A inflamação no sistema nervoso central (SNC) está envolvida na gênese de uma série de doenças neurodegenerativas, sendo assim, compreender o processo inflamatório nessas circunstâncias se torna essencial para propor novas abordagens terapêuticas. Sabemos que a Anexina A1 (ANXA1) e o receptor TSPO são dois moduladores importantes da neuroinflamação. Enquanto se sabe que a ANXA1 possui propriedades antiinflamatórias, o papel do TSPO ainda não está esclarecido. Desta forma, este projeto avaliou a atuação da ANXA1 sobre a expressão do TSPO em linhagem de células da microglia (BV2), e sua conexão com o receptor Toll-like receptor-4 (TLR4) em BV2 ativada pelo lipopolisacarídeo de E.coli (LPS). Os resultados obtidos mostram que o tratamento de BV2 com LPS induz a expressão de TSPO, dependente de ativação de TLR4, através das vias da molécula adaptadora do fator de diferenciação mielóide 88 (MyD88) e do fator nuclear κB (NFκB). O tratamento com ANXA1 recombinante induz um perfil antiinflamatório em células BV2 estimuladas com LPS, por reduzir a secreção de citocinas proinflamatórias e, ao mesmo tempo, aumentar secreção de citocinas antiinflamatórias. A exposição com ANXA1 ainda impede o aumento da expressão de TSPO induzida pelo LPS. Mostramos também que esta ação da ANXA1 é dependente da interação com o receptor de peptídeo formilado (FPR2). Adicionalmente, o silenciamento de TSPO em células BV2 predispõe essas células a um perfil ativado exacerbando a secreção do fator de necrose tumoral (TNFα) em resposta ao LPS, o que não pode ser revertido pelo tratamento com ANXA1 recombinante. Em conjunto, os resultados expõe a relação existente entre ANXA1 e TSPO em micróglia ativada pelo LPS, mostrando que a ANXA1 9 modula negativamente a expressão do TSPO. Ademais, o silenciamento de TSPO inibiu a fagocitose de neurônios apoptóticos, o que ainda sugere a participação do TSPO na eferocitose. / Inflammation in the Central Nervous System (CNS) is involved in the genesis of a number of neurodegenerative diseases, so understanding the inflammatory process in these circumstances is essential to proposal new therapeutic approaches. We know that Annexin A1 (ANXA1) and the TSPO receptor are two important modulators of neuroinflammation. While it is known that ANXA1 has anti-inflammatory properties, the role of TSPO has not yet been clarified. Thus, this project evaluated the interference of ANXA1 on the expression of TSPO in microglia cell line (BV2), and its connection with the Toll-like receptor-4 receptor (TLR4) in BV2 activated by E. coli lipopolysaccharide LPS). The results show that the treatment of BV2 with LPS induces the expression of TSPO, dependent on activation of TLR4, through the pathways of the adapter molecule of myeloid differentiation factor 88 (MyD88) and nuclear factor κB (NFκB). Treatment with recombinant ANXA1 induces an anti-inflammatory profile in LPS-stimulated BV2 cells, by reducing the secretion of proinflammatory cytokines and, at the same time, increasing secretion of anti-inflammatory cytokines. Exposure with ANXA1 still prevents the increase of LPS-induced TSPO expression. We also show that this action of ANXA1 is dependent on the interaction with the formylated peptide receptor (FPR2). In addition, TSPO silencing in BV2 cells predisposes these cells to an activated profile exacerbating secretion of tumor necrosis factor (TNFα) in response to LPS, which can not be reversed by treatment with recombinant ANXA1. Together, the results show the relationship between ANXA1 and TSPO in LPS activated microglia, showing that ANXA1 negatively modulates TSPO 11 expression. In addition, TSPO silencing inhibited the phagocytosis of apoptotic neurons, which still suggests the participation of TSPO in eferocytosis.

