Angiogenesis is the process of new blood vessel growth from preexisting vessels. This process relies on the activity of Vascular Endothelial Growth Factor Receptor-2 (VEGFR-2) and occurs in both normal and pathological tissues. Angiogenesis is often dysregulated in diseases such as cancer and many efforts have been made to treat such diseases by targeting the VEGFR-2 pathway. VEGFR-2 is activated upon ligand binding and subsequent autophosphorylation of tyrosine residues in the kinase domain, which leads to endothelial cell survival, proliferation, and growth – all of which are required for angiogenesis to occur. It was previously demonstrated that methylation of VEGFR-2 at Lys1041 enhanced its tyrosine autophosphorylation and is required for VEGFR-2 mediated angiogenesis in zebrafish and tumor growth in mouse. However, the Lysine Methyltransferase (KMT) involved in the methylation of VEGFR-2 remains unknown. This study aimed to identify the KMT involved in the methylation of VEGFR-2. We have identified Enhancer of zeste homolog 2 (EZH2) as the KMT likely responsible for catalyzing methylation of K1041 on VEGFR-2. Over-expression of EZH2 was found to increase phosphorylation of Tyr1054, one of the required phosphorylation sites for VEGFR-2 activation, in whole cell lysates and VEGFR-2 purified by immunoprecipitation. The effect of over-expression of EZH2 in the phosphorylation of VEGFR-2 at Tyr1054 was dose-dependent - increasing concentrations of EZH2 resulted in increasing phosphorylation of VEGFR-2 at Tyr1054. Moreover, we determined that EZH2 physically interacts with VEGFR-2 as demonstrated by co-immunoprecipitation in vitro GST-pulldown assays. The C-terminus of EZH2 (amino acids 371-746), physically interacted with VEGFR-2. Taken together, we have identified EZH2 as a candidate KMT involved in the methylation of Lys1041, which increases phosphorylation of VEGFR-2 at Tyr1054. / 2020-07-03T00:00:00Z

Indiana University-Purdue University Indianapolis (IUPUI) / The nuclear protein SETMAR has been reported to be involved in many processes such as non-homologous end joining (NHEJ), di-methylation (arguably) of K36 of histone H3, restart of stalled replication forks, chromosome decatenation, enhancing of TOPII inhibitors which results in resistance to chemotherapeutics in cancer patients, etc. All these purported functions are impossible to execute without interaction with other proteins. It is established that SETMAR binds specifically to DNA at terminal inverted repeat sequences and can loop DNA. This DNA sequence specific pull-down exploits this attribute to identify possible protein interactors of SETMAR. As a result of this experiment several proteins have been identified for further research: BAG2, c12orf45, PPIA, XRCC5/6, and ZBTB43, all of which are found in higher statistical abundances in full length SETMAR samples.

Alors que les méthylations sur différents résidus lysine des histones (par exemple H3K4, H3K27 et H3K36) sont bien connues pour exercer diverses fonctions biologiques, leurs interactions et/ou leur mode d’actions demeurent encore peu caractérisés. Par la génétique et des outils de biologie moléculaire, nous visons à étudier les rôles et interconnections des méthylations des H3K4, H3K27 et H3K36 dans la transcription, la croissance de la plante et la régulation du développement chez Arabidopsis thaliana.La première partie de ma thèse est centrée sur les rôles et interconnections des méthylations de H3K4 and K36.ATX1 et ATX2 sont des méthyltransférases de H3K4 alors que SDG8 est une méthyltransférase de H3K36.L’analyse de doubles mutants a révélé que sdg8 est dominant sur atx1 et atx2 pour le temps de floraison et larégulation de la prolifération cellulaire. La triméthylation de H3K36 (H3K36me3) est partiellement dépendante de H3K4me3 mais non-réciproquement. SDG25 a une double activité H3K4me3 et H3K36me3 et les déméthylases de H3K4, LDL1 et LDL2, sont des antagonistes de l’activité de SDG25. Les triples mutants sdg25ldl1ldl2 fleurissent plus tôt que la lignée sauvage, mais plus tard que sdg25 et montrent une augmentation de taille de cellule similaire à celle des mutants ldl1ldl2.La deuxième partie de ma thèse se concentre sur les rôles et interconnections entre les méthylations H3K4/K36 et H3K27. CLF catalyse les H3K27me3 au sein du complexe PRC2. Les doubles mutants sdg8clf etsdg25clf fleurissent plus