Made available in DSpace on 2013-08-07T18:41:55Z (GMT). No. of bitstreams: 1 000383266-Texto+Completo-0.pdf: 823319 bytes, checksum: 310fb137797fb2ab616c91d119b2c6fa (MD5) Previous issue date: 2006 / A espectroscopia de infravermelho (IV) permite caracterizar molecularmente tecidos e fluídos, uma vez que seus espectros são característicos e atuam como uma impressão digital. O rápido desenvolvimento da técnica de infravermelho na última década tem aberto novas portas para o prognóstico e diagnóstico de patologias facilitando a procura de melhores tratamentos. Atualmente, o infravermelho (IV) vem sendo utilizado nos mais diversos modelos experimentais de sistemas biológicos. A sepse provoca mudanças no ambiente celular e em suas trocas iônicas, afetando o funcionamento da mitocôndria e aumentando a formação de espécies reativas de oxigênio (EROs). O óxido nítrico (NO) é considerado um marcador da formação de radicais livres produzidos, enzimaticamente ou não, nos tecidos. O aumento dos radicais livres promove a oxidação de resíduos de aminoácidos, aumentando a formação de grupos carbonílicos (CO) protéicos que atuam como biomarcadores do estresse oxidativo. Devido a esses fatores, entre outros, as mitocôndrias e seus complexos vêm sendo avaliados pela espectroscopia de infravermelho nas regiões das bandas de amidas I (espectro entre 1615 cm -¹ e 1700cm -¹, referente a ligações C=O) e II (espectro entre 1500 cm -¹ e 1600 cm -¹, referente a ligações C-H), característico de proteínas, com o objetivo de observar alterações que possam ocorrer nestas organelas. No presente trabalho de mestrado, nosso objetivo principal foi analisar as alterações em mitocôndrias hepáticas causadas pela sepse induzida por CLP em ratos (Rattus novergicus – var. Wistar) através do FTIR-ATR. O experimento foi contemplado pela extração das mitocôndrias hepáticas através de diferentes gradientes de centrifugação em meios contendo sacarose, heppes e EGTA. A dosagem de NO sérico foi feita através da metodologia de Griess. Nossos resultados apresentaram diferenças significativas nas bandas de amida I do espectro de infravermelho do grupo séptico em relação ao controle, controle anestesia e sham. As mesmas diferenças foram percebidas para a dosagem de NO sérico.

Made available in DSpace on 2013-08-07T18:42:02Z (GMT). No. of bitstreams: 1 000431141-Texto+Completo-0.pdf: 13187681 bytes, checksum: 1ec3202d47e45648161456f90fa14a9e (MD5) Previous issue date: 2011 / Resveratrol is a naturally occurrence polyphenol, widely studied in prevention and age related diseases. It was shown by increased lifespan of lower organisms and obese rodents, that its mechanism could be sirtuin 1 dependent. Thus, the compound was considered as an important mimicking calorie restriction agent, the only non-genetic intervention known to increase the lifespan. Sirtuins belong to a family of enzymes NAD+-dependent targeting histones and non-histones proteins, therefore regulating several cellular events related to metabolism. Despite the mechanism of resveratrol showed to be SIRT1-dependent, it is more complex than firstly reported and it is not yet clear. In this study, we investigated the gene expression of three sirtuins members and targets of these enzymes family, modulated by resveratrol in three different conditions: without stress or injury, with ethanol, - as a stressor compound and after caloric restriction, using adult zebrafish as a model organism. Although wild-type zebrafish is considered a consolidated experimental model, little have been explored conserning sirtuins mechanism, resveratrol modulation and caloric restriction. The mRNA expression was detected by semiquantitative RT-PCR in zebrafish liver after different time of exposure and concentrations of resveratrol, ethanol and, also in the muscle after caloric restriction. In our experimental model neither resveratrol nor caloric restriction modulated the SIRT1 gene expression. However we saw a similar