A inflamação no sistema nervoso central (SNC) está envolvida na gênese de uma série de doenças neurodegenerativas, sendo assim, compreender o processo inflamatório nessas circunstâncias se torna essencial para propor novas abordagens terapêuticas. Sabemos que a Anexina A1 (ANXA1) e o receptor TSPO são dois moduladores importantes da neuroinflamação. Enquanto se sabe que a ANXA1 possui propriedades antiinflamatórias, o papel do TSPO ainda não está esclarecido. Desta forma, este projeto avaliou a atuação da ANXA1 sobre a expressão do TSPO em linhagem de células da microglia (BV2), e sua conexão com o receptor Toll-like receptor-4 (TLR4) em BV2 ativada pelo lipopolisacarídeo de E.coli (LPS). Os resultados obtidos mostram que o tratamento de BV2 com LPS induz a expressão de TSPO, dependente de ativação de TLR4, através das vias da molécula adaptadora do fator de diferenciação mielóide 88 (MyD88) e do fator nuclear κB (NFκB). O tratamento com ANXA1 recombinante induz um perfil antiinflamatório em células BV2 estimuladas com LPS, por reduzir a secreção de citocinas proinflamatórias e, ao mesmo tempo, aumentar secreção de citocinas antiinflamatórias. A exposição com ANXA1 ainda impede o aumento da expressão de TSPO induzida pelo LPS. Mostramos também que esta ação da ANXA1 é dependente da interação com o receptor de peptídeo formilado (FPR2). Adicionalmente, o silenciamento de TSPO em células BV2 predispõe essas células a um perfil ativado exacerbando a secreção do fator de necrose tumoral (TNFα) em resposta ao LPS, o que não pode ser revertido pelo tratamento com ANXA1 recombinante. Em conjunto, os resultados expõe a relação existente entre ANXA1 e TSPO em micróglia ativada pelo LPS, mostrando que a ANXA1 9 modula negativamente a expressão do TSPO. Ademais, o silenciamento de TSPO inibiu a fagocitose de neurônios apoptóticos, o que ainda sugere a participação do TSPO na eferocitose. / Inflammation in the Central Nervous System (CNS) is involved in the genesis of a number of neurodegenerative diseases, so understanding the inflammatory process in these circumstances is essential to proposal new therapeutic approaches. We know that Annexin A1 (ANXA1) and the TSPO receptor are two important modulators of neuroinflammation. While it is known that ANXA1 has anti-inflammatory properties, the role of TSPO has not yet been clarified. Thus, this project evaluated the interference of ANXA1 on the expression of TSPO in microglia cell line (BV2), and its connection with the Toll-like receptor-4 receptor (TLR4) in BV2 activated by E. coli lipopolysaccharide LPS). The results show that the treatment of BV2 with LPS induces the expression of TSPO, dependent on activation of TLR4, through the pathways of the adapter molecule of myeloid differentiation factor 88 (MyD88) and nuclear factor κB (NFκB). Treatment with recombinant ANXA1 induces an anti-inflammatory profile in LPS-stimulated BV2 cells, by reducing the secretion of proinflammatory cytokines and, at the same time, increasing secretion of anti-inflammatory cytokines. Exposure with ANXA1 still prevents the increase of LPS-induced TSPO expression. We also show that this action of ANXA1 is dependent on the interaction with the formylated peptide receptor (FPR2). In addition, TSPO silencing in BV2 cells predisposes these cells to an activated profile exacerbating secretion of tumor necrosis factor (TNFα) in response to LPS, which can not be reversed by treatment with recombinant ANXA1. Together, the results show the relationship between ANXA1 and TSPO in LPS activated microglia, showing that ANXA1 negatively modulates TSPO 11 expression. In addition, TSPO silencing inhibited the phagocytosis of apoptotic neurons, which still suggests the participation of TSPO in eferocytosis.

