Tesi realitzada a l'Institut d'Investigacions Biomèdiques August Pi i Sunyer (IDIBAPS) / Antiretroviral therapy has dramatically reduced morbidity and mortality associated with HIV-1 infection and converted AIDS into a manageable chronic disease. During the past 15 years, antiretroviral drugs have become less toxic, more potent and more convenient, allowing the possibility of early treatment. Changing regimens in patients with viral suppression is an approach that can be contemplated to simplify treatment and improve adherence reducing the number of pills and frequency of dosing, to prevent toxicity in the short or long term, to minimize drug interactions, and also to preserve future treatment options and even to reduce costs. We conclude that the efficacy of protease inhibitors boosted with ritonavir (PI / r) monotherapy in clinical practice is consistent with data from clinical trials. Moreover, the combination of etravirine plus raltegravir is well tolerated and maintains durable viral suppression in selected patients with virological suppression. Regarding modification of PI / r regimens in virologically suppressed patients, we found that the change of PI / r for raltegravir leads to significant changes in biomarkers associated with cardiovascular inflammation, insulin resistance, and hypercoagulability. In this context abacavir / lamivudine exhibits similar efficacy and tolerability of tenofovir / emtricitabine. Replacing the drug involved is one of the strategies to handle complications of antiretroviral therapy. However, for patients with underlying resistance mutations this approach may not be feasible. In adults receiving PI / r with hypercholesterolemia and increased cardiovascular risk, we found that rosuvastatin produced greater decreases in total cholesterol and low density than switching PI / r. Finally, we observed that 11% of patients treated with raltegravir developed significant elevation of creatine kinase during treatment with raltegravir. Symptoms were rare and unrelated to the degree of creatine kinase elevation. While knowledge about non-infectious complications of HIV-1 infection continues to prosper together with the continuous improvement of antiretroviral therapy, it is possible to develop new strategies to limit their impact on people living with HIV and to assure they can age with health and quality of life. / El tratamiento antirretroviral ha reducido drásticamente la morbilidad y la mortalidad asociada al VIH-1 y ha transformado el SIDA en una enfermedad crónica manejable. Durante los últimos 15 años, los medicamentos antirretrovirales se han hecho menos tóxicos, más potentes y más convenientes, lo que permite la posibilidad de un tratamiento temprano y de por vida. Modificación de los regímenes en pacientes con supresión viral es un enfoque que se puede contemplar para simplificar el tratamiento y mejorar la adherencia reduciendo la cantidad de pastillas y la frecuencia de dosificación, para prevenir la toxicidad a corto o largo plazo y mejorar la tolerabilidad, para minimizar interacciones farmacológicas, y también para preservar futuras opciones de tratamiento e incluso visando reducción de costes. La hipótesis de trabajo es que en pacientes infectados por VIH que reciben tratamiento antirretroviral eficaz es posible simplificar el tratamiento y hacerlo más tolerable mediante el uso de nuevos fármacos y de nuevas estrategias sin comprometer su eficacia virológica. En cuanto a la estrategia de simplificación, concluimos que la eficacia de los inhibidores de la proteasa potenciados con ritonavir (IP/r) en monoterapia en la práctica clínica es consistente con los datos de los ensayos clínicos. Por otra parte, la combinación de etravirina más raltegravir es bien tolerada y mantiene la supresión viral duradera en pacientes con supresión virológica seleccionados. Con respecto a la modificación de los regímenes con PI/r en pacientes virológicamente suprimidos se observó que el cambio de PI/r para raltegravir conduce a cambios significativos en biomarcadores cardiovasculares asociados con la inflamación, resistencia a la insulina, y la hipercoagulabilidad. En este contexto abacavir/lamivudina exhibe eficacia y tolerabilidad similar a tenofovir/emtricitabina. Sustitución de un fármaco implicado por otro que está mejor indicado y exhibe una potencia similar es una de las estrategia indicada para manejar las complicaciones del tratamiento antiretroviral. Sin embargo, para los pacientes con mutaciones de resistencia subyacentes este enfoque puede no ser factible. En adultos en uso de IP/r con hipercolesterolemia y aumento del riesgo cardiovascular, se encontró que la rosuvastatina produce mayores descensos en el colesterol total y el colesterol de baja densidad que la sustitución de IP/r. Finalmente, hemos observado que 11% de los pacientes tratados con raltegravir desarrolla elevación significativa de creatina quinasa durante el tratamiento con raltegravir. Sin embargo, los síntomas son poco comunes y no están relacionados con el grado de elevaciones de creatina quinasa. Mientras el conocimiento sobre las complicaciones no infecciosas de la infección por VIH-1 sigue prosperando juntamente con la mejora continua de la terapia antirretroviral, es posible desarrollar nuevas estrategias para limitar su impacto en las personas que viven con el VIH y para asegurarles que puedan envejecer con salud y calidad de vida.

El melanoma metastásico es un modelo de tumor especialmente agresivo y resistente a inmuno, radio y quimioterapia. La pobre prognosis de los pacientes y el preocupante incremento de casos en los últimos años hacen necesario el diseño y desarrollo de nuevos y mejorados agentes anticancerígenos, así como nuevas estrategias más eficaces. Las células de melanoma presentan alteraciones genéticas y moleculares que alteran el control de la proliferación y supervivencia celular. Estas alteraciones permiten superar las barreras de control del crecimiento y migración celular, aspectos asociados no sólo con la inmortalización y adquisición de las propiedades invasivas, sino que también les confieren resistencia frente a tratamientos quimioterapéuticos. Tanto la vía PI3K/AKT/mTOR, como la vía mitogénica mediada por MAPKs, son claves en la supervivencia y crecimiento celular. Ambas vías, a través de GSK-3 se encuentran implicadas en la sobreexpresión de proteínas anti-apoptóticas de la familia BCL-2. La sobreexpresión de esta familia de proteínas facilita que la célula escape a los mecanismos apoptóticos inducidos por agentes citotóxicos convencionales. Por esta razón, estrategias terapéuticas basadas en la inhibición de estas vías han mostrado su potencial en estudios clínicos. Este potencial radica en la activación simultánea de dos mecanismos de muerte celular: apoptosis y autofagia. De entre la familia de compuestos anticancerosos conocidos como prodigininas (PGs), en un principio, prodigiosina destacó por su marcado efecto pro-apoptótico en diferentes líneas tumorales. Actualmente, un derivado sintético de las PGs, obatoclax, que fue diseñado como molécula BH3 mimética, está siendo evaluado en ensayos clínicos en fase III. Sin embargo, los estudios realizados en melanoma muestran la modesta eficacia de obatoclax como agente individual, lo que hacía necesario estudios más exhaustivos sobre los mecanismos de acción de esta molécula. Un efecto citotóxico más marcado se ha obtenido mediante el tratamiento con prodigiosina. A pesar de que ambas moléculas han mostrado desencadenar similares mecanismos moleculares, las diferencias estructurales entre ambas moléculas serían críticas en su actividad. Los nuevos datos aportados contribuyen a un mejor entendimiento de los eventos moleculares que desencadenan la actividad anticancerosa y antimetastásica de las PGs. En este aspecto, la caracterización de PGs como inhibidores duales de mTORC1 y mTORC2 pone en evidencia la relevancia que estas moléculas podrían tener en un futuro en la terapia contra el cáncer. La interacción de PGs al centro activo de mTOR se confirmó mediante técnicas de resonancia de plasmón superficial (SPR), monitorizando las interacciones a tiempo real, usando biosensores ópticos. Los parámetros cinéticos y de afinidad mostraron que ambas moléculas forman complejos estables, específicos, y de alta afinidad a concentraciones nanomolares. Los ensayos de competición con ATP revelaron que no existe competición entre ATP y las PGs por su lugar de unión, sugiriendo que las PGs actúan como inhibidores ATP no miméticos. Un valor añadido de estas moléculas son sus probadas propiedades antimetastásicas. En este aspecto, demostramos que la inhibición de mTOR promueve la desestabilización del complejo ILK/rictor con la consecuente pérdida de señalización a través de la vía de las integrinas, crítica para el movimiento celular. Observamos que, todo ello conlleva a la desorganización del citoesqueleto, pérdida de los contactos focales y pérdida de la capacidad migratoria de las células. Finalmente, estrategias análogas fueron utilizadas para llevar a cabo estudios de relación estructura-actividad de las PGs. La estructura tripirrólica de prodigiosina (PG) contiene grupos amino y metoxi comunes en obatoclax (OBX) relacionados con su actividad citotóxica. El bloqueo de estos grupos mediante la adición del grupo aniónico F2B resultó en la pérdida de actividad de esta molécula. Estos resultados ponen de manifiesto la importancia de estos grupos en la actividad de PGs, y aportan nuevos datos para el diseño de nuevos derivados sintéticos más efectivos y menos tóxicos. / MECHANISMS OF ACTION INVOLVED IN THE ANTICANCER AND ANTIMETASTATIC PROPERTIES OF PRODIGININES. Identification of mTOR as a molecular target in melanoma cells. Because of high chemotherapeutic resistance of metastatic melanoma are necessary new strategies with improved drugs, more effectives with lower toxicity. Anticancer activity of prodiginines has been described in vitro and in vivo in different cancer cell models, including melanoma. Prodiginines are tripyrrolic molecules from bacterial metabolism under pre-clinical and clinical evaluation. In this study we have focused our efforts on identified the molecular mechanisms of prodiginines involved