京都大学 / 新制・課程博士 / 博士(医学) / 甲第23079号 / 医博第4706号 / 新制||医||1049(附属図書館) / 京都大学大学院医学研究科医学専攻 / (主査)教授 松田 道行, 教授 稲垣 暢也, 教授 妹尾 浩 / 学位規則第4条第1項該当 / Doctor of Medical Science / Kyoto University / DFAM

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Glucocorticoids (GC) are common components of many chemotherapeutic regimens for lymphoid malignancies. GC-induced apoptosis involves an intrinsic BCL-2 family-regulated pathway. It has been shown that BIM (BCL-2 interacting mediator of cell death), a BH3-only pro-apoptotic protein, is up-regulated by dexamethasone (Dex) treatment in acute lymphoblastic leukemia (ALL) cells. Furthermore, BIM is inactivated by extracellular signal-regulated kinase (ERK)-mediated phosphorylation. We therefore hypothesized co-treatment with Dex and MEK/ERK inhibitors would promote apoptosis in ALL cells through BIM up-regulation and activation. We show here that a MEK inhibitor, PD184352 synergistically enhances Dex lethality in CCRF-CEM (T-ALL) cells. Co-treatment with Dex and PD184352 results in BIM accumulation. Down-regulation of BIM by short-hairpin RNA in CCRF-CEM cells suppressed apoptosis by Dex/PD184352 co-treatment. In contrast, another BH3-only protein, BAD is dispensable. Thus, BIM is a critical molecule in this regimen, and targeting BIM by drugs combination could be effective on ALL and possibly other malignancies.

京都大学 / 新制・課程博士 / 博士(医学) / 甲第23099号 / 医博第4726号 / 新制||医||1050(附属図書館) / 京都大学大学院医学研究科医学専攻 / (主査)教授 濵﨑 洋子, 教授 浅野 雅秀, 教授 羽賀 博典 / 学位規則第4条第1項該当 / Doctor of Medical Science / Kyoto University / DFAM

Charles University Faculty of Pharmacy in Hradec Králové Department of Pharmacology & Toxicology Student: Lukáš Slatinský Supervisor: Assoc. prof. PharmDr. Martina Čečková, Ph.D. Title of diploma thesis: Interactions of selected anticancer drugs of the MAPK/ERK signaling pathway inhibitors group with the ABC drug transporters ABCB1 (Pgp, P-glycoprotein) and ABCG2 (BCRP, breast cancer resistance protein) are members of a transmembrane efflux ATP dependent transporter family, so called ATP-binding cassettes (ABC). Physiologicaly they are expressed in the cellular membrane and protect body tissues against potentially toxic xenobiotics including drugs. They represent also one of the tumor defense mechanisms when being able to efflux a wide variety of cytotoxic drugs out of the cancer cells leading to treatment failure. BRAF protein plays an important regulatory and signal role in MAPK/ERK pathway affecting cell division, differentiation and secretion. Mutations of BRAF lead to overactivity in MAPK/ERK pathway in many cancer cells and can be therefore targeted by anticancer therapy. Cobimetinib and dabrafenib are relatively new anticancer therapeutics inhibiting the signal pathway mentioned above and they are used in treatment of melanoma carrying the BRAF mutation. The aims of this project were to...

