Les infections respiratoires sont une cause importante de morbidité et de mortalité à travers le monde. D’ailleurs, de nouveaux virus respiratoires sont continuellement identifiés, dont le metapneumovirus humain (hMPV) en 2001. Ce virus est maintenant reconnu comme une cause fréquente d’infections respiratoires sévères chez les jeunes enfants, telles que des pneumonies et des bronchiolites. Il se classe d’ailleurs en 2e ou 3e position après le virus respiratoire syncytial, en alternance avec les virus influenza. La majorité des infections sévères causées par le hMPV touche les individus dont le système immunitaire est plus faible c’est-à-dire les jeunes enfants, les personnes âgées et les sujets immunosupprimés. Diverses études démontrent qu’une infection respiratoire virale sévère en bas âge peut prédisposer un enfant à développer de l’asthme durant sa vie. Malgré cela, les médecins n’ont toujours aucun vaccin ni traitement à leur disposition. L’analyse du génome et de la fonction des protéines du hMPV nous offre maintenant des pistes prometteuses pour le développement d’antiviraux. De plus, un modèle murin bien établi permet désormais l’étude in vivo de ces antiviraux. Ce projet de doctorat avait donc comme objectif de développer des approches thérapeutiques pour contrer les infections causées par le hMPV. Pour ce faire, deux étapes de l’infection ont été ciblées : l’entrée du virus dans la cellule hôte par fusion, et la réplication du génome viral à l’intérieur de la cellule infectée. La première molécule identifiée avec succès est un inhibiteur de fusion, le peptide HRA2, qui s’est révélé hautement efficace in vitro et in vivo contre le hMPV. Le deuxième groupe de molécules est formé de petits ARN interférants (siRNAs) dirigés contre des gènes essentiels à la réplication du hMPV. L’interférence à l’ARN est d’ailleurs une discipline en plein essor depuis sa récente identification. Deux siRNAs ciblant la nucléoprotéine et la phosphoprotéine du hMPV se sont avérés extrêmement actifs contre ce virus in vitro et des résultats très encourageants ont été obtenus chez la souris. / Respiratory infections are a leading cause of morbidity and mortality worldwide. New viruses are constantly discovered and one of them, the human Metapneumovirus (hMPV), was identified in 2001. hMPV causes upper and lower respiratory infections ranging from cold- or flu-like illnesses to more severe and life-threatening infections such as pneumonia and bronchiolitis. hMPV is only second or third to human respiratory syncytial virus in frequency and sometimes as frequent as human influenza viruses in causing respiratory infections. The majority of severe infections caused by hMPV are seen in individuals having the weakest immune system such as young children, elderly and immunocompromised subjects. Many studies tend to demonstrate that severe viral respiratory infection during childhood can lead to asthma development later in life. Unfortunately, physicians have no vaccine or treatment to fight against severe hMPV infections. Genome and protein fonction analyses are offering promising avenues for the development of effective antivirals. Moreover, hMPV pathogenesis has been described in a murine model which now offers a convenient way to evaluate candidate molecules. This PhD project main goal was therefore to design new molecules against hMPV infections. For that matter, two steps of hMPV replication cycle were targeted, i.e., virus entry into the host cell which happens by a fusion mechanism, and viral genome replication inside the infected cell. The first molecule successfully identified is a fusion inhibitor, the HRA2 peptide that showed highly potent activity against hMPV in vitro but also in vivo. The second group of molecules corresponds to small interfering RNAs (siRNAs) targeting genes essential for hMPV replication. RNA interference has been a rapidly growing field since its first description in the 1990’s. Here, we identified two highly effective siRNAs against hMPV in vitro which target the nucleoprotein and phosphoprotein. Evaluation of these siRNAs in a murine model of hMPV infection also showed great possibilities.