Les macrophages ont un rôle majeur dans la régulation de l’inflammation. Ils sont capables de répondre rapidement aux signaux extérieurs en passant d’un état pro- à anti-inflammatoire (respectivement nommés macrophages M1 et M2). Certaines sous populations de macrophages M2 ont des propriétés angiogéniques. Parmi les voies de signalisation permettant aux macrophages de répondre aux signaux extérieurs on trouve les voies Wnt/Frizzled (Fzd). Elles reposent sur 10 récepteurs Fzd et 19 ligands Wnt. Il a été établi que les couples Wnt3a/Fzd1 et Wnt5a/Fzd5 sont impliqués dans la réponse inflammatoire des macrophages. Récemment le rôle d’une voie Wnt/Flt1 a été mis en évidence dans la régulation de l’angiogenèse, par les macrophages, lors du développement rétinien. Notre objectif de recherche fut d’étudier le rôle de la signalisation induite par Fzd7 sur les propriétés angiogéniques des macrophages. Nous avons étudié l’angiogenèse pathologique par l’utilisation de plusieurs modèles murins d’inflammation (irritation cutané, ischémie du membre inférieur, infarctus du myocarde). Chez des souris déficientes en Fzd7 dans les macrophages, l’angiogenèse est plus importante durant la phase d’inflammation, comparées aux souris contrôles. Par immuno-histologie et cytométrie en flux nous avons démontré que cette augmentation du nombre de vaisseaux s’accompagne d’une population de macrophages M2 plus importante, sans modification du nombre total de macrophages. Ces résultats obtenus dans plusieurs contextes inflammatoires chez la souris suggèrent que Fzd7 serait impliqué dans le contrôle de l’angiogenèse via une régulation de la polarisation M1 versus M2 des macrophages. / Macrophages play a major role in regulating inflammation. They are able to respond quickly to external signals from a pro to anti-inflammatory state (respectively named M1 and M2 macrophages). Some subpopulations of M2 macrophages have angiogenic properties. The Wnt/Frizzled (Fzd) pathway is part of pathways allowing macrophages to respond to their environment. They are composed of 10 Fzd receptors and 19 Wnt ligands. It was established that Wnt3a/Fzd1 and Wnt5a/Fzd5 are involved in the inflammatory response of macrophages. Recently the role of a Wnt/Flt1 pathway has been highlighted in the regulation of angiogenesis, by macrophages, during retinal development. Our aim was to study the role of the Fzd7-induced signaling on macrophages angiogenic properties. We studied pathological angiogenesis by using several mouse models of inflammation (skin irritation, hindlimb ischemia, myocardial infarction). In mice with Fzd7-deleted macrophages, angiogenesis is greater during the inflammatory phase, compared with control mice. By immune-histochemistry and flow cytometry we demonstrated that the increase in the vessels number is associated with a greater M2 macrophages population, without change in the total number of macrophages. These results obtained in several inflammatory contexts in mice suggest that Fzd7 be involved in the control of angiogenesis through regulation of the M1 versus M2 polarization of macrophages.

