôle de LMP1 et de ses variants délétés de 30 ou 69pb en C-terminal dans le développement du lymphome de Hodgkin (LH) chez les patients VIH+. Le séquençage de LMP1 dans des échantillons de sang total et de cellules oropharyngées de patients de la cohorte Lymphovir (LH/VIH+) et de deux populations contrôles (VIH+ et LH) a permis d'étudier la fréquence des variants de LMP1 in vivo. Ce travail a révélé que le variant LMP1-del30 semble plus fréquent chez les patients avec une immunosuppression modérée, durant laquelle l'incidence des LH est élevée. Par ailleurs, nous avons établi un modèle cellulaire dérivé de LH, exprimant LMP1 de façon inductible, montrant des différences d'expression des cytokines et de progression du cycle cellulaire en fonction des variants de LMP1. Notre travail supporte l'hypothèse d'une plus grande oncogénicité du variant LMP1-del30 et suggère qu'il pourrait être un facteur de risque de développer un LH. / The aim of this work was to improve our understanding of the role of LMP1 and its 30bp and 69bp deletion variants in the development of Hodgkin's lymphoma (HL) among HIV+ people. Blood and saliva samples were collected from HL/HIV+ patients recruited in the Lymphovir cohort, as well as in two control populations (HIV+ and HL). Next-Generation Sequencing allowed us to determine the frequency of LMP1 variants in these samples. This work showed that the del30-LMP1 variant seems to be more frequent in patients with a moderate immunosuppression, associated with a higher HL incidence. Besides, we established three HL-derived cell lines expressing WT-LMP1 or its variants and showed differences of cytokine expression and progression of the cell cycle depending on the variant. Our work supports the hypothesis of a greater oncogenicity of del30-LMP1 variant and suggests that it could be a risk factor for the development of HL.

Le risque de LH est augmenté en cas de déficit immunitaire acquis ou inné. Les déficits immunitaires innés associés à un risque accru de LH, sont les DICV (Déficit Immunitaire Commun Variable), XLP (Syndrome lymphoprolifératif lié au chromosome X) et ALPS (Syndrome lymphoprolifératif Autoimmun). L'objectif de notre travail était d'évaluer la prévalence de ces déficits immunitaires chez des enfants atteints de LH. Nous avons reçu, 395 prélèvements de patients atteints de LH au diagnostic. L'âge médian de la population étudiée est de 13 ans, allant de 3 à 18 ans. Le sex-ratio M/F est de 1.1. Il augmente à 3 au dessous de l'âge de 10 ans. Parmi les biopsies (n=84) qui ont été relues, 87% sont de type scléro-nodulaires (SN), 7% à cellularité mixte (CM) et 6% non spécifié. L'EBV est détecté in situ dans 23% des cas de LH. Les patients atteints de LH-EBV+ sont significativement plus jeunes que ceux atteints de LH-EBV- (p=3.10-4). Ce sont plus fréquemment des garçons que des filles (63% ; M/F : 1,7) et fréquemment de sous-type CM (40%). Enfin, ils ont une charge virale EBV significativement plus élevée (p=3.10-3) que les enfants qui ont un LH-EBV-.Parmi les 83 premiers enfants analysés, un immunophénotypage approfondi a montré une diminution de la population lymphocytaire par rapport aux témoins et une lymphopénie B fréquente (31 patients sur 83 soit 37% des patients). La lymphopénie B était corrélée aux facteurs pronostiques connus du LH. Dans un cas parmi les 31, une baisse des immunoglobulines a été mise en évidence ce qui est évocateur de DICV. Nous avons montré que dans les autres cas, les lymphopénies se corrigeaient à distance de la maladie. La recherche de profil cytokinique associé à ces lymphopénies (TGF, BAFF, IL-7) n'a pas permis de mettre en évidence de mécanisme physiopathologique simple pour expliquer ces lymphopénies. Nous émettons l'hypothèse qu'elles sont liées à l'exposition au contact des cellules tumorales à des signaux favorisant l'apopotose.En ce qui concerne la recherche d'autres déficits immunitaires innés, aucun cas évocateur de XLP n'a été mis en évidence sur la base de la quantification des lymphocytes NKT. Cinq cas parmi les 83 (6%) avaient une expansion de lymphocytes T DN (Lymphocytes TCRαβ CD4-CD8-) dans le sang périphérique. Des dosages de Fas ligand et d'IL-10 plasmatiques ont permis d'exclure un ALPS. Au total, nous n'avons pas pu affirmer de défaut qualitatif des sous-populations