Le métapneumovirus humain (HMPV) est un virus responsable des infections aiguës des voies respiratoires chez l’enfant ainsi que chez l’adulte. Dans les populations à risque élevée, comme les jeunes enfants, les personnes âgées et les patients immuno-supprimés, le HMPV entraîne une morbidité et une mortalité importante. La pathogenèse de l'infection par le HMPV reste largement inconnue, mais des modèles animaux qui permettent l'étude de cette pathogenèse ont été développés. En effet, le modèle des souris BALB/c a déjà été développé dans le laboratoire du Dr Guy Boivin. Ce modèle murin nous a permis de démontrer que la protéine de fusion (F) contribue à la capacité réplicative du virus, mais qu’elle n’est pas la seule protéine responsable de la virulence de ce virus. De plus, nous avons démontré que le récepteur activé par les protéases (PAR1) contribue de manière significative à la pathogenèse du HMPV. Actuellement, aucun vaccin ou modalité thérapeutique spécifique contre le HMPV sont disponibles. Trois facteurs principaux ont entravé le développement d'un vaccin sûr et efficace contre le HMPV; 1) Le précédent d’une maladie accrue associée à l'utilisation de vaccins inactivées contre la rougeole et le virus respiratoire syncytial (HRSV) et la démonstration d’une maladie accrue suite à une vaccination avec le HMPV inactivé chez les animaux. 2) Le manque de protection à long terme induite par les vaccins contre le HMPV chez les animaux. 3) Notre compréhension limitée des contributions individuelles des protéines virales dans le développement de l'immunité contre le HMPV. En développant un vaccin sous-unitaire comprenant de la protéine F et la protéine de la matrice (M), nous avons démontré que la protéine M contribue de manière significative à la protection chez la souris immunisée. / Human metapneumovirus (HMPV) is an important etiological agent of acute respiratory tract infection in both children and adults. In high-risk populations, such as infants, elderly individuals and immunocompromised patients, HMPV causes significant morbidity and mortality. The pathogenesis of HMPV infection remains largely unknown, but animal models of HMPV infection have been developed that allow for the study of such pathogenesis. Indeed, the BALB/c mouse model of HMPV infection was previously developed in Dr Boivin’s laboratory. Using this murine model, we showed that the HMPV fusion (F) protein contributes to, but is not solely responsible for the replicative capacity and virulence of the virus and we demonstrated that the cellular protease-activated receptor-1 (PAR1) significantly contributes to HMPV pathogenesis. To date, no HMPV-specific vaccines or therapeutic modalities are available. Three major factors have haltered the development of a safe and effective HMPV vaccine; 1) the precedent of vaccine-enhanced disease associated with the use of HRSV and measles vaccines and the demonstration of vaccine-enhanced disease upon inactivated HMPV vaccination in animal models. 2) The lack of long-term protection induced by HMPV vaccines in animals. 3) Our limited understanding of the individual contributions of HMPV proteins to host immunity. By developing a subunit vaccine consisting of the HMPV F and matrix (M) protein, we demonstrate that the HMPV M protein significantly contributes to vaccine-induced protection in mice.

Le métapneumovirus humain (hMPV) est un virus qui circule dans la population humaine depuis plus de70 ans et a été isolé pour la première fois en 2001. Il est la troisième cause mondiale en lien avec les hospitalisations d’enfants pour maladies aigües des voies respiratoires supérieures et inférieures. Il est responsable d’une multitude de complications chez les jeunes enfants, les personnes âgées ainsi que les personnes immunosupprimées. À ce jour, il n’existe aucun vaccin commercial contre le hMPV. Dans les récentes années, la protéine de fusion F, qui est le principal antigène viral, a fait l’objet d’une multitude d’essais principalement pré-cliniques en vaccination. La découverte que, chez le virus respiratoire syncytial (VRS), la protéine F stabilisée en forme pré-fusion est plus immunogène a fourni de nouvelles pistes pour le développement vaccinal. Pour ces raisons, l’objectif de ma maîtrise est le développement d’un vaccin sous-unitaire à base de protéine F-hMPV stabilisée en pré-fusion et son test chez le modèle de la souris BALB/C pour vérifier son potentiel protecteur. Nos études ont démontré qu’il n’y a pas de différence significative, en termes d’immunogénicité, entre la forme pré- et post-fusion de la protéine F chez le hMPV. Les essais d’immunogénicité ont également démontré la nécessité de l’ajout de l’adjuvant alum pour élucider une réponse immunitaire chez la souris BALB/C. Les immunisations par les protéines adjuvantées ont démontré le développement d’anticorps neutralisants. Suite à l’infection, la réplication virale pulmonaire a été diminuée sous le seuil de détection des techniques utilisées, mais l’inflammation pulmonaire a persisté. Les vaccins adjuvantés n’ont pas influencé la perte de poids chez la souris, mais ont amélioré les autres symptômes cliniques tels l’activité physique et le poil ébouriffé. Les vaccins F-hMPV sans alum présentent certaines caractéristiques de réponse immune exagérée (titres en anticorps neutralisants nuls; état physique détérioré) et devront être analysés davantage. Les vaccins F-hMPV avec alum n’ont pas démontré des