in their cytotoxic effects. In melanoma cells, we have observed the activation of both cell death mechanisms: apoptosis and autophagy after prodigiosin treatment. Our results demonstrate that prodigiosin is a BH3-mimetic drug, as it was previously described for obatoclax (GX15-070). Obatoclax is a synthetic prodiginine derivative actually in clinical trials in phase III. Moreover, we have identified mTOR as a new molecular target of prodigiosin and obatoclax. PI3K/AKT/mTOR pathway is involved in cell survival, proliferation and migration. Different cross-talks and feedback loops regulate this pathway and, also, are involved in different compensatory mechanisms that confer chemoresistance to melanoma cells. Dual inhibition of mTORC1 and mTORC2 mediated by both prodiginines disrupted the negative feedback loop S6K/IRS-1. The interaction of both prodiginines in the active site of mTOR was monitorized by Surface Plasmon Resonance (SPR) assays. Nanomolar kinetic and affinity parameters indicated high affinity, stability and specificity of these interactions. Nevertheless, results showed that both prodiginines are not ATP-mimetic drugs. In silico models showed the detailed atomic view of the complexes indicating the critical residues involved in these interactions. Moreover, structure-activity relationship (SAR) studies corroborated the importance of pyrrole amino groups in the cytotoxic prodiginines activity mediated by mTOR inhibition. Finally, we observed that mTOR inhibition by prodiginines promotes actin filaments desorganization, decrease of focal adhesions and inhibition of cell migration. Our results suggest that prodiginines might inhibit integrin signalling through ILK/rictor complex. Alltogether, these results contribute to further understanding the molecular mechanisms of prodiginines and, also, their chemotherapeutical potential. Moreover, we provide new data about their structural properties that will allow the development of more-effective anticancer molecules.

INTRODUCCIÓ: El dolor lumbar és una síndrome d'etiologia multifactorial que afecta al 80% de la població com a mínim una vegada al llarg de la vida. Degut a la manca de coneixement de l'element causal del dolor, aquest també s'anomena lumbàlgia crònica inespecífica (CLBP). Existeixen en la literatura múltiples estudis respecte les disfuncions musculars de la població amb CLBP, però amb resultats molt diferents i fins i tot oposats. Per altra banda, no existeix una opció clara i unificada en la valoració i el control d'aquestes disfuncions. OBJECTIUS: Presentar i valorar dues eines pel control i valoració de la musculatura del tronc: una eina per a valorar la força isomètrica màxima voluntària (MVC) i una eina per a valorar les múltiples i subtils activacions i desactivacions musculars que es donen en un procés d'estabilització muscular. Al mateix temps, revisar pràctiques metodològiques utilitzades freqüentment en la valoració de la població amb CLBP: utilització d'un pes proporcional a la MVC com a càrrega relativa a l'individu i utilització d'un pes calculat a partir de les mesures antropomètriques d'aquest. Posteriorment, valorar a partir de l'electromiografia (EMG) de superfície algunes de les disfuncions associades a la població amb CLBP que més controvèrsia mostren en la literatura: fatigability i patrons d'activació muscular alterats. Igualment, valorar la similitud d'algunes d'elles amb les disfuncions que la població sana pugui presentar en situació de fatiga. DISSENY: Estudi de validació i fiabilitat de les dues eines desenvolupades i comparació de les dues metodologies revisades en aquest treball. Igualment, estudi transversal amb grup control (comparació de CLBP vs població sana). Anàlisi mitjançant dos tests: un test de fatiga (contracció isomètrica mantinguda, Sorensen Test) i un test per a valorar les característiques de reacció muscular davant d'una pertorbació sobtada. Enregistrament de la musculatura mitjançant EMG de superfície i control de la postura durant els tests amb un sistema d'enregistrament per càmeres de vídeo. Valoració de paràmetres electromiogràfics de fatiga, amplitud de senyal i latències d'activació de la musculatura de tronc i les extremitats, a la vegada que valoració d'angles, alçades i alienacions corporals. PARTICIPANTS: 26 subjectes amb lumbàlgia crònica 26 subjectes sans en edats compreses entre 25 i 55 anys. RESULTATS: Ambdues eines van mostrar una alta fiabilitat i validesa comparativament al gold standard utilitzat en cada cas. Ambdues metodologies utilitzades van mostrar resultats oposats en la determinació de l'existència de fatígabílity en la població amb CLBP respectivament a la població sana. La població amb CLBP, a partir de la utilització de les eines presentades en aquest treball i el mètode considerat més adequat (càrrega relativa a partir de les mesures antropomètriques), va mostrar presentar nivells de fatígability similars a la població sana igualment que uns patrons musculars diferenciats a aquesta població tant en les seves característiques temporals (major latència d'activació entre altres) com en les seves característiques d'amplitud (major activitat muscular). El patró muscular utilitzat pels CLBP davant la càrrega inesperada, presentava similituds amb el patró muscular utilitzat per la població sana amb fatiga pel que fa a les característiques temporals. DISCUSSIÓ I CONCLUSIONS: Les eines i la metodologia desenvolupades en aquest treball representen una millora en l'estudi de la musculatura de la columna. A més a més, es demostra la importància de les metodologies utilitzades, ja que poden afectar en els resultats d'una forma considerable. El comportament muscular de la població amb CLBP tant en una situació d'isometria mantinguda com en l'estabilització d'una pertorbació es diferencia de la població sana podent ser una disfunció que porti a la cronificació del dolor. La població amb CLBP podria presentar un estat neuromuscular inicial als test similar a la població sana fatigada, tot i que la velocitat de fatigar-se durant un esforç isomètric (fatigabilíty) no va mostrar diferències significatives entre poblacions. / INTRODUCTION: Back pain is a syndrome with multifactorial etiology that affects 80% of the population at least once in their lifetime. Due to the lack of knowledge concerning its causal factors, it is also known as non-specific chronic low back pain (CLBP). There are multiple studies in research literature regarding muscle dysfunctions of CLBP subjects, but very different results have been observed, which can even be contradictory at times. Furthermore, there is no clear and unified direction regarding the assessment and monitoring of this dysfunction. OBJECTIVES: To present and evaluate two tools for monitoring and assessing trunk muscles: a tool to evaluate maximum voluntary isometric strength (MVC) and a tool to evaluate the multiple subtle muscle activations and deactivations that occur during the process of muscular stabilization. At the same time, the study aims to review some of the methodological practices commonly used in the assessment of CLBP subjects: using a weight proportional to the MVC as the load to be applied to the individual and using a weight calculated from the individual's anthropometric measurements. Subsequently, some of the dysfunctions associated with CLBP subjects which are most controversial in research will be evaluated using surface electromyography (EMG) procedures: fatigability and altered muscle activation patterns. The study will equally address the similarity of some of these with dysfunctions which healthy subjects may experience in situations of fatigue. DESIGN: A validation and reliability study of the two tools developed, together with a comparison of the two methods are reviewed in this paper. At the same time, the study is transversal with the inclusion of a control group (CLBP subjects compared to healthy subjects). The analysis was carried out using two tests: a fatigue test (maintained isometric contractions, Sorensen test) and a test to evaluate the characteristics of muscular reaction to a sudden increased load. Muscles were recorded by surface EMG, and posture control during the tests was filmed by a video camera recording system. EMG fatigue parameters, EMG signal amplitude and latencies of trunk and limb muscle activation were evaluated together with body angles, heights and positions. PARTICIPANTS: 26 subjects with chronic low back pain and 26 healthy subjects, all between the ages of25 and 55. RESULTS: Both tools showed high reliability and validity in comparison to the gold standard used in each case. Both methodologies used showed opposite results in the determination of the existence of fatigability in CLBP subjects compared to healthy subjects. From the use of the tools presented in this work and the method considered most appropriate, (proportionate loads based on anthropometric measurements) CLBP subjects showed increased levels of fatigability similar to those of the healthy subjects, as well as demonstrating muscular patterns that were different from the healthy subjects both in their temporal characteristics (higher latency activation among others) and their amplitude characteristics (greater muscular activity). The muscular pattern used by CLBP subjects when faced with the unexpected load was similar to that of the fatigued healthy subjects fatigue as far as temporary characteristics were concerned. DISCUSSION AND CONCLUSIONS: The tools and methodology developed in this work represent an advance in the study of spinal muscles. Furthermore, the importance of the different methodologies used is demonstrated, as this can affect the results obtained in a significant way. The muscular behaviour ofCLBP subjects, both in a maintained isometric situation as well as in the stabilization process following an increased load, differs from the healthy population, which could well be a dysfunction that leads to the pain becoming chronic. CLBP subjects present an initial neuromuscular state in the test which is similar to that of the fatigued healthy subjects, although the rate of fatigue during isometric effort (fatigability) showed no significant differences between the two groups.