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Les macrophages jouent un rôle dans l'inflammation de certaines pathologies pulmonaires comme l'asthme et la broncho pneumopathie chronique obstructive. Selon la dichotomie Th1 et Th2, les macrophages s'activent en phénotype M1/M2 en fonction du microenvironnement. Sous l'influence du lipopolysaccharide (LPS) les macrophages s'activent en phénotype M1. A l'inverse, l'exposition aux cytokines Th2 (interleukine (IL)-4/IL-13) induit un phénotype M2 des macrophages. Nous avons réalisé une étude transcriptomique des marqueurs de la polarisation M1/M2 des macrophages pulmonaires humains. La polarisation M1 induite par le LPS augmente la production des cytokines (TNF-α, IL-1β, CCL2, 3, 4, 5, CXCL1, 8, 10), de la PGE2 et l'expression du CD38 et CD197. La polarisation M2 induite par l'IL-4/IL-13 augmente l'expression des cytokines (CCL13, 17, 22, 26), de la 15-lipoxygénase (15-LOX) et du CD206. Nous avons évalué l'expression des 15-LOX-1 et 15-LOX-2 et leur rôle dans la régulation de la polarisation des macrophages pulmonaires. Le LPS augmente l'expression de la 15-LOX-2 alors que l'IL-4/IL-13 augmente l'expression de la 15-LOX-1. L'inhibition des 15-lipoxygénases diminue la production des cytokines M1/M2. Enfin, nous avons étudié l'expression et le rôle du récepteur nicotinique α7 dans la polarisation des macrophages pulmonaires humains. Ces derniers expriment les récepteurs nicotiniques α7 dont la stimulation par des agonistes nicotiniques α7 diminue la production des cytokines M1/M2. Ce travail apporte de nouvelles connaissances sur la polarisation des macrophages, dont certaines voies de régulation peuvent être impliquées dans les pathologies inflammatoire pulmonaires / In pulmonary diseases such as asthma and chronic obstructive pulmonary disease, macrophages orchestrate inflammatory reactions. In response to environmental signals, macrophages exhibit a phenotypic polarization that mirrors the Th1/Th2 polarization. Upon exposure to bacterial lipopolysaccharide (LPS), macrophages undergo M1 polarization. In contrast, interleukin (IL)-4/IL-13 induce M2 polarization.In our first study, we characterized the phenotypic differentiation of human lung macrophages (LM) using a whole-transcriptome approach. Cytokines, lipid metabolism and membrane markers were among the most affected genes. LPS-induced M1 polarization was associated with an increase in the production of cytokines (TNF-α, IL-1β, CCL2, 3, 4, 5, CXCL1, 8, 10), in PGE2 signalling and in the expression of CD38 and CD197. IL-4/IL-13-induced M2 macrophages increased expression of cytokines (CCL13, 17, 22, 26), 15-lipoxygenase (15-LOX) and CD206. In the second study, we investigated the expression of 15-LOX-1 and 15-LOX-2 and their roles in regulating the polarization of human LM. LPS increased the expression of 15-LOX-2 whereas IL-4/IL-13 induced the expression of 15-LOX-1. Inhibition of the 15-LOX pathways decreased the production of both M1 and M2 cytokines. The third study investigated the expression of α7 nicotinic receptors (α7nAChR) and their regulating roles in the polarization of LM. Expression of α7nAChR was found in unstimulated LM. Specific α7nAChR agonists decreased the in vitro production of both M1 and M2 cytokines. Our work adds new insights in the macrophage polarization and some of the regulatory pathways that may be involved in pulmonary diseases

Introdução: Macrófagos de fenótipo M1 (ativação clássica) e M2 (ativação alternativa) estão relacionados com diversos processos patológicos como o câncer, a aterosclerose e doenças neurodegenerativas. No microambiente tumoral, os macrófagos associados ao tumor (TAM) têm atuação controversa na progressão da doença. Um modelo in vitro pode servir para avaliar a influência dessa alteração fenotípica em diversas patologias. A linhagem celular monocítica humana U937, sob estímulo de PMA (do inglês, Phorbol 12-myristate 13-acetate), se diferencia em macrófagos típicos. Estes adquirem fenótipos M1 e M2 quando estimulados, respectivamente, por LPS/IFN- e IL-4. Objetivo: Estabelecer um modelo in vitro para o estudo do papel dos macrófagos e seu envolvimento na progressão de doenças, bem como, sua caracterização fenotípica nesses eventos. Para tal, utilizamos: a) meta-análise de dois conjuntos de dados de micro-arranjos para avaliar os genes relacionados e b) análise de marcadores de diferenciação celular, taxa de adesão, alterações morfológicas e níveis de espécies reativas. Métodos: Cultura Celular: Linhagem celular humana U937, cultivada com meio de cultura RPMI 1640 e tratada com 10nM de PMA, por 12, 24, 48 e 72 horas. Quantificação de Espécies Reativas de Oxigênio: Células U937 diferenciadas e indiferenciadas incubadas com a sonda DCF para avaliar a formação de espécies reativas, medida fluorescência por 1h. Ensaio de MTT e Adesão Celular: Células U937 diferenciadas e indiferenciadas foram incubadas com solução de MTT por 1h, para análise da viabilidade celular, foi medida absorbância em 560nm e índice de adesão por método de SRB. Produção de óxido Nítrico: Quantificado pelo método de Griess, a 540nm. Análise Morfológica por meio de Imagens das Células: Imagens obtidas após tempos de tratamento com PMA em 0, 12, 24, 48 e 72 horas. Bioinformática: a) obtidos dois conjuntos de dados de micro-arranjos do Gene Expression Omnibus (GEO) - GSE5099 e GSE15038; b) criamos redes de genes para o fenótipo M1 e M2, com ferramenta on-line STRING e software MEDUSA; c) rede de genes e informações dos micro-arranjos foram combinados e plotados em gráficos de acordo com a sua topologia, com software ViaComplex. Resultados: As imagens mostraram alteração morfológica característica da célula monocítica U937 (célula proliferativa) para macrófago (célula aderida na placa), quando tratadas com PMA. Quanto aos níveis de espécies reativas formadas e a taxa de aderência medida, foi maior nas células tratadas, no decorrer do tempo de tratamento. A taxa de proliferação da célula controle U937 aumentou com o tempo, enquanto que, observamos uma diminuição na proliferação das células tratadas com PMA. A análise bioinformática mostrou um aumento na expressão, tratadas x controle, de genes do fenótipo M1 e M2, nas células U937 diferenciadas por PMA e polarizadas com LPS/IFN gama e IL-4, respectivamente. O fenótipo M1 mostrou aumento na formação de ER e de NO quando tratado com LPS + IFN-gamacombinados. Houve uma diminuição de NO no fenótipo M2 quando ativadas por IL-4. Conclusão: Nosso trabalho descreve um método válido de diferenciação macrofágica da linhagem humana U937 e a possibilidade de sua polarização ao fenótipo M1 e M2 quando estimulada com PMA e posteriormente com LPS/IFN gama e IL-4, respectivamente. A compreensão das relações entre as alterações fenotípicas dos macrófagos e do microambiente gerado é importante para o desenvolvimento de pesquisas para combater/atenuar a agressividade das patologias. / Introduction: In vitro model of macrophages (MF) can be used to evaluate the influence of these cells in human pathologies. Objective: To establish an in vitro model to study macrophages and it’s evaluating M1/M2 polarization. Methods: The human U937 cell line was grown in medium RPMI 1640 and differentiated into functional macrophages by 10 nM phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA)-treatment, with M1 or M2 phenotypes with LPS/IFNg and IL-4, respectively. Reactive Oxigen Species (ROS) (time course of DCF oxidation), nitric oxide (NO) (Griess method), cell proliferation (MTT assay) and adherence (SRB method), and change in cellular morphology were determined. Moreover, two microarray data sets from Gene Expression Omnibus (GEO) (GSE5099 and GSE15038) were used to analyze differential M1/M2 gene expression with the online bioinformatics tools STRING, MEDUSA and Via Complex. Results: Time course experiments (0, 24, 48 and 72h) showed decreased cell proliferation with increase in morphological changes, cell adherence and ROS generation in PMA-treated U937 cells compatible with the acquisition of a macrophage-like phenotype. Bioinformatics approach showed increased expression in M1/M2 genes by PMA-treatment. 24h of LPS/IFNg- treatment induced increased NO, ROS, and the expression of M1 genes (classical activation MF), while 24h IL-4-treatment induced the expression of M2genes (alternative activation MF). Conclusion: This simple human macrophage-like differentiation and M1/M2 activation protocol could be used in vitro to establish the role of these cells in human pathologies.