signes de réponse immune exagérée, suite à l’infection par le hMPV, malgré une réponse immune de type Th2 plus forte. Globalement, malgré une réduction des titres viraux à un seuil indétectable, aucun des vaccins n’a protégé complètement le modèle murin contre l’infection par le hMPV. Les vaccins développés au cours de ces études ouvrent la voie à de nouvelles stratégies d’immunisation, de nouveaux essais de vaccination en combinaison avec d’autres adjuvants et peuvent servir de base pour le développement d’un vaccin efficace contre le hMPV / The human metapneumovirus has been first isolated in 2001 despite its circulation in the human population for more than 70 years. HMPV is the third leading cause of children hospitalisations associated with acute respiratory tract infections. Complications occur commonly in young children, the elderly and the immunocompromised. To this day, no vaccine has been licensed for use against hMPV. In recent years, the F protein, considered the most immunodominant antigen, has been the target of many pre-clinical vaccine trials. The discovery, for RSV, that a prefusion bound F protein is more immunogenic than post-fusion has encouraged new vaccination approaches. Based on this discovery, the aim of this project is the development of a prefusion bound F-hMPV subunit vaccine and testing its potency to protect the BALB/C model. Following challenge, no significant difference between potentially prefusion bound proteins and wild type protein was observed. Immunisation trials revealed the necessity of adding an adjuvant, alum in this case, to elicit an immune response in mice. Neutralizing antibodies were observed with F-hMPV vaccines containing the alum adjuvant. Post-immunisation challenge trials revealed reduction of lung viral replication below detection levels and persisting inflammation. Weight loss was not affected by vaccination, but animals immunised with adjuvanted F-hMPV proteins exhibited better physical condition and no signs of disease such as diminished activity and ruffed fur. F-hMPV vaccines without alum exhibited some characteristics of enhanced disease (no neutralizing antibodies; affected physical condition) and require further analysis. Enhanced disease was not observed in the F-hMPV adjuvanted groups despite higher Th2/Th1 ratios with adjuvanted proteins . None of the vaccines tested were able to fully protect the mouse model upon challenge. Vaccines developed in this study will be useful in future trials and could be tested with other adjuvants or vaccination strategies.

Le métapneumovirus humain (hMPV) est un nouveau virus respiratoire identifié pour la première fois par un groupe hollandais en 2001. Ce pathogène viral cause principalement des infections aiguës des voies respiratoires, telles que des bronchiolites et des bronchites ainsi que des pneumonies chez les jeunes enfants, les personnes âgées et les individus immunocompromis. Au moment d’élaborer ce projet de doctorat, aucun modèle expérimental d’infection n’avait été développé, la pathogenèse associée à cette infection virale n’avait pas été étudiée et aucun traitement ou vaccin n’avait encore été approuvé chez l’humain ou même étudié in vivo. Bref, des lacunes majeures subsistaient en ce qui a trait à la compréhension et au traitement de l’infection par le hMPV. L’objectif principal de ce projet de doctorat était donc de développer un modèle expérimental d’infection chez le petit animal de laboratoire afin de caractériser la pathogenèse associée à l’infection virale et d’évaluer l’efficacité de différents traitements. Les résultats démontrent que la souris Balb/c et le «cotton rat» s’avèrent tous deux être de bons modèles d’infection pour l’étude de l’infection par le hMPV. Une importante réplication du virus ainsi que des changements histopathologiques caractérisés par une inflammation pulmonaire prononcée sont observés suite à l’infection virale. Cependant, la souris Balb/c est plus susceptible au hMPV que le rat, car le développement de symptômes cliniques significatifs n’est noté que chez ce premier. L’infection par le hMPV entraîne aussi une obstruction des voies respiratoires et une hyperréactivité bronchique significative. D’un côté thérapeutique, la ribavirine possède une importante activité antivirale contre le hMPV, puisque la réplication et l’inflammation associées à l’infection sont diminuées de façon significative suite à l’administration de l’agent antiviral. D’un côté prophylactique, les immunisations avec une préparation de hMPV complet inactivé couplée à un adjuvant représentent un danger potentiel, car elles provoquent une réponse inflammatoire exagérée suite à l’infection virale. Des vaccins sous-unitaires protéiques semblent être beaucoup plus sécuritaires et prometteurs. Les modèles expérimentaux développés lors de ce projet vont permettre de mieux comprendre la pathogenèse associée à l’infection par le hMPV et d’évaluer de façon plus complète l’activité de différents traitements thérapeutiques et prophylactiques. / The human metapneumovirus (hMPV) is a newly-described viral pathogen first reported in the Netherlands in 2001. HMPV is associated with acute respiratory tract infections in all age groups with more severe diseases such as bronchiolitis/bronchitis and pneumonia occurring in young children, elderly individuals and immunocompromised hosts. Before we started this project, no experimental models had been developed, the pathogenesis