profile between SIRT3 and SIRT4 transcription, a decrease in liver mRNA levels. Under this scenario we suggested that the resveratrol can exert health benefits similar to that presented by caloric restriction, modulating other sirtuins, rather than SIRT1, opening another perspective that must be exploited, since, in zebrafish, resveratrol altered the sirtuins and other genes (such as NAMPT) expression. This modulation should be better understood at physiological levels once resveratrol have been used by health subjects as a nutraceutical compound. Even though, here ethanol was used as stressor compound, we did not observed hepatic injury, especially in the animals subjected to chronic exposition. Nevertheless, was possible detected that resveratrol and ethanol showed different profiles of gene expression and protein acetylation but, when the compounds were administered together levels were reverted close to the control group. The results here described helps to consolidate the zebrafish as an experimental model for understanding the sirtuin modulation by resveratrol and caloric restriction. / Resveratrol é um polifenol de ocorrência natural amplamente estudado na prevenção de doenças associadas ao envelhecimento. Foi caracterizado por aumentar a longevidade em organismos menores e em roedores obesos, mecanismos relacionados a modulação de sirtuína 1. Desta forma, foi comparado e apresentado como um importante composto mimetizador de restrição calórica, única intervenção não genética conhecida por aumentar a longevidade. Sirtuínas compreendem uma família de enzimas NAD+ dependentes que têm como alvo proteínas histonas e não histonas, regulando uma série de eventos celulares relacionados ao metabolismo. Apesar do resveratrol ter sido apresentado por modular SIRT1, este mecanismo parece ser muito mais complexo e não está completamente elucidado. Neste estudo, nós investigamos o perfil de transcrição de SIRT1, SIRT3 e SIRT4 e genes alvos relacionados a estas enzimas, PGC1α, PPARγ e NAMPT, modulados por resveratrol, em um modelo sem injúria e estress; e na presença de um agente estressor, neste caso o etanol e; após restrição calórica. Para o estudo, foi utilizado zebrafish adulto tipo selvagem, por ser um modelo experimental consolidado, porém pouco explorado quanto ao mecanismo de sirtuinas, do composto resveratrol e restrição calórica. Para análise transcricional foi utilizado a técnica de RT-PCR semiquantitativo. Para determinação do estado de acetilação H3 lys9 foi utilizado a técnica de Western Blotting. As expressões de mRNA foram analisadas em fígado de zebrafish após exposição a diferentes tempos e concentrações de resveratrol, etanol e, também no músculo, após restrição calórica. Em nosso modelo experimental nem o resveratrol, nem a restrição calórica modularam a expressão de SIRT; porém, nós observamos que ambas intervenções apresentaram perfil similar na transcrição de SIRT3 e SIRT4, diminuindo os níveis de mRNA no fígado. Nós sugerimos que o composto pode exercer efeitos benéficos similar a RC por modulação de outras sirtuínas que não SIRT1 e, estas devem ser melhor exploradas. Ainda, nós demonstramos que resveratrol modula a expressão de sirtuínas e outros genes analisados como NAMPT, em um modelo sem injúria, e esta modulação deve ser compreendida a níveis fisiológicos uma vez que o composto vem sendo utilizado como composto nutracêutico por indivíduos saudáveis. Etanol, aqui utilizado como um agente estressor, não causou dano hepático, principalmente nos animais que receberam tratamento crônico. Porém, foi possível observar que resveratrol e etanol apresentaram padrão diferente no perfil de expressão gênica e acetilação de proteína e, que a associação dos dois compostos reverteu aos níveis próximos do controle estas alterações. Estes resultados consolidam o zebrafish como modelo experimental a ser utilizado na compreensão da modulação de sirtuínas modulado por resveratrol e restrição calórica.