NF1 ist eine autosomal dominante Erbkrankheit, die durch inaktivierende Mutationen im Neurofibromin-Gen verursacht wird. NF1 manifestiert sich durch eine erhöhte Tumor-Inzidenz des neuralen Gewebes in der Haut (Neurofibroma). Neben diesen häufigeren klinischen Manifestationen haben rund 50% der NF1-Patienten Skelett-Anomalien. Häufiger sind Röhrenknochen betroffen, die klinischen Symptome reichen von Tibia-Krümmung über Spontanfrakturen bis hin zu Nonunions. Diese Studie analysiert den Heilungsverlauf von Femurfrakturen in Nf1Prx1- Mäusen. Der Frakturkallus von Mäusen wurde an den Tagen 7, 10, 14 und 21 durch µCT, Histologie und molekulare Analysen evaluiert. µCT und histologische Analysen haben eine beeinträchtigte Knochenheilung in Nf1Prx1-Mäusen gezeigt. Eine erhöhte periostale Knochenbildung in den frühen Stadien der Heilung war zu beobachten, sowie eine reduzierte, aber anhaltende Knorpelbildung und Bindegewebs-Akkumulation innerhalb der Fraktur. Wir konnten zeigen, dass der normalen Heilungsprozess durch dieses Bindegewebe behindert wird, welches durch alpha smooth muscle actin-positive Myofibroblasten gebildet wird, die ihrerseits aus einer bisher noch nicht identifizierten Muskelfaszie abgeleitet sind. Dieser Zusammenhang wird durch eine Microarray-Analyse der Kallus-Gewebe bestätigt, die ergab, dass durch den Knock-Out Gene reguliert wurden, die in Physiologie, Proliferation und Differenzierung von Muskelzellen involviert sind. Darüber hinaus waren extrazelluläre-Matrix-Gene in den Mutanten hoch regeuliert. Zusammenfassend konnten wir zeigen, dass eine Ähnlichkeit des Heilungsverlauf zwischen dem Nf1Prx1-Mausmodell und NF1-Patienten besteht. Folglich kann an diesem Mausmodell untersucht werden, durch welche Mechanismen die Mutationen im NF1 zu Knochenheilungsstörungen führen. Außerdem konnte in einer Pilotstudie der Effekt des Neurofibromin-Mangels auf die Knochenheilung durch Behandlung mit MEK-Inhibitoren in vitro und in vivo weitestgehend behoben werden / Neurofibromatosis type 1 (NF1) is an autosomal dominant genetic disease resulting from inactivating mutations in the gene encoding the protein neurofibromin. NF1 patients – around 50% – have abnormalities of the skeleton. Long bones are often affected, and the clinical signs range from tibial bowing to spontaneous fractures and even non-unions. Moreover, NF1 mice models could provide the understanding of the cell types involved in the resulting non-union and their behavior. This study analyzed the healing progress of femur fractures in a model of NF1 long bone dysplasia. Fracture callus was assessed at days 7, 10, 14, and 21 by µCT, histology, biomechanics, and molecular analyses. Bone healing was impaired in Nf1Prx1 mice femoral fracture. Results revealed increased periosteal bone deposition at the early stages of healing, decreased but persistent cartilage formation concomitant with fibrous tissue accumulation within the fracture site, decreased torsional stiffness, decreased bone mineral density, and increased fibrous tissue infiltration in the callus of mutant mice. This fibrous tissue accumulation hindered bone fracture healing, and was deposited by alpha smooth muscle actin-positive myofibroblasts, which were derived from a yet unidentified muscle fascia. This is further supported by the microarray analysis of callus tissues showing that genes crucial to muscle cells physiology, proliferation and differentiation were affected. In addition, extracellular matrix related genes were up-regulated in the mutants. In summary, this study shows a resemblance in the healing progression to the Nf1Prx1 mice model and NF1 patients, thereby, confirming the suitability of this mice model to explore the mechanism by which mutations in NF1 lead to non-unions. Moreover, in vitro and in vivo pilot assessments of MEK inhibitor treatment demonstrated a potential remedy for the lack of neurofibromin in bone healing.