was not exhaustively described and no vaccines, chemotherapeutic agents, or antibody preparations had been approved for the prevention or treatment of hMPV infections in humans or even studied in vivo. The aim of this project was to develop an experimental animal model for hMPV infection to : 1-characterize the pathogenesis associated with this viral infection and 2-evaluate novel therapeutic or prophylactic modalities. The Balb/c mice and cotton rat are both permissive to hMPV infection. They support efficient viral replication in the lower respiratory tract and the infection is associated with significant lung inflammation. However, Balb/c mice are more susceptible to the infection, as we observe clinical symptoms such as weight loss and breathing difficulties characterized by significant airways obstruction and hyperresponsiveness only in this animal model. Ribavirin has shown antiviral properties against hMPV and significantly reduced viral replication and pulmonary inflammation. Immunizations with inactivated hMPV mixed with adjuvant induced a severe pulmonary disease following intra-nasal infection, as it has already been observed with other paramyxoviruses. Subunit vaccines seem safer preparations to pursue the development of hMPV vaccines. The Balb/c mice and cotton rat experimental models are great tools to better understand hMPV pathogenesis and also to evaluate different therapeutic and prophylactic modalities.

Thèse ou mémoire avec insertion d'articles / Le virus respiratoire syncytial (VRS) et le métapneumovirus humain (MPVH) sont deux pathogènes respiratoires majeurs qui représentent un fardeau important pour la santé publique dans le monde entier, affectant particulièrement les populations vulnérables telles que les nourrissons, les personnes âgées et les patients immunodéprimés. Les deux virus appartiennent à la famille des *Pneumoviridae* (pneumovirus) et sont relativement similaires dans leur structure et leur réplication. Malgré plus de 60 ans de recherche dans ce domaine, les deux premiers vaccins contemporains pour la prévention du VRS ont été approuvés cette année, mais il n'existe toujours pas de vaccin contre le MPVH. Cette thèse donne un aperçu complet de la virologie moléculaire du VRS et du MPVH, de l'épidémiologie, du fardeau de la maladie, des modèles d'infection, de la réponse immunitaire et du paysage actuel des modalités de traitement et de prophylaxie du VRS et du MPVH, en mettant l'accent sur le développement d'un vaccin. Notre équipe de recherche a déjà développé Metavac®, un candidat vaccin vivant atténué contre le MPVH qui s'est avéré sécuritaire, immunogène et protecteur contre l'infection par le MPVH chez la souris. Cette thèse présente une tentative réussie de conception, de génération et de caractérisation d'un vaccin chimérique atténué MPVH/VRS basé sur la plateforme d'expression Metavac® en vue de son utilisation comme vaccin chimérique atténué bivalent contre les deux pneumovirus. Le projet de recherche comprend trois parties principales : I) Biologie moléculaire : L'étude de la génétique des pneumovirus et la tentative de trouver une localisation appropriée dans le génome du MPVH pour l'insertion de l'antigène principal du VRS. II) *II) In vitro :* Génération d'un virus viable par génétique inverse et production d'un stock de virus concentré pour son utilisation comme vaccin chimérique atténué MPVH/VRS. Caractérisation des virus chimériques. III) *In vivo*: Vaccination de souris BALB/c avec des virus chimériques MPVH/VRS et évaluation de leur efficacité protectrice contre le défi létal MPVH et VRS. / Respiratory Syncytial Virus (RSV) and Human Metapneumovirus (HMPV) are two major respiratory pathogens that pose a significant public health burden worldwide, particularly affecting vulnerable populations such as infants, elderly individuals, and immunocompromised patients. Both viruses belong to the family *Pneumoviridae* (pneumovieus) and are relatively similar in structure and replication. Despite over 60 years of research in the field, the first two contemporary vaccines for RSV prevention have been approved this year, and yet there is still no vaccine available against HMPV. This thesis provides a comprehensive overview of RSV and HMPV molecular virology, epidemiology, disease burden, models of infection, immune response, and the current landscape of RSV and HMPV treatment and prophylactic modalities with a focus on vaccine development. Our research team has previously developed Metavac®, a live attenuated HMPV vaccine candidate that proved safe, immunogenic, and protective against HMPV infection in mice. This work presents a successful attempt to design, generate, and characterize a chimeric attenuated HMPV/RSV virus based on the Metavac® expression platform for its use as a bivalent attenuated chimeric vaccine against both pneumoviruses. The research project includes three main parts: IV) Molecular biology: The study of pneumovirus genetics and the attempt to find an appropriate localization in the genome of HMPV for the insertion of the main antigen of RSV. V) *In vitro*: A rescue of a viable virus by reverse genetics and the production of a concentrated virus stock for its use as an attenuated chimeric HMPV/RSV vaccine. Characterization of chimeric viruses. VI) *In vivo*: Vaccination of BALB/c mice with chimeric HMPV/RSV viruses and evaluation of their protective efficacy against HMPV and RSV lethal challenge.