El càncer es un conjunt de més de 100 malalties que es caracteritzen per l'acumulació de múltiples alteracions genètiques. Nosaltres ens hem centrat en l'estudi de tres tipus de tumors sòlids epitelials: tumors esporàdics de bufeta, tumors hereditaris o familiars de càncer colorectal i de càncer ronyó.Per aquests estudis la tècnica més àmpliament utilitzada ha estat la Hibridació Genòmica Comparada (CGH), que permet fer un anàlisi global del genoma tumoral, i dona informació sobre quins desequilibris es produeixen més freqüentment, indicant quines regions serien susceptibles de contenir gens supressors de tumors o oncògens; a més també permet portar a terme estudis de clonalitat i detectar patrons d'evolució cromosòmica.Pel que fa als tumors de bufeta, vàrem observar que el dany genòmic augmenta a mida que augmenta l'estadi i grau tumoral, sent els desequilibris més freqüents, les pèrdues de 9q,9p,5q,8p i els guanys de 1q, Xq,17q,8q i 20q. Hi ha però una sèrie d'alteracions que presenten diferencies significatives entre els diferents estadis, entre pTa i pT1 són les pèrdues de 5q, 9p, 9q, 10q, 8p, 11q, 18q i els guanys de 8q,10p. Mentre que entre pT1 i pT2-T4, són els guanys a 5p,7p,3p,10p i pèrdua de 6q.Un elevat nombre dels tumors estudiats eren tumors superficials o mínimament infiltrants, els quals els vàrem classificar en base als patrons de desequilibris genòmics observats, de manera que es va posar de manifest l'existència de tres subgrups: el primer caracteritzat per la predominança de guanys, essent 1q,1p,17q,19p els més freqüents, el segon caracteritzat per pèrdues afectant principalment a 9q,9p,11q,8p,5q,11p, i un tercer grup caracteritzat per la presència d'un nombre baix de desequilibris. El fet de trobar dos subgrups amb cariotips complexes podria suggerir que l'evolució d'aquests tumors es produiria com a mínim per dues vies una caracteritzada per guanys i l'altre per pèrdues. Per altra banda, el 30% dels tumors urotelials presenten multifocalitat, fet que converteix aquests tumors en un model excepcional per l'anàlisi de les diferents relacions entre tumors esporàdics sincrònics. L'estudi d'aquests tumors sincrònics d'un mateix pacient ens va confirma el seu origen monoclonal i ens va permet traçar vies d'evolució a partir d'un únic tumor original.Pel que fa a l'estudi de tumors sincrònics familiars, vàrem fer dos estudis, un amb tumors de pacients afectats de Càncer Renal Papil·lar Hereditari (HPRC), i un altre amb tumors de pacients afectats de Poliposi Adenomatosa Familiar (FAP); l'estudi d'aquests tumors proporciona un model natural excel·lent per estudiar les alteracions presents en estadis primerencs de la evolució tumoral i proporcionar alhora important informació sobre el dinamisme de formació de les alteracions en aquests tumors.Pel que fa a l'estudi de HPRC es va observar la presència d'alteracions cromosòmiques estructurals idèntiques en diferents tumors d'un mateix pacient fet que suggereix un origen embrionari comú, o que la predisposició genètica pot condicionar l'adquisició d'alteracions a regions cromosòmiques específiques. També es va estudiar el comportament de MET (els pacients que pateixen aquesta malaltia presenten la mutació d'aquest proto-oncogen en la línia germinal, fet que predisposa a HPRC); vàrem observar que la duplicació del gen MET portador de la mutació germinal va associada a la trisomia 7. En aquells tumors amb tetrasomia 7 s'observava la duplicació tant de l'al·lel normal com del mutat.Pel que fa a l'estudi de patrons d'evolució en càncer colorectal a partir de l'anàlisi dels desequilibris presents en adenomes i carcinomes procedents de tumors de pacients afectes de FAP; vàrem observar que els diferents adenomes d'un mateix pacient mostren una clara relació genètica indicant un patró comú d'evolució. Aquest fet suggereix, de nou, que la predisposició genètica pot condicionar l'addquisició d'alteracions genòmiques en subregions cromosòmiques específiques. / Under the concept of cancer there is a group of more than a hundred illness that are caracterized by the accumulation of multiple genetic alterations. We have focused our study in three different kinds of epithelial solid tumours: sporadic bladder tumours, hereditary or familial colorectal cancer and kidney cancer. In order to analyze these tumours, we applied the Comparative Genomic Hybridization (CGH) technique. The global analysis of the tumoral genome allowed by this technique provides information about the frequency of unbalances, the regions where these unbalances are located and about which of these regions could be more susceptible to contain tumour supressor genes or oncogenes. Moreover, this technique also allows us to perform clonality studies and to detect different patterns of chromosomal evolution.In the bladder tumours, we observed that the genomic damage increases with the tumoral stage and grade. The unbalances that were more frequently found were the losses of 9q, 9p, 5q, 8p and the gains of 1q, Xq, 17q, 8q and 20q. However, there is a group of abnormalities that present significant differences among the different tumoral stages. Between pTa and pT1, are the losses of 5q, 9p, 9q, 10q, 8p, 11q, 18q and the gains of 8q and 10p. Between pT1 and pT2-4, are the gains of 5p, 7p, 3p, 10p and the loss of 6q.The classification of the superficial or minimally invasive tumours according to their observed patterns of genomic unbalances allowed us to subclassify them in three different subgroups. The first subgroup was characterized for the predominance in gains, being +1q, +1p, +17q and +19p the most frequents. The second subgroup was characterized for the losses of 9q, 9p, 11q, 8p, 5q, 11p and the third subgroup was characterized for a low number of unbalances. The fact of finding two subgroups with complex karyotypes could suggest that these tumours could have evolved from two different pathways, one characterized for gains and the other for losses.On the other hand, 30% of the bladder tumours present multiplex damages, and this fact makes these tumours an excellent model for the analysis of the different relations between sincronous sporadic tumours. The study of sincronic tumours from the same patient confirmed their monoclonal origin and allowed us to design the evolutive pathway from a single original tumour.We performed two analysis, one in tumours of patients affected of Hereditary Papilary Renal Cancer (HPRC) and one in tumours of patiens affected of Familiar Adenomatose Poliposi (FAP). These kind of tumours provides an excellent natural model to study the chromosomal aberrations in primary stages of tumoral evolution. In addition, they provide important information about the dynamics of formation of these aberrations in the tumours.Identic structural chromosomal aberrations were found in different tumours of the same patient affected of HPRC. This fact suggest either a common embrionary origin or conditioned adquisition of alterations in specific chromosomal regions due to the genetic predisposition. The behaviour of the MET gen was also studied in these patients. The duplication of the MET gen was found to be associated with the trisomy of chromsome 7. In those tumours with tetrasomy of chromosome 7, both normal and mutated alleles were found to be duplicated.The analysis of unbalances present in adenomes and carcinomes from patients affected of FAP allowed the establishment of evolution patterns of colorectal cancers. We observed that the different adenomes from a same patient affected of FAP display a strong genetic relation, which indicates a common evolution pattern. Again, this fact suggest that the genetic predispostion may direct the adquisition of genomic alterations in specific chromosomal subregions.