tôt que les mutants simples et montrent un nombre réduit de cellules par feuille. Unniveau plus élevé de H3K4me3 et dans une moindre mesure de H3K36me3 a été observé dans le cas de déposition de H3K27me3 réduite, et de la même façon, une déposition de H3K4me3/H3K36me3 réduite augmente aussi le niveau de H3K27me3. Distinct du rôle antagoniste rapporté auparavant entre CLF et ATX1,CLF n’a pas montré d’antagonisme avec SDG25 ou SDG8.La dernière partie de ma thèse est centrée sur le mécanisme de SDG26 dans la régulation du temps de floraison. Mes résultats ont montré que SDG26 est une méthyltransférase H3K4 et/ou H3K36 spécifique de la chromatine de SOC1, un intégrateur de la floraison actif. De manière similaire à SDG25 et SDG8, SDG26 ne travaillait pas de façon antagoniste avec CLF. L’analyse de doubles mutants a révélé que sdg26 domine atx2mais sdg25, atx1 and clf est dominant sur sdg26 pours le temps de floraison et la régulation de la prolifération cellulaire. Les triples mutants sdg26ldl1ldl2 fleurissaient encore plus tard que les mutants sdg26 et ldl1ldl2 et a révélé que sdg26 est dominant sur ldl1ldl2 lors de la régulation de la prolifération cellulaire. Les analysesd’interaction avec les autres composants de PRC2, VEL1 et VRN5, ont révélé que sdg26vel1 et sdg26vrn5 fleurissaient encore plus tard que les mutants simples dans des conditions de jours courts et de vernalisation. Ensemble, mes résultats révèlent des couches additionnelles de complexité de redondance et de diversification de fonctions entre et au sein des méthyltransférases et déméthylases, pour la transcription, le temps de floraison et la régulation de la prolifération cellulaire chez Arabidopsis. / While methylations at different lysine residues of histones (e.g. H3K4, H3K27 and H3K36) are well known to exert diverse biological functions, their interactions and/or ensemble-actions remain poorly characterized so far.Using genetic and molecular biology tools, we aim to investigate roles and ‘crosstalks’ of H3K4, H3K27 andH3K36 methylations in transcription and plant growth and development regulation in Arabidopsis thaliana.The first part of my thesis focuses on the roles and crosstalks between H3K4 and K36 methylations.ATX1 and ATX2 are H3K4 methyltransferases while SDG8 is a H3K36 methyltransferase. Double mutant analysis revealed that sdg8 dominates over atx1 and atx2 in flowering time and cell proliferation regulation.H3K36 trimethylation (H3K36me3) is partially dependent on H3K4me3 but not vice versa. SDG25 has a dualH3K4me3 and H3K36me3 activity and the H3K4-demethylases LDL1 and LDL2 antagonize SDG25 activity.The sdg25ldl1ldl2 triple mutants flowered earlier than wild type but later than sdg25 and showed an increased cell size similarly to ldl1ldl2 mutantsThe second part of my thesis focuses on the roles and crosstalks between H3K4/K36 and H3K27methylations. CLF within PRC2 complex catalyzes H3K27me3. The sdg8clf and sdg25clf double mutants flowered earlier than the single mutants and showed a reduced number of cells per leaf. An increased level ofH3K4me3 and to a less extent H3K36me3 was observed upon impaired H3K27me3 deposition, and similarly impaired H3K4me3/H3K36me3 deposition also enhanced H3K27me3 level. Distinct from previously reported antagonistic role between CLF and ATX1, CLF did not show antagonism with SDG25 or SDG8.The last part of my thesis focuses on mechanism of SDG26 in flowering time regulation. My result showed that SDG26 is a H3K4 and/or H3K36 methyltransferase specific at chromatin of SOC1, an activeflowering integrator. Similarly to SDG25 and SDG8, SDG26 did not work antagonistically with CLF. Double mutant analysis revealed that sdg26 dominates over atx2 while sdg25, atx1 and clf dominate over sdg26 inflowering time and cell proliferation regulation. The sdg26ldl1ldl2 triple mutants flowered even later than thesdg26 and ldl1ldl2 mutants and showed that sdg26 dominates over ldl1ldl2 in cell proliferation regulation.Interaction analysis with the other PRC2 components VEL1 and VRN5 revealed that sdg26vel1 and sdg26vrn5flowered even later than the single mutants under short day and vernalization conditions.Together, my study revealed additional layers of complexity of overlap and non-overlap functions between and within methyltransferases and demethylases in transcription, flowering time and cell proliferation regulation in Arabidopsis.