Introdução: Macrófagos de fenótipo M1 (ativação clássica) e M2 (ativação alternativa) estão relacionados com diversos processos patológicos como o câncer, a aterosclerose e doenças neurodegenerativas. No microambiente tumoral, os macrófagos associados ao tumor (TAM) têm atuação controversa na progressão da doença. Um modelo in vitro pode servir para avaliar a influência dessa alteração fenotípica em diversas patologias. A linhagem celular monocítica humana U937, sob estímulo de PMA (do inglês, Phorbol 12-myristate 13-acetate), se diferencia em macrófagos típicos. Estes adquirem fenótipos M1 e M2 quando estimulados, respectivamente, por LPS/IFN- e IL-4. Objetivo: Estabelecer um modelo in vitro para o estudo do papel dos macrófagos e seu envolvimento na progressão de doenças, bem como, sua caracterização fenotípica nesses eventos. Para tal, utilizamos: a) meta-análise de dois conjuntos de dados de micro-arranjos para avaliar os genes relacionados e b) análise de marcadores de diferenciação celular, taxa de adesão, alterações morfológicas e níveis de espécies reativas. Métodos: Cultura Celular: Linhagem celular humana U937, cultivada com meio de cultura RPMI 1640 e tratada com 10nM de PMA, por 12, 24, 48 e 72 horas. Quantificação de Espécies Reativas de Oxigênio: Células U937 diferenciadas e indiferenciadas incubadas com a sonda DCF para avaliar a formação de espécies reativas, medida fluorescência por 1h. Ensaio de MTT e Adesão Celular: Células U937 diferenciadas e indiferenciadas foram incubadas com solução de MTT por 1h, para análise da viabilidade celular, foi medida absorbância em 560nm e índice de adesão por método de SRB. Produção de óxido Nítrico: Quantificado pelo método de Griess, a 540nm. Análise Morfológica por meio de Imagens das Células: Imagens obtidas após tempos de tratamento com PMA em 0, 12, 24, 48 e 72 horas. Bioinformática: a) obtidos dois conjuntos de dados de micro-arranjos do Gene Expression Omnibus (GEO) - GSE5099 e GSE15038; b) criamos redes de genes para o fenótipo M1 e M2, com ferramenta on-line STRING e software MEDUSA; c) rede de genes e informações dos micro-arranjos foram combinados e plotados em gráficos de acordo com a sua topologia, com software ViaComplex. Resultados: As imagens mostraram alteração morfológica característica da célula monocítica U937 (célula proliferativa) para macrófago (célula aderida na placa), quando tratadas com PMA. Quanto aos níveis de espécies reativas formadas e a taxa de aderência medida, foi maior nas células tratadas, no decorrer do tempo de tratamento. A taxa de proliferação da célula controle U937 aumentou com o tempo, enquanto que, observamos uma diminuição na proliferação das células tratadas com PMA. A análise bioinformática mostrou um aumento na expressão, tratadas x controle, de genes do fenótipo M1 e M2, nas células U937 diferenciadas por PMA e polarizadas com LPS/IFN gama e IL-4, respectivamente. O fenótipo M1 mostrou aumento na formação de ER e de NO quando tratado com LPS + IFN-gamacombinados. Houve uma diminuição de NO no fenótipo M2 quando ativadas por IL-4. Conclusão: Nosso trabalho descreve um método válido de diferenciação macrofágica da linhagem humana U937 e a possibilidade de sua polarização ao fenótipo M1 e M2 quando estimulada com PMA e posteriormente com LPS/IFN gama e IL-4, respectivamente. A compreensão das relações entre as alterações fenotípicas dos macrófagos e do microambiente gerado é importante para o desenvolvimento de pesquisas para combater/atenuar a agressividade das patologias. / Introduction: In vitro model of macrophages (MF) can be used to evaluate the influence of these cells in human pathologies. Objective: To establish an in vitro model to study macrophages and it’s evaluating M1/M2 polarization. Methods: The human U937 cell line was grown in medium RPMI 1640 and differentiated into functional macrophages by 10 nM phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA)-treatment, with M1 or M2 phenotypes with LPS/IFNg and IL-4, respectively. Reactive