INTRODUCCIÓN.- El beneficio a corto plazo de la angioplastia coronaria (ACTP) ha sido demostrado y su efectividad a largo plazo parece también mantenida. Sin embargo, su mayor limitación es el problema de la reestenosis. La respuesta fibrocelular, que es el principal mecanismo de la reestenosis, es uno de los eventos básicos en el desarrollo de las lesiones avanzadas de la aterosclerosis. Aunque el curso en el tiempo de la reestenosis post-angioplastia y de la progresión en la aterosclerosis coronaria son diferentes, la similitud en los mecanismos pueden sugerir una relación entre ambos y algunos estudios han descrito el desarrollo acelerado de estenosis coronarias en localizaciones proximales a los segmentos donde se habían efectuado dilataciones. Adicionalmente, en los pacientes sin reestenosis post-angioplastia, la evolución anatómica a más largo plazo de la estenosis residual no es bien conocida. No ha sido descrito si, durante el seguimiento, la estenosis residual permanece estable, disminuye, o aumenta progresivamente su severidad. OBJETIVOS DEL ESTUDIO.- Se realizó un estudio angiográfico secuencial en una serie consecutiva de pacientes que habían sido sometidos a una angioplastia coronaria eficaz para determinar la relación existente entre la presencia inicial de reestenosis post-angioplastia y la aparición posterior de progresión en la aterosclerosis coronaria y para evaluar la evolución anatómica a largo plazo de la estenosis residual de la lesión dilatada en un grupo de pacientes sin reestenosis inicial. MATERIAL Y MÉTODO.- Noventa y ocho pacientes en los que se realizó una ACTP eficaz sobre 110 lesiones de arterias nativas fueron incluidos en el estudio para evaluar la relación entre reestenosis post-angioplastia y progresión de la aterosclerosis.. Sesenta y tres pacientes sin reestenosis precoz fueron incluidos en un estudio angiográfico seriado para determinar la evolución en la estenosis residual post-ACTP a largo plazo.La valoración de los cambios en la severidad de la lesión producidos mediante la angioplastia, y la evolución de la estenosis residual en los diferentes controles angiográficos fueron analizados mediante un sistema de análisis angiográfico cuantitativo. Se consideró reestenosis post-angioplastia cuando un segmento dilatado mostraba en la coronariografía de control una estenosis de una severidad igual o superior al 50 %. Se consideró que se había producido progresión de la enfermedad coronaria cuando por análisis visual se documentó una disminución +/- 20% en el diámetro del vaso que inicialmente mostraba una estenosis +/- al 50%, o una reducción +/- 30% de la luz cuando la estenosis inicial fue < al 50%. Una serie de variables clínicas, angiográficas y de procedimiento fueron evaluadas prospectivamente en cada paciente. RESULTADOS.- Progresión de la aterosclerosis y angioplastia coronaria.- Un seguimiento angiográfico precoz fue realizado tras un intervalo medio de 5 ± 2 meses después de la ACTP. El diagnóstico de reestenosis fue realizado en 39 lesiones (35%) pertenecientes a 37 pacientes (38%). Treinta y siete pacientes con reestenosis fueron sometidos a un estudio angiográfico tardío 32 ± 10 meses después de la primera angioplastia. Cincuenta y ocho pacientes sin reestenosis fueron sometidos a un reestudio angiográfico tardío a los 34 ± 12 meses post-ACTP. Se observó progresión de la aterosclerosis coronaria en 53 segmentos de 31 pacientes (34%) después de los 18 meses post-angioplastia. En la valoración de la relación existente entre reestenosis post-angioplastia y progresión de la aterosclerosis coronaria, se observó progresión en el estudio angiográfico tardío en 22 (38%) de los 58 pacientes sin reestenosis, en comparación a 9 (33%) de los 27 pacientes con reestenosis (p= NS). En relación al momentos cronológicos de reestenosis post-angioplastia y progresión de la aterosclerosis: En las lesiones con reestenosis, el diámetro de la estenosis aumentó desde el 35 ± 8 % hasta el 73 ± 11 % (p< 0.001) en el reestudio angiográfico inicial. Por el contrario, el diámetro de la estenosis aumentó mucho más lentamente en las lesiones con progresión, desde el 9 ± 18 % hasta el 20 ± 28 % (p< 0.001) en el reestudio inicial y hasta el 53 ± 21 % (p<0.001) en el reestudio tardío. La velocidad de empeoramiento de las lesiones expresada como cambio en el porcentaje de estenosis dividido por los meses entre estudios angiográficos, fue mucho más rápida para las lesiones con reestenosis que para las lesiones con progresión: 12.3 ± 10 %/mes versus 1.1 ± 0.7 %/mes (p<0.0001). El sexo masculino (p= 0.01), el tabaquismo )p= 0.06) y la ausencia de disección post-angioplastia (p< 0.05) fueron identificados como factores predictivos de reestenosis. Entre las diferentes variables analizadas, únicamente el antecedente de diabetes y una historia previa de infarto de miocardio mostraron diferencias significativas entre los pacientes con y sin progresión (p<0.05, y p= 0.05, respectivamente). Nuevas estenosis adyacentes a los segmentos dilatados.-. Se observó progresión de la aterosclerosis en segmentos no dilatados en 16 (17%) de 94 vasos dilatados en comparación a 25 (14%) de 176 vasos no dilatados (p= ns). Entre los 31 pacientes con progresión de la aterosclerosis se observó progresión en 16 (48%) de 33 vasos dilatados y en 25 (41%) de 60 vasos no dilatados (p= ns).Evolucion de la estenosis residual post-angioplastia.- En el grupo de pacientes en el que se analizó la evolución de la estenosis residual de la lesión dilatada se efectuaron controles angiográficos precoces y tardíos de seguimiento, 5 ± 1 meses y 37 ± 20 meses después del procedimiento, respectivamente. La angioplastia produjo inicialmente una disminución de la severidad de la estenosis desde un porcentaje de estenosis pre-ACTP de 72 ± 13 % hasta un porcentaje de 41 ± 14 % (p< 0.0001) inmediatamente post-ACTP. En el control angiográfico realizado a los 5 ± 1 meses post-angioplastia, la estenosis residual mostró una severidad del 31 ± 14 % (p<0.001 vs post-ACTP inmediata). Asimismo, en el control angiográfico realizado a los 37 ± 20 meses después de la angioplastia, la estenosis había experimentado una nueva reducción hasta una severidad del 23 ± 15 % (p<0.001 vs post-angioplastia inmediato y p<0.001 vs 5 meses). El análisis multivariado de regresión logística por pasos identificó que el empleo durante el procedimiento de una elevada relación entre los diámetros balón/arteria (p= 0.001), la ausencia de diabetes mellitas (p= 0.008) y la presencia del antecedente de hipertensión arterial (p= 0.01) fueron predictores de la reducción producida en la estenosis residual. CONCLUSIONES: La aparición de la reestenosis post-angioplastia es un fenómeno independiente de la progresión de la arteriosclerosis coronaria. La instrumentalización realizada en los vasos coronarios durante la angioplastia, no acelera el desarrollo de lesiones ateroscleróticas en la arteria dilatada. Un número significativo de pacientes con lesiones coronarias que han sido dilatadas de forma eficaz mediante angioplastia y que no presenta reestenosis en el control angiográfico inicial muestran, durante el seguimiento posterior, una progresiva reducción en la severidad de la estenosis residual. / "ATHEROSCLEROSIS PROGRESSION AND EVOLUTION OF THE RESIDUAL STENOSIS AFTER CORONARY ANGIOPLASTY: LONG-TERM ANGIOGRAPHIC STUDY"ABSTRACT:BACKGROUND.- The major limitation of coronary angioplasty (PTCA) is the problem of restenosis. The fibrocelular response is the principal mechanism of restenosis and is also the main component of the development of atherosclerotic lesions. Furthermore, the long-term evolution in the residual estenosis in patients without early restenosis in not completely known. STUDY OBJECTIVES.