Made available in DSpace on 2013-08-07T18:41:51Z (GMT). No. of bitstreams: 1 000388692-Texto+Completo-0.pdf: 318684 bytes, checksum: 4515465ae3fb1256c9107ff7a04e8a0b (MD5) Previous issue date: 2007 / A esquizofrenia é uma doença neuropsiquiátrica que afeta cerca de 1% da população mundial e que, devido aos seus diversos sintomas, acarreta um enorme custo social direto (hospitalizações, atendimentos, medicações) e indireto (improdutividade, repercussões familiares). Os estudos de genética populacional indicam que a esquizofrenia tenha um componente genético relevante além da influência do ambiente. Neste sentido, além de estudos no DNA nuclear, têm sido investigadas as alterações no DNA Mitocondrial (mtDNA). O mtDNA apresenta herança materna, e por isso é muito útil em estudos populacionais. Estudos com doenças neurodegenerativas como a doença de Parkinson e a doença de Alzheimer sugerem que, ao menos em parte, o mtDNA contribua para suas etiologias. Manifestações neuropsiquiátricas características de encefalopatias mitocondriais causadas por mutações do mtDNA são convulsões, demência e dor de cabeça. Além disso, um estado confusional agudo, com alguns sintomas semelhantes aos que ocorrem na esquizofrenia (desorganização mental e alucinações), às vezes é observado em MELAS (mitochondrial encephalomyopathy, lactic acidosis, stroke-like episodes), uma encefalopatia mitocondrial típica. Dessa forma, o objetivo dessa pesquisa foi averiguar uma possível associação entre polimorfismos A4769G e A10398G de mtDNA, que já foram descritos como predisponentes a outras doenças neuropsiquiátricas, com o desenvolvimento da esquizofrenia. Os polimorfismos A4769G e A10398G estão respectivamente localizados nos genes ND2 e ND3, que codificam para subunidades 2 e 3 da NADH Desidrogenase. Para relacionar esses polimorfismos com a esquizofrenia, testamos 76 pacientes esquizofrênicos quanto à ocorrência ou não destas variantes polimórficas no mtDNA e comparamos com as amostras de 88 controles sadios. Esses polimorfismos foram analisados utilizado-se o seqüenciador automático de DNA “MegaBACE” 1000 (GE Healthcare™) do Centro de Biologia Genômica e Molecular da PUCRS. Os cromatogramas gerados pela corrida eletroforética das reações de seqüenciamento foram analisadas no programa Chromas para determinar a ocorrência ou não da variação polimórfica. Quanto à análise estatística, foi realizado teste do qui-quadrado para variáveis categóricas. O nível de significância estatística foi p ≤ 0,05.Em relação ao polimorfismo A4769G, foram analisadas amostras de 76 pacientes dos quais 61 (80,3%) apresentaram o alelo G e 15 (19,7%) apresentaram o alelo A nesta posição. Das 88 amostras de controles analisadas, obtivemos 82 (93,2%) com o alelo G e 6 (6,8%) com o alelo A (Qui-quadrado p=0,014, Odds ratio=2. 895). Em relação ao polimorfismo A10398G, dos 62 pacientes analisados, 17 (27,4%) apresentaram o alelo G e 45 (72,6%) o alelo A. Dos 76 controles, 34 (44,7%) apresentaram a presença do alelo mutante G e 42 (55,3%) apresentaram o alelo A para esta posição (Qui-quadrado p=0,036, Odds ratio=1. 313). O estudo mostra diferenças estatisticamente significativas na freqüência dos sistemas polimórficos estudados entre pacientes esquizofrênicos e controles. Estudos adicionais são necessários para avaliar sua relevância do ponto de vista funcional.

Made available in DSpace on 2013-08-07T18:41:55Z (GMT). No. of bitstreams: 1 000448467-Texto+Completo-0.pdf: 1354318 bytes, checksum: e98c36f8757b493a6c1604f1618bfb2d (MD5) Previous issue date: 2013 / Iron accumulation in the brain has been observed in both normal aging and in several neurodegenerative diseases. We have previously shown that brain iron loading results in persistent memory deficits, which are accompanied by oxidative stress. Due to the high metabolic rate of the nervous system, mitochondria are present in large numbers in nerve cells. It has been demonstrated that through fission and fusion of mitochondria, these organelles promote changes in their structure and this dynamic can affect mitochondrial function and vice-versa. Deficits in supplying energy to the synapses have been linked to neurodegenerative diseases and once the functionality of neural circuits is reduced, these cells may activate neuronal death cascades. Here, we analyzed the effects of neonatally iron treatment on