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Les immunothérapies de type immune checkpoint blockade (ICB) ont révolutionné les approches thérapeutiques en oncologie médicale et ont largement contribué au fait que l’immunothérapie est maintenant considérée comme le quatrième pilier des traitements anticancer, aux côtés d’approches traditionnelles telles que la chirurgie, la radiothérapie et la chimiothérapie. Malgré les résultats encourageants des études cliniques évaluant ce type d’immunothérapie, la majorité des patients décèderont des suites de leur maladie. Conséquemment, le domaine de recherche visant à comprendre les mécanismes de résistance aux immunothérapies est en expansion constante. Plusieurs stratégies visant à améliorer les issues cliniques ont été proposées, parmi lesquelles figurent: 1) la recherche de nouvelles cibles thérapeutiques dans le microenvironnement immun tumoral et; 2) les études de combinaisons thérapeutiques où une immunothérapie est jumelée à d’autres types de modalités thérapeutiques potentiellement synergiques. Chacune des études présentées dans cette thèse de recherche s’apparente à l’une ou l’autre de ces stratégies. Dans le cadre de notre première étude, nous démontrons que la protéine WISP1 représente une cible prometteuse à l’intérieur du microenvironnement de plusieurs types de tumeurs solides étant donné son association avec différentes variables pronostiques et proinflammatoires, ainsi qu’avec un programme épigénétique complexe, la transition épithélialemésenchymateuse (Epithelial-Mesenchymal Transition; EMT). De plus, nous démontrons que les niveaux d’expression de WISP1 sont significativement plus élevés au sein des tumeurs démontrant une résistance primaire aux immunothérapies de type ICB, particulièrement lorsque qu’une signature reliée à l’EMT peut être retrouvée de façon concomitante. Pour notre deuxième étude, nous avons utilisé des modèles murins in vivo de cancer pulmonaire non à petites cellules KRAS-mutés afin de tester différentes combinaisons thérapeutiques jumelant une thérapie dite ciblée (i.e., un inhibiteur de MEK) a différentes immunothérapies de type ICB. Nos résultats démontrent que l’ajout d’une immunothérapie anti-CTLA-4 à l’inhibiteur de MEK AZD6244 (selumetinib) et une immunothérapie anti-PD-L1 augmente significativement la survie, et que ces bénéfices sont associés à une diminution de marqueurs reliés à l’EMT. Il existe donc un lien commun entre ces deux études qui repose sur l’importance de l’EMT comme facteur favorisant la résistance thérapeutique aux immunothérapies. De plus, nous démontrons pour la première fois que les bénéfices associés à la triple combinaison thérapeutique susmentionnée peuvent être corrélés à une diminution d’expression de marqueurs liés à l’EMT. Par conséquent, nos résultats sont discutés en tant que base potentielle pour de futures études visant à réduire la résistance thérapeutique reliée à l’EMT. Nous discutons également de la valeur translationnelle de nos résultats à travers le développement d’une étude clinique. / Immune checkpoint blockade (ICB) has revolutionized therapeutic approaches in the field of medical oncology and has largely contributed to the fact that immunotherapy is now being regarded as the fourth pillar of cancer treatment alongside surgery, radiotherapy and chemotherapy. Despite encouraging results from clinical trials using ICB, most patients ultimately relapse or succumb to their disease. Therefore, the field of immunotherapeutic resistance research is rapidly expanding. Many strategies to improve ICB responses have been undertaken, including: 1) the search for novel, actionable targets in the immune tumor microenvironment (TME) and; 2) therapeutic combination studies where an ICB backbone is combined with different, synergistic treatment modalities. Each of the studies presented in this research thesis embraces one of these strategies. In our first study, we show that WISP1 represents a promising TME target in multiple solid tumor types by demonstrating its association with prognostic and pro-inflammatory variables, as well as to a complex epigenetic program termed Epithelial-Mesenchymal Transition (EMT). Furthermore, we show that increased WISP1 expression is associated to primary resistance to ICB, particularly when EMT-related signatures are found concomitantly. In our second study, we used in vivo mouse models of KRAS-mutant Non-Small Cell Lung Cancer (NSCLC) to test different therapeutic combinations of targeted therapies (i.e., MEK inhibitor) and ICB. We found that the addition of anti-CTLA-4 ICB to MEK inhibitor AZD6244 (selumetinib) and anti-PD-L1 ICB increases survival, and that these benefits are associated with the downregulation of EMT-related markers. Therefore, there exists a common link between these studies, which relies on the significance of EMT as a detrimental factor within the TME and its association with ICB resistance. Moreover, we show for the first time that the benefits of ICB combination therapy can be associated to the downregulation of EMT markers in vivo. Consequently, we discuss how our results may constitute the basis for future work aiming at reducing EMT-mediated therapeutic resistance, as well as the translational relevance of our pre-clinical results through the development of a clinical trial.