La réponse et l’adaptation des plantes à un stress métallique mettent en jeu de nombreux mécanismes afin de limiter les effets néfastes des éléments toxiques. Bien que certains de ces mécanismes soient bien caractérisés, de nombreux acteurs cellulaires et moléculaires restent à identifier pour mieux comprendre la diversité des stratégies mises en œuvre dans ces processus complexes et vitaux pour les plantes.Dans un premier temps, nous nous sommes intéressés au rôle de deux modifications post-traductionnelles, la phosphorylation et la méthylation des protéines non-histone dans la réponse à un stress induit par deux éléments non essentiels et toxiques, le cadmium (Cd) et l’uranium (U). Nous avons analysé la dynamique de ces modifications chez trois espèces du genre Arabidopsis : A. thaliana et A. lyrata, deux espèces sensibles au Cd, et A. halleri, espèce naturellement capable de tolérer et d’hyper-accumuler ce métal toxique dans ses feuilles. En utilisant une combinaison d’analyses par Western blot et par spectrométrie de masse nous avons montré que les patterns de méthylation des protéines changent au cours de stress métalliques. Puis, nous avons analysé l’expression des gènes codant les enzymes impliquées dans les réactions de phosphorylation et méthylation des protéines dans différentes conditions de stress. Ces analyses ont montré qu’un grand nombre de protéines kinases sont régulés au niveau transcriptionnel par un stress métallique tandis que seules quelques une en ce qui concerne la méthylation. Pour finir, nous avons mis en place un criblage génétique de mutants d’A. thaliana et identifié deux gènes codant des protéines lysine méthyltransférases impliqués dans la tolérance au Cd.Dans un deuxième temps, nous avons étudié les mécanismes cellulaires de la réponse du système racinaire d’A. thaliana lors d’une exposition à l’U. L’utilisation de différents systèmes rapporteurs et la mesure de différents paramètres physiologiques nous ont permis de mettre en évidence que l’architecture racinaire est fortement modulée en réponse à l’U et ceci de façon dose dépendante. Cet effet est lié à l’inhibition du cycle cellulaire et à la synthèse d’espèces réactives de l’oxygène et d’oxyde nitrique dont l’accumulation provoque la mort cellulaire. Ces changements sont associés à une perturbation du transport et de la distribution de l’auxine dans les racines. Ces événements sont temporellement corrélés avec l’accumulation de polymères de défense (callose et lignine) impliqués dans l’imperméabilisation des cellules et des parois. Cette étude confirme enfin que le stress induit par l’U est intimement lié à une perturbation de l’homéostasie de certains macronutriments (phosphate et fer) et partage les cascades de signalisation d’une carence en phosphate.Ce travail met en évidence des mécanismes de réponse et d’adaptation aux métaux toxiques à travers la régulation fine des phénomènes de méthylation des protéines non-histone et l’identification de processus cellulaires impliqués dans la réponse à la toxicité de l’U dans le système racinaire. / Plant response and adaptation to metallic stress are involving numerous mechanisms limiting the toxic effect of metals. Although a large number of these mechanisms are well characterized, many processes are in need to be identified in order to have a better understanding of strategies involved in plant response to toxic elements.In first instance, we investigated the role of two post-translational modifications, phosphorylation and methylation of non-histone proteins in response to stress induced by two toxic metals, cadmium and uranium. We analyzed the dynamic of these modifications in three species of Arabidopsis: A. thaliana, A. lyrata two species sensitive to cadmium and A. halleri, a species which naturally tolerate and hyperaccumulate toxic metals in her leaves. By using Western blots and mass spectrometry in parallel, we showed that lysine methylation pattern were changing during metallic stresses. Next, we analyzed the gene expression of enzymes involved in phosphorylation and lysine methylation processes in plants exposed to different adverse conditions. These analyses showed that numerous kinases expressions were differentially regulated in response to metallic stress. Concerning protein lysine methyltransferases, only a few enzymes were differentially regulated. Finally, through a mutant genetic screening we identified two genes coding for protein lysine methyltransferases involved in tolerance to a stress induced by cadmium.Secondly, we studied the physiological and cellular processes involved in the response of A. thaliana root system to uranium. Through the utilization of several reporters and the measure of physiological parameters, we demonstrated that the root architecture was strongly modulated in response to a stress induced by uranium and that in a dose dependent manner. These effects are linked to a cell cycle inhibition and the synthesis and accumulation of reactive oxygen species and nitric oxyde wich participated in the root apex cell death. These changes were associated with perturbation in auxin transport and distribution at the root apex and were temporally correlated to the deposition of defense polymers (callose and lignin) involved in cell proofing and cell wall stiffness. This study is confirming the fact that uranium induced stress is intimately linked to a disruption of phosphate and iron homeostasis. Furthermore, uranium-signaling cascade are sharing a part of the phosphate starvation-signaling cascade.Together, these two studies are revealing mechanisms involved in plant response and adaptation to metallic trace elements through the thin tuning of non-histone methylation and the identification of cellular process involved in the toxicity of uranium in roots.