Les paramyxovirus possèdent deux glycoprotéines d’enveloppe (gps): la protéine F, permettant la fusion avec la cellule hôte, et la protéine d’attachement appelée G, H ou HN. Les gps H et F d’une souche vaccinale du virus de la rougeole peuvent être incorporées sur des vecteurs lentiviraux (H/F-LV) permettant une transduction efficace des lymphocytes T et B humains non stimulés, habituellement réfractaires. Nous avons montré que les vecteurs H/F-LV sont capables de transduire des cellules B cancéreuses, activées et quiescentes, contrairement aux VSV-G-LV classiques. Leur utilisation in vivo est cependant confrontée à la présence d’anticorps neutralisants induits par la vaccination, dirigés majoritairement contre H. Après la mutation des 2 épitopes immunodominants de H, les vecteurs conservent leur tropisme et échappent à la neutralisation par les anticorps monoclonaux, mais sont toujours neutralisés par le sérum humain. Les souches émergentes de rougeole de génotype D, qui paraissent résister à la vaccination, présentent une glycosylation supplémentaire de la H. Introduite dans notre mutant, elle permet aux H/F-LV de transduire efficacement les cellules T et B en présence de sérum ou de sang total. Les pneumovirinae (le Virus Respiratoire Syncytial et le Métapneumovirus Humain (HMPV)) sont la première cause d’infections respiratoires chez le nourrisson, il n’existe pas de vaccin contre ces virus. Nous avons mis au point un système de Virus-Like Particle rétrovirales incorporant les gps F et G de HMPV (HMPV-VLPs). Injectées à des souris, les HMPV-VLP induisent une forte réponse d’anticorps neutralisants. De plus, suite à une épreuve virale, les souris sont protégées de l’infection par hMPV. / Paramyxoviruses contain two envelope glycoproteins : the F protein allowing fusion with the host cell and an attachment protein, called G, H or HN. Lentiviral vectors pseudotyped with the Edmonston measles virus hemagglutinin and fusion glycoproteins (H/F-LVs) allowed for the first time efficient transduction of quiescent human T and B cells. We showed that H/F-LVs were also able to efficiently transduce quiescent and activated cancer B cells, in contrast to the classical VSV-G-LVs. However, a major obstacle in the use of H/F-LVs in vivo is that most of the human population is vaccinated against measles inducing a humoral immune response exclusively directed against H. LVs pseudotyped with H-glycoproteins mutated in the 2 major epitopes escaped inactivation by monoclonal antibodies but were still neutralized by human serum. Consequently, we took advantage of newly emerged MV-D genotypes that were less sensitive to MV vaccination due to a different glycosylation pattern. The mutation responsible was introduced into the mutated H/F-LVs allowing efficient transduction of quiescent lymphocytes in the presence of high concentration of MV antibody-positive human serum or total blood. Pneumovirinae (Respiratory Syncitial Virus and human metapnemovirus (HMPV)) are the leading cause of respiratory infections in infants and no vaccine is available against these viruses. We designed retroviral Virus-Like Particle incorporating HMPV F and G gps (HMPV-VLPs). HMPV-VLPs injected to mice induce a strong neutralizing antibody immune response in vivo. Furthermore, upon a viral challenge, HMPV-VLP vaccinated mice are protected against hMPV infection.