the following targets: Dynamin-1-like protein (DNM1L) and Optic atrophy 1 (OPA1), proteins involved in regulating mitochondrial fission and fusion, respectively; Caspase 3, a key protease of the effector phase of apoptosis; and Synaptophysin, as a synaptic marker. Additionally, we investigated the effects of Cannabidiol (CBD), the main non-psychotropic component of Cannabis sativa, previously shown to improve memory in iron-treated rats, in reversing iron-induced effects on DNM1L, OPA1, caspase 3, and synaptophysin. Male rats received vehicle or iron carbonyl (30mg/kg) at postnatal days 12-14. At adulthood, they were treated with vehicle or CBD (10 mg/kg) for 14 days. Hippocampal and cortical protein levels and gene expression were quantified using western blotting analysis and RT-qPCR, respectively. Quantitative measurements of proteins were made using densities of individual proteins, normalized to the density of β-actin. On RT-qPCR, samples were normalized to three reference genes (GAPDH, HPRT1 and RPL13A). Western blotting results indicated that neonatal iron treatment induced a significant reduction of DNM1L in the hippocampus and OPA1 in the cortex. Iron was also shown to increase caspase 3 both in the hippocampus and cortex, which was accompanied by a significant reduction of synaptophysin levels in the hippocampus. CBD reversed iron-induced effects, bringing hippocampal DNM1L, caspase 3 and synaptophysin levels back to values comparable to the control group. The present results suggest that iron may affect mitochondrial dynamics, possibly trigging synaptic loss and apoptotic cell death. The reversion of these effects by CBD, indicates its potential neuroprotective effect. / O acúmulo de ferro no cérebro tem sido observado tanto no envelhecimento normal quanto em muitas doenças neurodegenerativas. Previamente, mostramos que a sobrecarga de ferro no cérebro resulta em déficits de memória persistentes, acompanhados por estresse oxidativo. Devido à elevada taxa metabólica do sistema nervoso, as mitocôndrias estão presentes em grande número em células nervosas. Tem sido demonstrado que, por meio da fissão e fusão, essas organelas promovem alterações na sua estrutura e essa dinâmica pode afetar a função mitocondrial e vice-versa. Déficits no fornecimento de energia para as sinapses têm sido associados a doenças neurodegenerativas e com a redução da funcionalidade de circuitos neurais essas células podem ativar cascatas de morte neuronal. No presente trabalho, foram analisados os efeitos do tratamento do ferro neonatal sobre os seguintes alvos: proteína 1 semelhante à dinamina (DNM1L) e proteína atrófica óptica 1 (OPA1), envolvidas na regulação de fissão e de fusão mitocondrial, respectivamente; caspase 3, uma protease essencial da fase efetora da apoptose; e sinaptofisina, um marcador sináptico. Além disso, nós investigamos os efeitos do canabidiol (CBD), principal componente não psicotrópico da Cannabis sativa, já mostrado capaz de melhorar a memória de ratos tratados com ferro, na reversão dos efeitos induzidos pelo ferro sobre as proteínas DNM1L, OPA1, caspase 3 e sinaptofisina. Ratos machos receberam veículo ou ferro carbonila (30mg/kg) do 12º ao 14º dia pós-natal. Na idade adulta, foram tratados com veículo ou CBD (10mg/kg) durante 14 dias. Os níveis proteicos e a expressão gênica no hipocampo e córtex foram quantificados através de Western blotting e RT-qPCR, respectivamente. A quantificação das proteínas foi realizada através da medida das densidades das bandas individuais, normalizadas pela densidade de β-actina. Para o RT-qPCR, as amostras foram normalizadas para 3 genes de referência (GAPDH, HPRT1 e RPL13A). Os resultados da análise protéica indicaram que o tratamento com ferro no período neonatal induziu redução de DNM1L no hipocampo e OPA1 no córtex. O ferro também aumentou os níveis de caspase 3 tanto no hipocampo quanto no córtex, acompanhado por redução dos níveis de sinaptofisina no hipocampo. O CBD reverteu os efeitos induzidos pelo ferro, trazendo os níveis hipocampais de DNM1L, caspase 3 e sinaptofisina de volta aos valores comparáveis ao grupo controle. Os resultados sugerem que o ferro pode afetar a dinâmica mitocondrial, possivelmente desencadeando perda sináptica e morte celular por apoptose. A reversão desses efeitos pelo CBD indica o seu potencial efeito neuroprotetor.