Proteinmethylierung spielt eine immer größere Rolle in der Regulierung zellulärer Prozesse. Die Entwicklung effizienter proteomweiter Methoden zur Detektion von Methylierung auf Proteinen ist limitiert und technisch schwierig. In dieser Arbeit haben wir einen neuen Hefe-Zwei-Hybrid-Ansatz (Y2H) entwickelt, der Proteine, die miteinander wechselwirken, mit Hilfe von Sequenzierungen der zweiten Generation identifiziert (Y2H-Seq). Der neue Y2H-Seq-Ansatz wurde systematisch mit dem Y2H-Seq-Ansatz verglichen. Dafür wurde ein Bait-Set von 8 Protein-Arginin-Methyltransferasen, 17 Protein-Lysin-Methyltransferasen und 10 Demethylasen gegen 14,268 Prey-Proteine getestet. Der Y2H-Seq-Ansatz ist weniger arbeitsintensiv, hat eine höhere Sensitivität als der Standard Y2H-Matrix-Ansatz und ist deshalb besonders geeignet, um schwache Interaktionen zwischen Substraten und Protein-Methyltransferasen zu detektieren. Insgesamt wurden 523 Wechselwirkungen zwischen 22 Bait-Proteinen und 324 Prey-Pr oteinen etabliert, darunter 11 bekannte Methyltransferasen-Substrate. Netzwerkanalysen zeigen, dass Methyltransferasen bevorzugt mit Transkriptionsregulatoren, DNA- und RNA-Bindeproteinen wechselwirken. Diese Daten repräsentieren das erste proteomweite Wechselwirkungsnetzwerk über Protein-Methyltransferasen und dienen als Ressource für neue potentielle Methylierungssubstrate. In einem in vitro Methylierungsassay wurden exemplarisch mit Hilfe massenspektrometrischer Analysen die methylierten Aminosäurereste einiger Kandidatenproteine bestimmt. Von neun getesteten Proteinen waren sieben methyliert, zu denen gehören SPIN2B, DNAJA3, QKI, SAMD3, OFCC1, SYNCRIP und WDR42A. Wahrscheinlich sind viele Methylierungssubstrate im Netzwerk vorhanden. Das vorgestellte Protein-Protein-Wechselwirkungsnetzwerk zeigt, dass Proteinmethylierung sehr unterschiedliche zelluläre Prozesse beeinflusst und ermöglicht die Aufstellung neuer Hypothesen über die Regulierung Molekularer Mechanismen durch Methylierung. / Protein methylation on arginine and lysine residues is a largely unexplored posttranslational modification which regulates diverse cellular processes. The development of efficient proteome-wide approaches for detecting protein methylation is limited and technically challenging. We developed a novel workload reduced yeast-two hybrid (Y2H) approach to detect protein-protein interactions utilizing second generation sequencing. The novel Y2H-seq approach was systematically evaluated against our state of the art Y2H-matrix screening approach and used to screen 8 protein arginine methyltransferases, 17 protein lysine methyltransferases and 10 demethylases against a set of 14,268 proteins. Comparison of the two approaches revealed a higher sensitivity of the new Y2H-seq approach. The increased sampling rate of the Y2H-seq approach is advantageous when assaying transient interactions between substrates and methyltransferases. Overall 523 interactions between 22 bait proteins and 324 prey proteins were identified including 11 proteins known to be methylated. Network analysis revealed enrichment of transcription regulator activity, DNA- and RNA-binding function of proteins interacting with protein methyltransferases. The dataset represents the first proteome-wide interaction network of enzymes involved in methylation and provides a comprehensively annotated resource of potential new methylation substrates. An in vitro methylation assay coupled to mass spectrometry revealed amino acid methylation of candidate proteins. Seven of nine proteins tested were methylated including SPIN2B, DNAJA3, QKI, SAMD3, OFCC1, SYNCRIP and WDR42A indicating that the interaction network is likely to contain many putative methyltransferase substrate pairs. The presented protein-protein interaction network demonstrates that protein methylation is involved in diverse cellular processes and can inform hypothesis driven investigation into molecular mechanisms regulated through methylation.