Oxigen Species (ROS) (time course of DCF oxidation), nitric oxide (NO) (Griess method), cell proliferation (MTT assay) and adherence (SRB method), and change in cellular morphology were determined. Moreover, two microarray data sets from Gene Expression Omnibus (GEO) (GSE5099 and GSE15038) were used to analyze differential M1/M2 gene expression with the online bioinformatics tools STRING, MEDUSA and Via Complex. Results: Time course experiments (0, 24, 48 and 72h) showed decreased cell proliferation with increase in morphological changes, cell adherence and ROS generation in PMA-treated U937 cells compatible with the acquisition of a macrophage-like phenotype. Bioinformatics approach showed increased expression in M1/M2 genes by PMA-treatment. 24h of LPS/IFNg- treatment induced increased NO, ROS, and the expression of M1 genes (classical activation MF), while 24h IL-4-treatment induced the expression of M2genes (alternative activation MF). Conclusion: This simple human macrophage-like differentiation and M1/M2 activation protocol could be used in vitro to establish the role of these cells in human pathologies.

Introdução: Macrófagos de fenótipo M1 (ativação clássica) e M2 (ativação alternativa) estão relacionados com diversos processos patológicos como o câncer, a aterosclerose e doenças neurodegenerativas. No microambiente tumoral, os macrófagos associados ao tumor (TAM) têm atuação controversa na progressão da doença. Um modelo in vitro pode servir para avaliar a influência dessa alteração fenotípica em diversas patologias. A linhagem celular monocítica humana U937, sob estímulo de PMA (do inglês, Phorbol 12-myristate 13-acetate), se diferencia em macrófagos típicos. Estes adquirem fenótipos M1 e M2 quando estimulados, respectivamente, por LPS/IFN- e IL-4. Objetivo: Estabelecer um modelo in vitro para o estudo do papel dos macrófagos e seu envolvimento na progressão de doenças, bem como, sua caracterização fenotípica nesses eventos. Para tal, utilizamos: a) meta-análise de dois conjuntos de dados de micro-arranjos para avaliar os genes relacionados e b) análise de marcadores de diferenciação celular, taxa de adesão, alterações morfológicas e níveis de espécies reativas. Métodos: Cultura Celular: Linhagem celular humana U937, cultivada com meio de cultura RPMI 1640 e tratada com 10nM de PMA, por 12, 24, 48 e 72 horas. Quantificação de Espécies Reativas de Oxigênio: Células U937 diferenciadas e indiferenciadas incubadas com a sonda DCF para avaliar a formação de espécies reativas, medida fluorescência por 1h. Ensaio de MTT e Adesão Celular: Células U937 diferenciadas e indiferenciadas foram incubadas com solução de MTT por 1h, para análise da viabilidade celular, foi medida absorbância em 560nm e índice de adesão por método de SRB. Produção de óxido Nítrico: Quantificado pelo método de Griess, a 540nm. Análise Morfológica por meio de Imagens das Células: Imagens obtidas após tempos de tratamento com PMA em 0, 12, 24, 48 e 72 horas. Bioinformática: a) obtidos dois conjuntos de dados de micro-arranjos do Gene Expression Omnibus (GEO) - GSE5099 e GSE15038; b) criamos redes de genes para o fenótipo M1 e M2, com ferramenta on-line STRING e software MEDUSA; c) rede de genes e informações dos micro-arranjos foram combinados e plotados em gráficos de acordo com a sua topologia, com software ViaComplex. Resultados: As imagens mostraram alteração morfológica característica da célula monocítica U937 (célula proliferativa) para macrófago (célula aderida na placa), quando tratadas com PMA. Quanto aos níveis de espécies reativas formadas e a taxa de aderência medida, foi maior nas células tratadas, no decorrer do tempo de tratamento. A taxa de proliferação da célula controle U937 aumentou com o tempo, enquanto que, observamos uma diminuição na proliferação das células tratadas com PMA. A análise bioinformática mostrou um aumento na expressão, tratadas x controle, de genes do fenótipo M1 e M2, nas células U937 diferenciadas por PMA e polarizadas com