Made available in DSpace on 2013-08-07T18:41:38Z (GMT). No. of bitstreams: 1 000389154-Texto+Completo-0.pdf: 376076 bytes, checksum: 42625af3d28cd5491852ff5969f589f9 (MD5) Previous issue date: 2007 / Schizophrenia is a serious neuropsychiat ric disease that affects nearly 1% of the world population. It generates enormous direct (hospi talizations, medical care, medications) and indi rect (lack of productivity, familiar repercussions) social cost Schizophrenia is a complex and mul tifactor illness, with high heritabil ity (around 80%). In the past decades, some research done with the families had demonst rated a linear and di rect correlat ion between the degree of kinship and the possibility for schizophrenia. The mitochondria are the largest site of energy production in the cell and for this reason mutations in DNAmt (deletion and/or polymorphisms) can cause alterations in mitochondrial metabolism, causing tissue damage. Alterations in energy production can cause many neurodegenerative disorders as, for example, Parkinson, Alzheimer and Amyotrophic Lateral Sclerosis. Some DNAmt mutat ions diminish the citochrome c oxidase activity and can be related to increased risk of schizophrenia in the population. In the present work, we investigated allele prevalence in two polymorphisms in the DNAmt of schizophrenic and control patients. We analyzed the C6489A and C7028T polymorphisms in the CO1 gene that codifies the cytochrome c oxidase. Specific oligonucleotides were used with the objective of ampli fying the polymorphic regions. The PCR products were purified and sequenced (MegaBACE 1000/GE Helthcare TM) and the generated sequences analyzed using the Chromas v2. 31 program. Eighty (80) schizophrenic patients and 80 controls were analyzed. In the statistic analysis, the Q square test and Student T Test were used. The results with p<0. 05 had been considered signi ficant. The mutant A allele in the polymorphic region C6489A was not found. In relation to the C7028T polymorphism, 80 schizophrenic patients and 80 controls were analyzed. In the 80 patients, 64 present the mutant T allele, and 55 in the cont rol samples. Significant association was found between the T allele and the risk to develop schizophrenia. We veri fied that the T allele can be considered a risk factor for schizophrenia, since that, in comparison with the C al lele, it is three times more incident in the schizophrenic patients group. In this way, we demonst rated a st rong correlation between schizophrenia and the mutant T allele. / A esquizofrenia é uma doença neuropsiquiátrica grave que atinge aproximadamente 1% da população mundial. Gera um enorme custo social direto (hospitalizações, atendimentos, medicações) e indireto (improdutividade, repercussões familiares). A esquizofrenia é uma doença complexa e multifatorial, com alta herdabilidade (cerca de 80%). Nas décadas passadas, várias pesquisas realizadas com familiares demonstraram uma correlação linear e direta entre o grau de parentesco e os riscos de surgimento da esquizofrenia. A mitocôndria é o maior sítio de produção de energia na célula e, por esta razão, mutações no DNAmt (deleções e/ou polimorfismos) podem causar alterações no metabolismo mitocondrial, ocasionando danos aos tecidos. Alterações na produção de energia podem implicar em muitas doenças neurodegenerativas, como, por exemplo, o Mal de Parkinson, Alzheimer e a Esclerose Amiotrófica Lateral. Algumas mutações no DNAmt diminuem a atividade da citocromo c oxidase e podem estar relacionadas com o aumento do risco para esquizofrenia na população. No presente trabalho, foi investigada a prevalência de alelos em dois polimorfismos no DNAmt de pacientes esquizofrênicos e de controles. Foram analisados os polimorfismos C6489A e C7028T presentes no gene CO1 que codifica para a citocromo c oxidase. Foram utilizados oligonucleotídeos específicos com o objetivo de amplificar as regiões polimórficas. Os produtos de PCR foram purificados e seqüenciados (MegaBACE 1000 / GE Helthcare TM), e as seqüências geradas analisadas, utilizando o programa Chromas versão 2. 31. Foram analisados 80 pacientes esquizofrênicos e 80 controles. Na análise estatística, foramutilizados o teste Q quadrado e Teste T de Student de uma via. Foram considerados significantes somente os resultados com p<0,05. Não foi encontrado o alelo mutante A, na região mutada C6489A. Em relação ao polimorfismo C7028T, dos 80 pacientes, 64% apresentam o alelo mutante T e, entre os controles, este alelo está presente em 55% indivíduos. Foi encontrada significativa associação entre o alelo T e o risco para desenvolver esquizofrenia. Veri ficou-se que o alelo T pode ser considerado um fator de risco para esquizofrenia, já que, na comparação com o alelo C, ele é mais de três vezes prevalente no grupo de pacientes esquizofrênicos. Dessa forma, demonstrou-se uma forte associação entre a esquizofrenia e o alelo mutante T.