lymphocytaires évoquant les déficits immunitaires de type XLP et ALPS. Seule une lymphopénie B avec baisse des IgG est évocatrice de DICV. Nous avons étendu l'analyse à l'ensemble des patients (395patients) avec un contrôle à distance du diagnostic pour ceux qui étaient anormaux. Nous avons identifié 4 patients potentiellement atteints de DICV, 1,5%. Parallèlement, nous avons recherché un déficit de la réponse T anti-EBV par cytomètrie de flux et l'Elispot. L'étude de la réponse T anti-EBV par la cytométrie de flux, a montré une tendance vers une baisse de la production d'IL-2 par les CD4 et les CD8 de patients avec une charge virale EBV élevée en réponse à une stimulation par des peptides EBV en présence de lignées autologues. L'étude de la réponse T anti EBV par la technique d'ELISPOT sur 9 patients n'a pas montré globalement de déficit du contrôle de l'EBV sauf pour une jeune patiente de 10 ans ayant une charge virale EBV très élevée sans réponse T anti-EBV efficace. Les résultats que nous avons obtenus restent à approfondir, ce qui permettra d'enrichir les connaissances actuelles sur cette pathologie.

En 2016, les lymphoproliférations malignes [lymphome malin non hodgkinien (LNH) et lymphome de Hodgkin (LH)] restent un problème majeur chez les patients porteurs du VIH (PPVIH) car chaque année de 1 à 6 % de ces patients développent des lymphomes. Ces pathologies apparaissent actuellement comme une des principales causes de mortalité chez les PPVIH.Le virus d’Epstein-Barr (EBV), connu de longue date pour son pouvoir immortalisant des lymphocytes B et les propriétés oncogènes de certaines de ses protéines, apparait comme un cofacteur favorisant plus ou moins important de ces lymphomes chez les PPVIH. Quand le virus est présent dans la cellule tumorale ; on parle de cancer associé à l’EBV.Une des questions toujours en suspens est de savoir si la quantification de l’ADN viral EBV (charge virale) et le profil sérologique EBV dans le sang des PPVIH peuvent aider à mieux comprendre la physiopathologie de ces lymphomes et à mieux prendre en charge les PPVIH qui en souffrent.Ce travail de thèse effectuée en co-tutelle entre l’université de Grenoble-Alpes et l’université médicale d’Irkoutsk vise à contribuer à répondre à cette question.La partie bibliographique de cette thèse synthétise (i) les connaissances actuelles sur l’épidémiologie et la physiopathologie des LH (synthèse non publiée en français) et sur le rôle de l’EBV dans les LNH chez les PPVIH (article publié en russe dans « Siberian Medical Journal » en 2015); (ii) les études publiées sur la mesure de la charge virale et la sérologie EBV chez les PPVIH.La partie expérimentale de cette thèse est constituée de trois articles. Le premier article publié dans Journal of Clinical Microbiology en 2016 rapporte la démonstration que l’utilisation d’un standard international développé par l’OMS peut améliorer la précision de la mesure de la charge virale EBV dans le sang. Le deuxième article en cours d’écriture concerne les résultats préliminaires d’une étude de cohorte mise en place par l’ANRS qui suit des PVVIH atteints de LH. Dans cette étude, l’objectif principal était de savoir si la charge virale et la sérologie EBV lors de la découverte du LH pouvaient constituer des marqueurs pronostiques de cette maladie comme cela été décrit dans des LH survenant chez des patients non infectés par le VIH. Nos résultats préliminaires ne vont pas dans ce sens et ces marqueurs ne semblent donc pas utiles pour une amélioration de la prise en charge des LH chez les PPVIH. Le troisième article publié en russe en 2015 dans « HIV infection and Iimmunosuppressive Disorders » décrit l’épidémiologie des lymphomes chez PPVIH de l’Université Médicale d’Irkoutsk. Il montre une importante augmentation des LNH chez les PPVIH entre 2000 et 2014 liée à une épidémie VIH non contrôlée dans cette région de Russie. / In 2016, malignant lymphoproliférations [non Hodgkin's (NHL) and Hodgkin's lymphomas (HL)] remain a major concern in patients living with HIV (PLHIV), that each year 1-6% of these patients develop lymphomas. Lymphomas are the major cause of mortality in this population.Epstein-Bar Virus (EBV), long known for his immortalizing B cells power and oncogenic properties of some of its proteins, emerges as a cofactor