- To determine the relationship between early restenosis post-PTCA and the long-term atherosclerosis progression, an angiographic study was performed in a series of consecutive patients who underwent a successful PTCA. In the same cohort of patients, the long-term evolution of the residual stenosis was evaluated. METHODS.- Ninety eight patients whom underwent a successful PTCA were included to evaluate the relationship between restenosis and progression, and 63 patients, without early restenosis, were included in a sequential study to determine the long-term evolution of the residual estenosis post-PTCA. Changes in the stenosis severity were analysed by quantitative coronary angiography. Restenosis was defined as a stenosis +/- 50 % during the follow-up. Atherosclerosis progression was defined as a more 20% decrease in the diameter of a vessel initially narrowed by +/- 50% or a +/- 30% decrease when the initial stenosis was < 50%.RESULTS.- Atherosclerosis progression and coronary angioplasty.- An early angiographic follow-up was performed 5 ± 2 months after angioplasty. Restenosis was documented in 37 patients (38%). These patients were again angiographically evaluated 32 ± 10 months post-PTCA. A new angiographic study was performed in 58 patients without restenosis, 34 ± 12 months post-procedure. Coronary progression was observed in 53 segments from 31 patients (34%) more than 18 months post-angioplasty. In the evaluation of the relationship between restenosis post-angioplasty and atherosclerosis progression, long-term progression was documented in 22 (38%) of the 58 patients without restenosis, in comparison to 9 (33%) of 27 patients with restenosis (p= NS). Long-term evolution of the residual stenosis post-angioplasty.- In the group of patients evaluated to determine the evolution of the residual stenosis, an angiographic study was performed 5 ± 1 month and 37 ± 20 months after the procedure. Coronary angioplasty produced an initial reduction in the percentage of stenosis from 72 ± 13 % pre-PTCA to 41 ± 14 % (p< 0.0001) immediately post-PTCA. In the early angiogram 5 ± 1 month post-angioplasty, the residual stenosis showed a severity of 31 ± 14 % (p<0.001 vs immediately post-PTCA). Additionally, in the control performed 37 ± 20 months after, the residual stenosis experienced a further reduction to 23 ± 15 % (p<0.001 vs 5 months). CONCLUSIONS: Restenosis post-angioplasty and progression of atherosclerosis are independent phenomena. In patients without restenosis, the residual stenosis post-angioplasty shows a long-term reduction during the follow-up.

La infecció tuberculosa latent (ITBL) afecta actualment a un terç de la humanitat, és a dir, a 2.500 milions de persones. L'interès en el seu estudi i tractament es basa en el fet que en un 10% dels casos tindrà lloc un recreixement bacil·lar, que donarà lloc a una tuberculosi (TB) activa.Aquest fet és especialment perillós perquè encara es desconeixen els mecanismes implicats en aquesta reactivació, o sigui que ens manquen factors pronòstics. I perquè, a més a més, el tractament de la ITBL és extremadament llarg (9 mesos d'isoniazida), i això fa que moltes vegades aquesta mesura terapèutica ni es plantegi a nivell de mesura sanitària.A partir de les observacions obtingudes en l'estudi de l'evolució de les lesions en el model de TB experimental en el ratolí, es va generar un model de TB "humanitzat" que generava necrosi intragranulomatosa pulmonar (INPG). Inicialment, la INPG s'originava mitjançant la inoculació de LPS intranasal, però degut a l'elevada taxa de mortalitat dels animals, el model es va estandarditzar portant a terme la infecció per aerosol amb soques de M. tuberculosis capaces de desenvolupar INPG de manera espontània.Gràcies a aquest model humanitzat es va poder provar un nou règim terapèutic basat en la hipòtesi que la inoculació, després d'una pauta curta de tractament antibiòtic, amb fragments de M. tuberculosis cultivats en condicions d'estrès i detoxificats (vacuna RUTI) seria capaç de controlar la reactivació bacil·lar, i ser una eina terapèutica eficaç per reduir el temps de tractament actual de la ITBL. En aquest sentit, els estudis inicials mostraven la reactivitat de diferents subtipus d'IgG contra proteïnes presents en la vacuna, i la capacitat bactericida de la resposta immune generada, en soques de ratolí resistent (C57BL/6) i susceptible (DBA/2).Portant a terme estudis més amplis sobre la resposta immune generada mitjançant la immunoteràpia amb RUTI després d'una pauta curta de tractament antibiòtic, s'ha volgut avaluar tant el component humoral, com el cel·lular.Realitzant sèrum-teràpia passiva amb anticossos, obtinguts després de portar a terme aquest tractament combinat en ratolins DBA/2, es va veure que el model de ratolí severament immunodeprimit SCID era capaç de controlar la reactivació bacil·lar i presentava un nombre inferior d'abscessos pulmonars. Pel que fa a l'avaluació de la resposta cel·lular, els resultats obtinguts mitjançant el mateix esquema de tractament confirmen el que s'observa en els estudis anteriors.I finalment, cal destacar una total absència de toxicitat deguda a la inoculació de la vacuna RUTI, ni en el model de ratolí, ni en el conill porquí. / It has been estimated that one third of mankind harbors a latent infection with Mycobacterium tuberculosis. In a 10% of cases a reactivation in the bacillary load will generate active tuberculosis (TB).This is especially dangerous because we don't know the mechanisms implicated in this reactivation process. In other words, we don't have prediction factors. Furthermore, the chemotherapy treatment is 9 months of isoniazida.Studies about evolution of the lung lesions in the experimental TB model in mice allowed us to generate a TB "humanized" model. The main purpose of this model was to generate pulmonary intragranulomatous necrosis (INPG). Initially, necrosis was generated with intranasal inoculation of LPS, but there was a high mortality associated (up to 20%). Then "humanized" model were standardized with aerosol infection with Mycobacterium tuberculosis strains that develop necrosis spontaneously.The new "humanized" model allow us to test a new immunotherapeutic strategy based on the hypothesis that after a short-term chemotherapy the vaccine RUTI (Mycobacterium tuberculosis fragmented and detoxified) is able to control bacillary reactivation, and it could be a good immunotherapeutic tool to reduce the duration of treatment.In this sense, initial studies showed that all subtypes of IgG against proteins contained in the vaccine were implied. And the immune response generated with RUTI implied a bactericidal activity in resistant (C57BL/6) and susceptible (DBA/2) mice strains.Further studies were carried out in order to evaluate humoral and cellular components of immune response generated with RUTI.Passive serum-therapy with polyclonal antibodies obtained from DBA/2 mice immunized with RUTI in immunodepressed mice model (scid) revealed a capacity to control bacillary reactivation by humoral immune response and a reduction in the presence of granulomas and abscesses. And RUTI-immunotherapy treated mice revealed the same capacity.Finally, any toxicity effects were found in RUTI vaccinated animals.Our data suggest that RUTI would be useful immunotherapeutic vaccine against Mycobacterium tuberculosis infection by triggering a wide response against a lot of peptides present both in growing and non growing bacilli.