Le métapneumovirus humain (hMPV) est un virus responsable d’infections aiguës des voies respiratoires telles que des bronchiolites, des bronchites ou des pneumonies, principalement chez les populations à risques que sont les jeunes enfants de moins de 5ans, ainsi que les personnes âgées ou immunodéprimées. Découvert en 2001, ce virus et sa pathogénèse ne restent encore aujourd’hui que partiellement caractérisés. De ce fait et malgré les besoins, il n’y a aucun vaccin ou traitement thérapeutique spécifique et efficace contre le HMPV disponible sur le marché. Dans ce contexte, mon projet de thèse s’est articulé autour de deux axes principaux: (i) L’étude de la protéine de fusion F du virus hMPV, protéine majeure antigénique de surface et responsable de l’entrée du virus dans la cellule cible. Elle a pour particularité d’induire de manière autonome la fusion membranaire in vitro et d’être associée à des effets cytopathiques variable selon les souches virales. De par son rôle clé pour le virus hMPV, la protéine F a déjà fait l’objet de plusieurs études structurales et fonctionnelles mais les déterminants de cette activité fusogénique ne sont pas encore entièrement caractérisés. Nous nous sommes donc intéressés à l’identification de déterminants du phénotype viral hyperfusogénique, localisés dans les domaines heptad repeats de la protéine F du hMPV. (ii) L’atténuation de deux souches virales cliniques (CAN98-75 et C-85473) par délétion de gènes accessoires dans le but de développer des candidats vaccinaux adaptés aux enfants en bas âge. Différents virus ont été générés par génétique inverse et les délétions des gènes accessoires SH et G dans les deux fonds génétiques viraux ont été étudiées pour leur impact sur l’infectivité, la réplication et la pathogénèse virale in vitro et in vivo ainsi que leur contribution pour le développement de virus atténués candidats vaccinaux. / Human metapneumovirus (hMPV) is a major pathogen responsible of acute respiratory tract infections, such as bronchiolitis or pneumonia, affecting especially infants, under five years old, elderly individuals and immunocompromised adults. Identified since2001, this virus and its pathogenes is still remain largely unknown and no licensed vaccines or specific antivirals against hMPV are currently available. In this context, my research project was built over two main subjects: (i) The study of the fusion F glycoprotein which is the major antigenic protein of hMPV and is responsible of viral entry into host cell. By its crucial role for the virus, the F protein has already been characterized in several structural and/or functional studies. Thus, it has been described that the hMPV F protein induces membrane fusion autonomously, resulting in variable cytopathic effects in vitro, in a strain-dependent manner. However, as the determinants of the hMPV fusogenic activity are not well characterized yet, we focused on identification of some of these, located in heptad repeats domains of the protein. (ii) The evaluation of hMPV SH and G gene deletion for viral attenuation. Live-attenuated hMPV vaccine candidates for infants’ immunization has been constructed thank to this deletion approach at the beginning of hMPV vaccine development efforts. Despite encouraging results, these candidates have not been further characterized and the importance of the viral background has not been evaluated.