favoring lymphoproliferations, more or less important, depending on the type of lymphoproliferation.One of the outstanding questions is whether the molecular and/or serological characterizations of EBV infection may help to better understand the pathophysiology of these diseases and better manage patients suffering from HIV-associated lymphomas.This dissertation under joint supervision between the University Grenoble Alpes and Irkutsk State Medical University aims to answer this question.The literature review of this thesis summarizes: (i) the role of EBV in LNH development in PLHIV (article published in Russian journal “Siberian Medical Journal” in 2015) and the current knowledge on the epidemiology and pathophysiology of Hodgkin's lymphoma (non published in French); (ii) published studies on the EBV viral load and serological evolutions in PLHIV.The experiments consist of three articles. The first article published in Journal of Clinical Microbiology in 2016, reports the demonstration that the application of international standard EBV developed by WHO can improve the quantification of EBV viral load in whole blood. The second study (in writing for publication) contains preliminary results of French National Agency for Research of HIV and hepatitis cohort study investigating PLHIV suffering from Hodgkin's lymphoma. The study focuses on whether the EBV viral load and serology of newly diagnosed lymphoma could provide prognostic information for this disease, as has been described in HIV-negative patients with HL. Our preliminary results don’t support this hypothesis; than EBV markers don’t can be used for best management of HL in PLHIV. The third study published in Russian Journal “HIV infection and Immunosuppressive disorders” (2015) describes the epidemiology of HIV-associated lymphoma in Irkutsk Oblast. The article shows that non-Hodgkin lymphoma incidence rates in PLHIV during 2007-2014 are probably due to HIV epidemic non-controlled in this Russian region.

Le risque de LH est augmenté en cas de déficit immunitaire acquis ou inné. Les déficits immunitaires innés associés à un risque accru de LH, sont les DICV (Déficit Immunitaire Commun Variable), XLP (Syndrome lymphoprolifératif lié au chromosome X) et ALPS (Syndrome lymphoprolifératif Autoimmun). L’objectif de notre travail était d’évaluer la prévalence de ces déficits immunitaires chez des enfants atteints de LH. Nous avons reçu, 395 prélèvements de patients atteints de LH au diagnostic. L’âge médian de la population étudiée est de 13 ans, allant de 3 à 18 ans. Le sex-ratio M/F est de 1.1. Il augmente à 3 au dessous de l’âge de 10 ans. Parmi les biopsies (n=84) qui ont été relues, 87% sont de type scléro-nodulaires (SN), 7% à cellularité mixte (CM) et 6% non spécifié. L’EBV est détecté in situ dans 23% des cas de LH. Les patients atteints de LH-EBV+ sont significativement plus jeunes que ceux atteints de LH-EBV- (p=3.10-4). Ce sont plus fréquemment des garçons que des filles (63% ; M/F : 1,7) et fréquemment de sous-type CM (40%). Enfin, ils ont une charge virale EBV significativement plus élevée (p=3.10-3) que les enfants qui ont un LH-EBV-.Parmi les 83 premiers enfants analysés, un immunophénotypage approfondi a montré une diminution de la population lymphocytaire par rapport aux témoins et une lymphopénie B fréquente (31 patients sur 83 soit 37% des patients). La lymphopénie B était corrélée aux facteurs pronostiques connus du LH. Dans un cas parmi les 31, une baisse des immunoglobulines a été mise en évidence ce qui est évocateur de DICV. Nous avons montré que dans les autres cas, les lymphopénies se corrigeaient à distance de la maladie. La recherche de profil cytokinique associé à ces lymphopénies (TGF, BAFF, IL-7) n’a pas permis de mettre en évidence de mécanisme physiopathologique simple pour expliquer ces lymphopénies. Nous émettons l’hypothèse qu’elles sont liées à l’exposition au contact des cellules tumorales à des signaux favorisant l’apopotose.En ce qui concerne la recherche d’autres déficits immunitaires innés, aucun cas évocateur de XLP n’a été mis en évidence sur la base de la quantification des lymphocytes NKT. Cinq cas parmi les 83 (6%) avaient une expansion de lymphocytes T DN (Lymphocytes TCRαβ CD4-CD8-) dans le sang périphérique. Des dosages de Fas ligand et d’IL-10 