El projecte principal d'aquesta tesi és la valoració de la resposta immune induïda per la vacuna RUTI®en el context d'un estudi de Fase 1. La hipòtesi fromulada fou que la RUTI®, per ser una vacuna generada a partir dels fragments de M.tuberculosis cultivats en estrès, pot generar una resposta poliantigènica segura en pacients no infectats. Per això, l'objectiu fou dissenyar i dur a terme l'avaluació de la immunogenicitat de la vacuna RUTI®per primera vegada en humans. L'estudi va implicar dues fases: la preparació i l'execució, d'un any i mig de duració, que foren seguides d'un altre any per a analitzar les dades obtingudes i la conseqüent redacció dels documents pertinents. La preparació va incloure el treball conceptual de disseny de l'estudi; l'elecció i l'establiment de tècniques que serien utilitzades en l'execució; l'organització logistíca de l'execució i el redactat dels procediments específics referents a les tècniques. Durant la planificació varen sorgir dubtes conceptuals que es varen haver de resoldre i varen generar dos estudis menors, que també s'han inclòs: 1) l' avaluació de la producció d'autoanticossos en sèrum de ratolins vacunats amb RUTI® i 2) la detecció d' ITBL durant l'screening: avaluació de la influència del TST sobre les respostes immunològiques mesurades per TIGRA. El primer estudi va demostrar que la vacunació amb RUTI® no indueix ANA detectables en sèrum però que la infecció per M.tuberculosis sí, i de forma independent del tractament administrat. La conclusió de l'estudi número 2 fou que en realitzar el TST quinze dies abans de començar el seguiment dels voluntaris, no es podia excloure en absolut detectar mitjançant TIGRA unes respostes immunològiques alterades fictíciament, fins i tot tractant-se d'individus sans. Els resultats obtinguts foren suficientment alarmants com per a decidir no incloure el TST a l'screening de l'assaig de Fase 1. El veritable cos del projecte, l'avaluació de la immunogenicitat de RUTI®en humans, es descriu al text com a estudi número 3. Dut a terme en el context d'un assaig clínic de Fase 1, pretenia avaluar la immunogenicitat de 4 dosis diferents de la vacuna en individus sans. Testades seqüencialment per tal de detectar qualsevol efecte secundari que pugués posar en perill la seguretat dels voluntaris, cadascuna de les dosis fou assajada en 4 voluntaris sans dins d'un grup en què també participaven 2 voluntaris que foren vacunats amb placebo. La vacuna es va administrar dues vegades separades per 28 dies, i el seguiment dels participants es va allargar a 6 mesos cadascun. Donat que abans de començar l'assaig de Fase 1, es desconeixien els possibles efectes de la vacuna RUTI®en humans i que aquesta havia estat dissenyada per al tractament de la ITBL, es desconeixia si en població sana la RUTI®tindria la força suficient per a generar una resposta específica en contra de M.tuberculosis que fos mesurable. Per això es va incloure un rang tan ampli de tècniques amb dues finalitats: 1) per a avaluar l'impacte de la vacunació sobre les respostes immunològiques, per tal de detectar qualsevol resposta deguda a la RUTI®, i 2) determinar quins assajos serien útils en els futurs estudis del desenvolupament clínic. Els resultats de les tècniques que avaluaven la resposta cel·lular van demostrar una tendència dosi-resposta per la majoria d'assajos, assenyalant la dosi de 25µg de FCMtb com la més poliantigènica. L'avaluació de la resposta humoral va demostrar una pauta d'increment d'IgM enfront els antígens de M.tuberculosis amb uns nivells d'IgG baixos similar a la que existeix en individus contactes de malalts tuberculosos. En quant a relació entre els resultats de l'avaluació de seguretat i la d'immunogenicitat, si bé els EA locals semblaren mantenir certa correlació amb l'assaig de memòria únicament, una resposta immunològica específica deguda a la vacunació amb RUTI®no va implicar una més alta incidència d'EA. Les conclusions del treball serien que: 1) la vacuna RUTI®és immunogènica en individus sans, 2) les respostes immunològiques de tipus cel·lulars aconseguides en general seguiren una tendència dosi-resposta, obtenint la resposta més poliantigènica amb la dosi de 25µg de FCMtb; i 3) com a experiència de l'estudi, en la realització en assajos futurs caldria incloure en el desenvolupament clínic de la vacuna: a) l'avaluació de la immunitat cel·lular mitjançant ELISPOT enfront PPD i els antígens de M.tuberculosis ESAT-6, 85B, i 16 i 38kDa; b) l'assaig de memòria; i c) l'avaluació de la resposta humoral enfront els mateixos antígens. / The original project of this thesis was the evaluation of the immune response induced by the antituberculous vaccine named RUTI¨ in the context of a Phase 1 Clinical Trial. The hypothesis of the study was that RUTI¨, for being generated from fragments of M.tuberculosis grown in stressed cultures, could trigger a safe and poliantigenic response in healthy volunteers. To prove the hypothesis, the objective was to design and perform the evaluation of RUTI¨'s immunogenicity in humans, for the first time. The study implied two phases: the preparation, which lasted 1 and a half years, and another year and a half for the execution and analyisis of all data, with the subsequent reporting. The preparation included the design of the study, the selection and set-up of all the techniques, the organisation, and the generation of the specific procedures for all the assays. During the planning, some conceptual doubts arisen, thus 2 minor studies were designed and performed to solve them, both of them being included in the thesis: 1) evaluation of the autoantibodies' production in the serum of RUTI¨ vaccinated mice; and 2) detection of ITBL by TIGRA during the screening: evaluation of TST influence on the immune responses measured by TIGRA. The first study demonstrated the vaccination with RUTI®does not generate detectable ANA in serum, but M.tuberculosis itself does regardless the treatment. The conclusion of study number 2 was that to perform the TST fifteen days before starting the follow-up of the volunteers could influence the results of the immune responses measured by TIGRA, even in healthy people. The results obliged us to exclude the TST from the screening of the volunteers to be included in the Phase 1 CT. The original project -the evaluation of the immunogenicity of RUTI®when administered to humans-has been included in the thesis as study 3. Performed in the context of a Phase 1 CT, it aimed to evaluate the immunogenicity of 4 different doses of the vaccine in healthy volunteers. Sequencially tested (in order to detect any adverse effect who could impair the safety), every dose was administered to 4 volunteers of a group of 6, where the other 2 received placebo. The vaccine was administered twice (28 days apart), and the follow-up of each participant lasted 6 months. As no effect of RUTI®in humans was previously known and the vaccine was designed to treat the LTBI, the doubt was if the vaccine could be able to generate a sufficient specific response against M.tuberculosis to be detected. To determine this, a wide range of assays were included, with 2 aims: 1) to evaluate the impact of the vaccination on the immune responses and 2) to determine which assays could be useful in future clinical trials to be conducted during the development plan of the vaccine. The results of the assays intending to evaluate the cellular immune response demonstrated a dose-response tendency for most of them, signaling the dose of 25µg of FCMtb as the most poliantigenic one. The evaluation of the humoral response demonstrated a pattern with an increase of IgM antibodies against M.tuberculosis antigens together with IgG antibodies levels, similar to the one found in contact people of M.tuberculosis patients. Regarding the relationship between the results obtained in both the evaluation of the safety and of the immunogenicity, even if the local AE seemed to have some correlation with the memory assay, a specific immune response due to the vaccination did not imply a higher incidence of AE. The conclusion of the study are: 1) the vaccine RUTI®is immunogenic in healthy individuals; 2) the immune responses obtained in general followed a dose-response tendency, the dose of 25µg of FCMtb being the most poliantigenic; and 3) as result of the study, we would recommend to include the following assays in future clinical trials: a)the evaluation of cellular immune response by ELISPOT against PPD and the following M.tuberculosis antigens: ESAT-6, 85B, and 16 and 38kDa; b) the memory assay; and c) the evaluation of the humoral immune response against the same M.tuberculosis antigens.