LPS/IFN gama e IL-4, respectivamente. O fenótipo M1 mostrou aumento na formação de ER e de NO quando tratado com LPS + IFN-gamacombinados. Houve uma diminuição de NO no fenótipo M2 quando ativadas por IL-4. Conclusão: Nosso trabalho descreve um método válido de diferenciação macrofágica da linhagem humana U937 e a possibilidade de sua polarização ao fenótipo M1 e M2 quando estimulada com PMA e posteriormente com LPS/IFN gama e IL-4, respectivamente. A compreensão das relações entre as alterações fenotípicas dos macrófagos e do microambiente gerado é importante para o desenvolvimento de pesquisas para combater/atenuar a agressividade das patologias. / Introduction: In vitro model of macrophages (MF) can be used to evaluate the influence of these cells in human pathologies. Objective: To establish an in vitro model to study macrophages and it’s evaluating M1/M2 polarization. Methods: The human U937 cell line was grown in medium RPMI 1640 and differentiated into functional macrophages by 10 nM phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA)-treatment, with M1 or M2 phenotypes with LPS/IFNg and IL-4, respectively. Reactive Oxigen Species (ROS) (time course of DCF oxidation), nitric oxide (NO) (Griess method), cell proliferation (MTT assay) and adherence (SRB method), and change in cellular morphology were determined. Moreover, two microarray data sets from Gene Expression Omnibus (GEO) (GSE5099 and GSE15038) were used to analyze differential M1/M2 gene expression with the online bioinformatics tools STRING, MEDUSA and Via Complex. Results: Time course experiments (0, 24, 48 and 72h) showed decreased cell proliferation with increase in morphological changes, cell adherence and ROS generation in PMA-treated U937 cells compatible with the acquisition of a macrophage-like phenotype. Bioinformatics approach showed increased expression in M1/M2 genes by PMA-treatment. 24h of LPS/IFNg- treatment induced increased NO, ROS, and the expression of M1 genes (classical activation MF), while 24h IL-4-treatment induced the expression of M2genes (alternative activation MF). Conclusion: This simple human macrophage-like differentiation and M1/M2 activation protocol could be used in vitro to establish the role of these cells in human pathologies.

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The thesis analyses in detail the relationship between the money stock defined by money aggregates M1 and M2 and the real GDP in the Czech Republic for period between 1996 and 2015. A long-term relationship between the real GDP and the money aggregate is not found using quarterly time series data. These conclusions are in accordance with the economic theory which does not confirm that money affects level of the real GDP in the long run. Short-term relationship between given variables is also analysed. Results indicate that the growth rate of the money aggregate M1 statistically significantly affects the growth rate of the real GDP in the same direction which is in line with monetary theories of business cycle. On the other hand, any statistically significant relationship for the money aggregate M2 is not found which speaks in favour of the Real Business Cycle theory. The Policy Ineffectiveness Proposition accepted by New Classical Macroeconomists is also tested in the thesis. The issue is investigated for the whole period and subsequently for shorter time from 2000 to 2015 where the uniform monetary policy is applied. Results for the money aggregate M1 imply that expected changes in the growth rate of M1 play important role in the money-output relationship which is consistent with the New Keynesian Macroeconomic theory. Considering the shorter period of time, Lucas' theory seems to be more appropriate explanation. Outcomes for the aggregate M2 provide mixed conclusions which support rather the Real Business Cycle theory. At the end of the thesis, there is a section devoted to the quasi money (one of M2 aggregate components) as a possible source of mixed results.