plasmatiques ont permis d’exclure un ALPS. Au total, nous n’avons pas pu affirmer de défaut qualitatif des sous-populations lymphocytaires évoquant les déficits immunitaires de type XLP et ALPS. Seule une lymphopénie B avec baisse des IgG est évocatrice de DICV. Nous avons étendu l’analyse à l’ensemble des patients (395patients) avec un contrôle à distance du diagnostic pour ceux qui étaient anormaux. Nous avons identifié 4 patients potentiellement atteints de DICV, 1,5%. Parallèlement, nous avons recherché un déficit de la réponse T anti-EBV par cytomètrie de flux et l’Elispot. L’étude de la réponse T anti-EBV par la cytométrie de flux, a montré une tendance vers une baisse de la production d’IL-2 par les CD4 et les CD8 de patients avec une charge virale EBV élevée en réponse à une stimulation par des peptides EBV en présence de lignées autologues. L’étude de la réponse T anti EBV par la technique d’ELISPOT sur 9 patients n’a pas montré globalement de déficit du contrôle de l’EBV sauf pour une jeune patiente de 10 ans ayant une charge virale EBV très élevée sans réponse T anti-EBV efficace. Les résultats que nous avons obtenus restent à approfondir, ce qui permettra d’enrichir les connaissances actuelles sur cette pathologie. / Hodgkin’s Lymphoma (HL) is one of the most frequent lymphomas occurring in childhood. In young children, there is a high predominance in boys and frequent association with Epstein-Barr Virus (EBV). Cohort studies have shown that patients affected by several immune deficiency syndromes - e.g. X-linked lymphoproliferative syndrome (XLP), functional deficit of Fas/FasL pathway and common variable immunodeficiency (CVID) - are risk factors of HL. We intend to search for qualitative and quantitative immune deficiencies as susceptibility factors to child's HL in a prospective study related to Euronet –PHL C1 protocol. Eighty-three patients at diagnosis of HL have been analysed. Median age of the study population is 13 years, (5-18 years). Gender-ratio M/F is 1.1 with a larger male predominance before the age of 10 (gender-ratio of 3). The search for a defect of NKT population that would be suggesting of XLP was negative in all patients. A moderate expansion of circulating TCRαβ+ double negative cells (DNT) has been detected in 5 patients. This expansion has been further explored in the hypothesis of a defect of Fas/FasL pathway by plasmatic quantification of Fas ligand and Il-10. This led to the exclusionof the diagnosis of ALPS. An unexpected high frequency of B-cell lymphopenia has been detected in 31 out of 83 patients (37%). Peripheral B cell lymphopenia was associated with the following poor prognostic factors: advanced stages (p<0.04), low hemoglobin (p<0.06) and B symptoms (p<0.01). B-cell lymphopenia was not statistically correlated with morphology (subtype, amount of tumor cells and necrosis). Remarkably, B-lymphocytic counts were significantly higher in patients with in situ EBV (<0.05).Only a B lymphopenia with low IgG level suggesting DICV was detected. We extended the analysis to all the 395 patients included in the protocol EURONET, so we identified 4 patients with CVID. These cases will be further explored by molecular analyses. In parallel, the specific T-cells response against EBV was studied by flow cytometry in 15 patients and ELISPOT assay in 9 patients with HL. Flow cytometry , suggested a decrease in production of IL-2 by CD4 T cells in patients with high EBV viral load in response to EBV latent and lytic-cycle peptides and autologous lymphoblatoid cells lines compared to controls or patients with LH-EBV-. The ELISPOT-IFNγ assay was used to determine the frequency of T cells that produced IFNγ in response to peptides. One patient demonstrated inappropriate EBV-specific T-cell IFNγ production (<10 IFNγ secreted T cells and >1,000 EBV copies per 250000 PBMCs). These cases will be further explored by molecular analyses.Our findings confirm the known epidemiological data of HL now mainly associated to NS subtype in children and adolescents and EBV status in HL at this age. We show that peripheral B cell lymphopenia in paediatric and adolescent HL patients is frequent and associated with poor prognosis factors. We confirm the association between CVID and HL.

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