Le métapneumovirus humain (hMPV) est un virus responsable d'infections aiguës des voies respiratoires telles que des bronchiolites, des bronchites ou des pneumonies, principalement chez les populations à risques que sont les jeunes enfants de moins de 5 ans, ainsi que les personnes âgées ou immunodéprimées. Découvert en 2001, ce virus et sa pathogénèse ne restent encore aujourd'hui que partiellement caractérisés. De ce fait et malgré les besoins, il n'y a aucun vaccin ou traitement thérapeutique spécifique et efficace contre le HMPV disponible sur le marché. Dans ce contexte, mon projet de thèse s'est articulé autour de deux axes principaux : (i) L'étude de la protéine de fusion F du virus hMPV, protéine majeure antigénique de surface et responsable de l'entrée du virus dans la cellule cible. Elle a pour particularité d'induire de manière autonome la fusion membranaire in vitro et d'être associée à des effets cytopathiques variable selon les souches virales. De par son rôle clé pour le virus hMPV, la protéine F a déjà fait l'objet de plusieurs études structurales et fonctionnelles mais les déterminants de cette activité fusogénique ne sont pas encore entièrement caractérisés. Nous nous sommes donc intéressés à l'identification de déterminants du phénotype viral hyperfusogénique, localisés dans les domaines heptad repeats de la protéine F du hMPV. (ii) L'atténuation de deux souches virales cliniques (CAN98-75 et C-85473) par délétion de gènes accessoires dans le but de développer des candidats vaccinaux adaptés aux enfants en bas âge. Différents virus ont été générés par génétique inverse et les délétions des gènes accessoires SH et G dans les deux fonds génétiques viraux ont été étudiées pour leur impact sur l'infectivité, la réplication et la pathogénèse virale in vitro et in vivo ainsi que leur contribution pour le développement de virus atténués candidats vaccinaux / Human metapneumovirus (hMPV) is a major pathogen responsible of acute respiratory tract infections, such as bronchiolitis or pneumonia, affecting especially infants, under five years old, elderly individuals and immunocompromised adults. Identified since 2001, this virus and its pathogenesis still remain largely unknown and no licensed vaccines or specific antivirals against hMPV are currently available. In this context, my research project was built over two main subjects: (i) The study of the fusion F glycoprotein which is the major antigenic protein of hMPV and is responsible of viral entry into host cell. By its crucial role for the virus, the F protein has already been characterized in several structural and/or functional studies. Thus, it has been described that the hMPV F protein induces membrane fusion autonomously, resulting in variable cytopathic effects in vitro, in a strain-dependent manner. However, as the determinants of the hMPV fusogenic activity are not well characterized yet, we focused on identification of some of these, located in heptad repeats domains of the protein. (ii) The evaluation of hMPV SH and G gene deletion for viral attenuation. Liveattenuated hMPV vaccine candidates for infants’ immunization has been constructed thank to this deletion approach at the beginning of hMPV vaccine development efforts. Despite encouraging results, these candidates have not been further characterized and the importance of the viral background has not been evaluated

Ma thèse a porté sur l’étude des activités enzymatiques impliquées dans la formation de la coiffe de deux virus à ARN: le virus du Nil Occidental (WNV) et le métapneumovirus humain (hMPV). Ces virus codent pour des enzymes assurant l’ajout de la coiffe de type-1 (m7GpppN2’Om) à l’extrémité 5’ de leur ARNm.Le domaine N-terminal de la protéine NS5 (NS5MTase) du WNV porte les activités N7- et 2’O-méthyltransférases (N7- et 2’O-MTases) et il a été proposé que NS5MTase puisse également porter l’activité guanylyltransférase (GTase). J’ai identifié in vitro des résidus clés impliqués dans l’interaction entre NS5MTase et des ARN substrats de chaque activité MTase. Nos résultats démontrent que le site de fixation de la coiffe est nécessaire lors de la 2’O-méthylation et ne l’est pas pour la N7-méthylation. En parallèle, j’ai recherché des résidus catalytiques de la GTase par la méthode de génétique inverse. Des résultats préliminaires indiquent que la mutation K29A induit un défaut de réplication. Ce résidu pourrait donc être impliqué dans l’activité GTase de NS5MTase.Concernant hMPV, j’ai effectué une analyse fonctionnelle du domaine CR-VI+ de la protéine L. J’ai démontré que CR-VI+ possède les activités N7- et 2’O-MTases et j’ai identifié les résidus impliqués dans le recrutement de l’ARNm. L’ordre de méthylation est non canonique avec la 2’O-méthylation qui précède la N7-méthylation. Enfin, j’ai également démontré que CR-VI+ possède une activité d’hydrolyse du GTP.Ce travail démontre que ces MTases possèdent 2 voire 3 des activités enzymatiques nécessaires à la formation de la coiffe, et représentent donc une cible de choix pour le développement d’inhibiteurs. / My PhD project is focus on the study of the enzymatic activities involved in the RNA capping pathway of two RNA viruses: the West Nile Virus (WNV) and the human metapneumovirus (hMPV). These viruses encode for enzymes allowing the addition of a cap-1 structure (m7GpppN2’Om) to their mRNA 5’ ends. The NS5 N-terminal domain (NS5MTase) of WNV harbours the N7- and 2’O-methyltransferase activities (N7- and 2’O-MTase); and it has been proposed that NS5MTase also bears a guanylyltransferase activity (GTase). I have identified residues involved in the NS5MTase interaction sites with their RNAs substrate. My assays demonstrate the importance of the cap-binding site for the 2’O-methylation but not for the N7-methylation. In parallel, I have tried to identify putative catalytic residues of the GTase activity by reverse genetics. Preliminary results suggest that NS5MTase K29 could be a catalytic residue.Concerning hMPV, I performed a functional analysis of CR-VI+ domain of the protein L. I demonstrated that the CR-VI+ domain harbours the N7- and 2’O-MTase activities and identified the residues involved in the mRNA recruitment. I showed that the methylation order is not canonical with the 2’O-methylation preceding the N7-methylation. Finally, I showed that the domain harbours an additional GTP hydrolysis activity, representing the first step of RNA cap formation for Mononegavirales.This work demonstrates that this MTase domains harbour 2 or 3 of the enzymatic activities required for viral RNA cap synthesis and represent attractive targets for the development of antivirals.