L'objectiu d'aquesta tesi doctoral és l'anàlisi de l'expressió de l'RNA de citocines en la glàndula salival menor de pacients amb la síndrome de Sjögren primària (SSp).S'han analitzat 42 biòpsies de glàndula salival menor de pacients amb la SSp, 12 amb una SSp probable i 30 amb una SSp definida. L'anàlisi de l'RNA total es va realitzar per normalització amb retrotranscripció i reacció en cadena de polimerasa (RT-PCR), utilitzant oligo-dt com a sonda per a la RT i sondes específiques per a l'amplificació d'IL-2, IFN- g, IL-12, IL-18, IL-4, IL-10, TGF-b i TNF- a. Els resultats van ser analitzats en relació al: 1.- Diagnòstic de la SSp probable (12 pacients) i SSp definida (30 pacients), seguint els critèris diagnòstics europeus. 2.- Grau d'afectació histológica, d'acord amb la classificació de Chisholm i Mason. 3.- Temps d'evolució clínica, des de l'inici de la simptomatologia clínica fins al moment de realitzar la biòpsia de glàndula salival menor, fent un tall arbitrari als 12 mesos d'evolució clínica.Aquesta tesi doctoral demostra la presència d'un patró predominant Th1 d'expressió limfocitària en la glàndula salival menor de pacients amb la SSp, com demostra la presència d'IL-2 i IFN- g; i dels inductors d'aquest patró Th1, la IL-12 i IL-18, en la majoria dels pacients amb la SSp. No es detecta IL-4 en cap de les mostres estudiades, descartant la presència d'un patró Th2. Tambè hi havia, en la majoria de les mostres, IL-10, TGF- b i TNF- a, citocines pro-inflamatòries. No es va detectar diferències estadísticament significatives en la comparació del perfil de citocines entre els pacients amb una SSp definida i probable, en relació amb el grau d'afectació histológica, ni en relació a la formació o no de focos d'infiltració limfocitària. En canvi, hi havia un increment en l'expressió de la IL-2 i de l'IFN-g, amb significat estadístic, en els pacients amb més de 12 mesos d'evolució clínica.Conclusions: 1.- No hi han diferències en l'expressió de l'RNAm de citocines en la glàndula salival menor de pacients amb la síndrome de Sjögren primària definida i probable. 2.- El patró predominant d'expressió de citocines en la glàndula salival menor en pacients amb la síndrome de Sjögren primària és un patró Th1. 3.- La IL-12 i IL-18 són inductors del patró Th1 en la síndrome de Sjögren. 4.- L'expressió de l'RNAm de citocines no varia en relació al grau d'afectació histológica, ni en relació amb el número total de formació de focos. 5.- Els pacients amb la síndrome de Sjögren primària amb més temps d'evolució clínica presenten un increment significatiu en l'expressió del patró Th1. / El objetivo de esta tesis doctoral fue el análisis de la expresión del RNA de citoquinas en la glándula salival menor de pacientes con el síndrome de Sjögren primario (SSp). Se ha analizado 42 biopsias de glándula salival menor de pacientes con el SSp, 12 con un SSp probable y 30 con un SSp definido. El análisis del RNA total se realizó por normalización con retrotranscripción y reacción en cadena de polimerasa (RT-PCR), utilizando oligo-dt como sonda para la RT y sondas específicas para la amplificación de IL-2, IFN- g, IL-12, IL-18, IL-4, IL-10, TGF-b y TNF- a. Los resultados fueron analizado en relación al: 1.- Diagnóstico de SSp probable (12 pacientes) y SSp definido (30 pacientes), siguiendo los criterios diagnósticos europeos. 2.- Grado de afectación histológico, de acuerdo con la clasificación de Chisholm y Mason. 3.- Tiempo de evolución clínica, des del inicio de la sintomatología clínica hasta el momento de realizar la biopsia de glándula salival menor, realizando un corte arbitrario a los 12 meses de evolución clínica.Esta tesis doctoral demuestra la presencia de un patrón predominante Th1 de expresión linfocitario en la glándula salival menor de pacientes con el SSp, con la detección de IL-2 y IFN- g; y de los inductores de este patrón Th1, IL-12 y IL-18 en la mayoría de los pacientes con el SSp. No se detecto IL-4 en ninguna de las muestras estudiadas, descartando la presencia de un patrón Th2. También se detecto en la mayoría de las muestras IL-10, TGF- b y TNF- a, citoquinas pro-inflamatorias. No se detecto diferencias estadísticamente significativas en la comparación del perfil de citoquinas entre los pacientes con un SSp definido y probable, en relación con el grado de afectación histológica ni en relación a la formación o no de focos de infiltración linfocitario. En cambio, hay un incremento en la expresión de la IL-2 y del IFN-g, con significado estadístico, en los pacientes con más de 12 meses de evolución clínica.Conclusiones: 1.- No hay diferencias en la expresión del RNAm de citoquinas en la glándula salival menor en pacientes con el síndrome de Sjögren primario definida y probable. 2.- El patrón predominante de expresión de citoquinas en la glándula salival menor en pacientes con el síndrome de Sjögren primario es un patrón Th1. 3.- La IL-12 y la IL-18 son inductores del patrón Th1 en el síndrome de Sjögren. 4.- La expresión del RNAm de citoquinas no varía en relación al grado de afectación histológica ni en relación con el nombre de formación de focos. 5.- Los pacientes con el síndrome de Sjögren primario con más tiempo de evolución clínica presentaron un incremento significativo en la expresión del patrón Th1. / Objectives of this study were to examine the cytokine mRNA expression in minor salivary glands from patients with primary Sjögren's syndrome (pSS), searching for possible correlation with clinical parameters and to identify the dominant cytokine pattern in the different groups. Oral mucosa biopsy samples from 42 pSS patients were studied. Total RNA was analysed by normalized RT-PCR using oligo-dT as the RT primer and IL-2, IFN-gamma, IL-12, IL-18, IL-4, IL-10, TGF-beta and TNF-alpha-specific primers for amplification. Results were analysed taking into account: (1) biopsy grade I to IV (Chisholm's classification); (2) diagnosis of either definite pSS (n=30) or probable pSS (n=12), following the European classification criteria (ECC), and (3) length of disease evolution from the beginning of symptoms to the time of biopsy, using an arbitrary cut-off point of 12 months. This studied showed that Th1-related cytokines (IL-2, IFN-gamma, IL-12, IL-18, TNF-alpha) were present in most samples. IL-4 (Th2) was totally absent. Other regulatory cytokines (IL-10, TGF-beta) were detected in the majority of samples. No significant differences were found between definite and probable pSS nor between grades II, III, IV and fibrous tissue biopsies. A statistically significant increase of IL-2 (P=0.012) and IFN-gamma (P=0.019) was observed in samples from patients with longer disease evolution, whereas the two Th1-inducer cytokines IL-12 and IL-18 were equally and highly expressed in all samples. In conclusion, a predominant Th1 pattern of cytokines was observed in all pSS samples, irrespective of biopsy classification. In addition, a significant increase of Th1 cytokine expression frequency was associated with longer disease evolution.