Les paramyxovirus respiratoires humains sont des virus responsables d'infections chez les jeunes enfants, les personnes âgées et les patients immuno déprimés. Ces virus possèdent deux glycoprotéines à la surface de leur enveloppe, jouant un rôle dans l'entrée du virus dans la cellule cible. La glycoprotéine d’attachement (HN, G ou H) permet l’attachement du virus à son récepteur cellulaire et, dans le cas de HN, celle-ci est suspectée d’activer la seconde glycoprotéine, la protéinede fusion (F). Cette dernière réalise la fusion entre l'enveloppe du virus et la membrane cellulaire.Le mécanisme par lequel la protéine HN "active" la protéine F reste mal caractérisé, malgré la détermination récente de leurs structures en cristallographie. Plusieurs modèles sont actuellement proposés. Ce travail de thèse s’est focalisé principalement sur les glycoprotéines d’enveloppe des virus parainfluenza humain de type 2 (hPIV-2) et parainfluenza de type 5 (PIV-5), ainsi que sur la glycoprotéine de fusion du métapneumovirus humain (hMPV). La première partie de ce projet a consisté à caractériser une mutation retrouvée sur la protéine F de souches circulantes hPIV-2. Cette étude a notamment souligné l’importance de la sous-unité F2 dans la régulation de la fusion membranaire. Puis, dans un second temps, l’une des étapes du mécanisme d’entrée du métapneumovirus a été étudiée : la fusion membranaire induite par la glycoprotéine F. Il a été démontré qu’il était possible dans une certaine mesure, et par une approche de mutagenèse combinatoire, de dissocier les caractéristiques de F hMPV et ainsi de pouvoir mieux les étudier. Ce travail d’ingénierie de la glycoprotéine F hMPV s’est également inscrit dans un objectif de recherche appliquée afin de contribuer au développement de nouveaux outils prophylactiques et thérapeutiques. Cette perspective thérapeutique de F PIV-5 a été évaluée dans le cadre d’un vecteur oncolytique basé sur l’adénovirus de type 5 (AdV-5). L’expression de cette glycoprotéine hyperfusogène a ainsi contribué à un effet cytotoxique amplifié des vecteurs armés in vitro ainsiqu’en modèle animal immunocompétent. / Human respiratory paramyxoviruses are responsible for infectious diseases and hospitalisations among infants, children, elderly and the immunocompromised. These viruses harbour two glycoproteins implicated in virus entry into the cell. The attachment glycoprotein (HN,G or H) is implicated the virus attachment on a target cell receptor, and HN is also suspected to activate the second glycoprotein, the fusion protein (F). This latter glycoprotein can perform the fusion between the cellular membrane and the viral envelope. The mechanism of activation of the F protein, is not well-defined, even with the structural characterisation for some viruses studied inthis thesis. This thesis work is focussed on the viral glycoprotein of parainfluenza virus type 2 (hPIV-2), parainfluenza virus type 5 (PIV-5), and the fusion glycoprotein of human Metapneumovirus (hMPV).The first part of this project was the characterization of a mutation observed in the F protein natural variants of hPIV-2. This work highlights the importance of the F2 subunit of F in the fusion regulation. A second part of the project consisted of the study of the mechanism of F hMPV entry into the cell, induced by F glycoprotein. This work showed that it was possible to dissociate the characteristics of the F glycoprotein, in order to allow a better understanding of these characteristics. This engineering work on the F protein was used to understand the basic science but could also be used in the development of therapeutic tools.The therapeutic use of F PIV-5 was also evaluated in an oncolytic vector based on adenovirus type 5 (AdV-5). Its expression in tumours showed a highly cytotoxic activity for the target cells in vivo, but also in vitro on immunocompetent rodents.