Les metal·loproteïnases de matriu (MMPs) són uns enzims de gran rellevància biològica en totes les accions relacionades amb la reorganització de la matriu extracel·lular i també en la regulació de molts processos cel·lulars. Els limfòcits produeixen petites quantitats de gelatinases (MMP2 i MMP9) que són essencials en la migració a través dels teixits, tant en situacions fisiològiques com en els fenòmens patològics d'inflamació i disseminació tumoral. Prèviament vam demostrar que la interacció amb proteïnes de la matriu extracel·lular a través de receptors integrina era un dels mecanismes més efectius no només en la producció sinó també en l'activació de gelatinases en cèl·lules limfoïdes T. No obstant, els mecanismes que modulen la producció de MMPs a través d'integrines en els limfòcits no estaven identificats. En el conjunt d'aquests treballs hem volgut aprofundir en diferents aspectes de la producció de gelatinases pels limfòcits derivada del contacte cel·lular. Primerament hem estudiat les vies de transducció de senyals involucrades en aquest procés i després hem analitzat les seves implicacions en dos processos fisiopatològics que tenen un vincle important amb el microentorn matricial: una malaltia inflamatòria invasiva (arteritis de cèl·lules gegants) i una patologia neoplàsica (síndromes limfoproliferatives).Els resultats obtinguts en aquests treballs ens han permès arribar a les següents conclusions:1. La senyalització a través d'integrines en resposta a estímuls del microentorn (proteïnes de la matriu extracel·lular, concretament fibronectina) és un mecanisme molt eficient per a la producció i activació de gelatinases (MMP2 i MMP9) i MMP14 pels limfòcits T i B.2. La unió a fibronectina provoca un alliberament post-transcripcional ràpid de gelatinases en aquestes cèl·lules. La secreció d'aquests enzims és necessària per al procés d'invasió. 3. Els mecanismes de senyalització integrina estan modulats per FAK i la seva interacció amb Src. FAK, a través de l'acoblament de senyals duals, coordina l'alliberament de gelatinases i els processos d'adhesió cíclica necessaris per a la migració, suggerint que FAK adaptaria la secreció pulsàtil de gelatinases als canvis del citoesquelet en el procés invasiu limfocitari.4. La inflamació de les artèries de pacients d'arteritis de cèl·lules gegants s'acompanya d'un increment en l'expressió i activació de gelatinases i es troba en relació topogràfica amb l'expressió d'integrines leucocitàries. Aquest fet suggereix que la progressió de l'infiltrat limfocitari està relacionat amb l'expressió i l'activació de les gelatinases, les quals a més contribuirien a la destrucció de l'estructura arterial. El tractament amb corticoids s'acompanya d'una disminució en l'expressió de MMPs. 5. La talidomida redueix la producció de gelatinases induïda per fibronectina en cèl·lules limfoïdes B interferint amb diferents vies de senyalització mitjançada per integrines. Aquest podria ser un dels mecanismes d'acció d'aquest fàrmac que explicaria la seva eficàcia en el tractament del mieloma múltiple en el microentorn medul·lar. Com a conclusió general, les integrines leucocitàries poden coordinar la producció de gelatinases amb els mecanismes de migració cel·lular, afavorint el procés d'invasió cel·lular. Els processos inflamatoris i tumorals utilitzen aquest mecanisme, i la seva disrupció podria beneficiar l'evolució terapèutica d'aquestes patologies.

La arteritis de células gigantes (ACG) afecta arterias de mediano y gran calibre. La inflamación de la carótida y sus ramas da lugar a los síntomas craneales típicos de la enfermedad. Las lesiones inflamatorias expresan gran cantidad de mediadores que provocan la muerte celular y la destrucción de fibras elásticas. El remodelado de la pared arterial puede dar lugar a alteraciones estructurales vasculares, como la aparición de estenosis arteriales que producen síntomas isquémicos o el desarrollo de aneurismas o disección aórticos. La inflamación vascular se acompaña de una respuesta inflamatoria sistémica (RIS) de intensidad variable entre pacientes. Se liberan a la circulación mediadores inflamatorios que actúan sobre órganos a distancia dando lugar a las manifestaciones sistémicas de la enfermedad y a la síntesis de proteínas de fase aguda. La variabilidad en la intensidad de la RIS permite diferenciar entre subgrupos de pacientes que tienen unas características clínicas y un pronóstico distinto. Así, los pacientes con una RIS más intensa suelen presentar más recidivas y precisan mayores requerimientos terapéuticos.El tratamiento con corticoides mejora los síntomas y disminuye la síntesis de mediadores inflamatorios en pocas horas. Sin embargo, un porcentaje elevado de pacientes presenta recidivas durante el seguimiento. Por otra parte, algunos pacientes que alcanzan la remisión, continúan presentando una moderada elevación de mediadores inflamatorios tiempo después del diagnostico. A pesar del tratamiento, es posible que persista un cierto grado de actividad inflamatoria latente a nivel arterial, lo que podría justificar el desarrollo de complicaciones vasculares tardías. Entre los principales objetivos de esta tesis se encuentra valorar si la persistencia de actividad inflamatoria subclínica puede tener consecuencias para el paciente.Hemos comprobado que los niveles séricos de citocinas proinflamatorias, concretamente IL-6 y TNF&#945;, persisten elevados años después del diagnostico, incluso en pacientes que están en remisión y no precisan tratamiento. Los niveles de ambas citocinas se relacionaron con más recidivas clínicas y mayores necesidades terapéuticas. Sin embargo, no mostraron diferencias entre pacientes que durante el seguimiento desarrollaron o no complicaciones vasculares o efectos adversos derivados del tratamiento corticoideo. Mediante un protocolo de estudio fue posible detectar aneurismas o dilatación aórticos en el 22,2 % de pacientes con una mediana de seguimiento de 5'4 años. Curiosamente, las complicaciones aórticas fueron mas frecuentes en pacientes que presentaban una RIS débil en el momento del diagnostico y en pacientes que no presentaron recidivas durante el seguimiento y pudieron suspender antes el tratamiento.En los últimos anos se ha intentado buscar nuevos fármacos que permitan reducir la exposición del paciente al tratamiento corticoideo. Aunque la expresión de TNF&#945; se correlacionó con una enfermedad más refractaria y mayores necesidades terapéuticas, el tratamiento con Infliximab no mejoró el pronóstico de la enfermedad. Una posible explicación seria la existencia de citocinas redundantes que compensarían la función del TNF&#945; bloqueado. En los últimos años se han identificado diversos sistemas de citocinas que tienen gran similitud estructural con el TNF&#945; y comparten vías de señalización comunes. Entre ellos, el RANKL y sus receptores (OPG y RANK), fundamentales en la regulación del metabolismo óseo. Estudios in vitro sugieren que también podrían intervenir en la regulación de la respuesta inmune y en biología vascular.Hemos visto que el RANKL se expresa de forma intensa en las lesiones inflamatorias vasculares y su expresión es mayor en pacientes con una RIS intensa en el momento del diagnostico. A pesar de ello, la expresión de RANKL no se relacionó ni con el número de rebrotes ni con los requerimientos terapéuticos. Algunos hallazgos sugieren que el sistema RANKL/OPG podría intervenir en el remodelado vascular que tiene lugar tras la agresión inflamatoria. / Giant cell arteritis (GCA) is a granulomatous large- and mediumsized vessel vasculitis. Infiltrating macrophages and structural vascular cells secret inflammatory mediators leading to vascular damage and abnormal vascular remodelling, that may eventually have clinical consequences for patients, such as luminal narrowing with ischemic symptoms or development of aortic aneurysms.GCA-patients experience a rapid relief of symptoms with treatment but 40-60% relapse when glucocorticosteroids are tappered. In addition, vascular complications may appear during follow-up. It is not clear whether these complications arise from subclinical vascular inflammation or result from maladaptive remodelling driven by the initial inflammatory injury. Our study indicates that circulating pro-inflammatory cytokines IL-6 and TNF&#945; remain elevated in a substantial proportion of patients with GCA after long-term follow-up. Although patients with higher cytokine levels experienced a more relapsing disease and required higher doses of glucocorticosteroids, persistent elevation of circulating cytokines was not associated with clinically relevant vascular complications or glucocorticosteroid side effects. Systematic screening revealed aortic aneurysm or dilatation in 22,2% of patients after a median follow-up of 5.4 years. Our data did not support that, aortic aneurysm formation resulted mainly from persistent disease activity and suggested interplay of heterogeneous factors.In spite of TNF&#945; expression in GCA-temporal arteries correlated with a more relapsing disease and higher glucocorticosteroid requirements, treatment with infliximab did not improve disease outcome, suggesting that other mediators might be involved in the regulation of the inflammatory response. RANKL and its receptors (RANK and osteoprotegerin) are members of the TNF&#945; superfamily and share common signalization pathways with TNF&#945;. They play a central role in bone metabolism but studies "in vitro" also suggest regulatory functions over immune and vascular responses. RANKL, RANK and OPG were highly expressed in GCA-inflammatory lesions and correlated with the expression of other inflammatory mediators. Although RANKL expression was higher in patients with an intense systemic inflammatory response at diagnosis, it was not correlated with number of relapses or glucocorticosteroid requirements. Several data suggest a possible role of these cytokines in vascular remodelling after the inflammatory injury.