Introdução: A Holoprosencefalia (HPE) é uma malformação craniofacial decorrente de falhas no processo de formação do sistema nervoso durante o desenvolvimento embrionário. Sua etiologia é heterogênea e complexa, envolvendo fatores ambientais e genéticos. Estudos recentes sugerem que alterações subteloméricas possam ser um dos fatores etiológicos para o aparecimento da HPE. Objetivos: Investigar possíveis alterações (microdeleções/duplicações) nas regiões subteloméricas em indivíduos com diagnóstico de HPE. Metodologia: Avaliação genética de 25 amostras de DNA de indivíduos matriculados no HRAC-USP, com diagnóstico de HPE através da técnica de MLPA (Multiplex ligation-dependent probe amplification), segundo protocolo proposto por Schouten et al. (2002). Estes indivíduos já foram previamente triados para mutações/deleções nos genes candidatos à HPE (SHH, ZIC2, TGIF, GLI2 e PTCH1) através do sequenciamento direto de Sanger e da técnica de MLPA, sem resultado positivo para qualquer alteração. Resultados: Dentre os 25 indivíduos analisados, o fenótipo predominante foi a microforma da doença. Os principais achados clínicos da amostra estudada foram: hipotelorismo, microcefalia e fissura de lábio e palato (100%), nariz achatado (84%), presença de um incisivo central único (24%) e ponte nasal baixa (64%). Quatro pacientes apresentaram comprometimento no SNC (16%). Nenhum indivíduo apresentou quaisquer alterações, como microdeleções e/ou duplicações nos genes contidos nas regiões subteloméricas, através da análise pela técnica de MLPA. Dessa forma, estes permanecem sem diagnóstico genético definido. Discussão: A não detecção de alterações subteloméricas sugere que o fenótipo predominante na amostra, microforma, possa não apresentar alterações subteloméricas relacionadas ao aparecimento da doença. Entretanto, deve-se salientar que o universo amostral é relativamente pequeno, de forma que este possa não ser um exemplo fiel dos casos de microforma da HPE. Reforça-se, ainda, a grande variedade de fatores envolvidos no surgimento desta patologia, bem como o envolvimento de outros genes ainda não estabelecidos, além das causas ambientais, ainda não completamente elucidadas. Conclusões: Não foram encontradas alterações subteloméricas nos pacientes com diagnóstico de HPE estudados. A técnica de MLPA consiste em uma metodologia rápida, sensível, eficaz e de baixo custo, quando comparada a outras técnicas, sendo indicada para o uso em laboratórios de diagnóstico genético, uma vez que diversos estudos já mostraram que consiste em um método confiável de diagnóstico. Devido ao tamanho relativamente pequeno da amostra utilizada neste estudo, e os dados ainda inconsistentes da literatura atual, estudos adicionais são necessários para que seja possível a realização de um diagnóstico diferencial, explicando o amplo espectro fenotípico observado nesta doença, conforme sugerido pela hipótese dos múltiplos fatores. / Introduction: Holoprosencephaly (HPE), a craniofacial malformation, results from flaws in formation process of the nervous system during embryonic development. The etiology is heterogeneous and complex, involving environmental and genetic factors. Recent studies suggest that subtelomeric aberrations could be an etiological factor to the onset of HPE. Objectives: Investigate possible changes (microdeletions/duplications) in subtelomeric regions in individuals diagnosed with HPE. Methodology: Genetic evaluation of 25 DNA samples from individuals enrolled at HRAC-USP, diagnosed with HPE (performed by Syndromology Division HRAC/USP) by MLPA technique, as proposed by Schouten et al (2002). Patients were previously screened for mutations/deletions in HPE candidate genes (SHH ZIC2, TGIF, GLI2 and PTCH1) by direct Sanger sequencing and MLPA technique, without any match. Analyses were performed at the Laboratory of Molecular Genetics, Hospital for Rehabilitation of Craniofacial Anomalies, HRAC-USP. Results: Among the 25 individuals analyzed, the predominant phenotype was HPE microform. The main clinical findings of the study sample were: hypotelorism, microcephaly, and cleft lip/palate (100%); flat nose (84%); presence of a single central incisor (24%) and low nasal bridge (64%). Four patients had CNS commitment (16%). No subtelomeric mutations were found in our sample, such as microdeletions/duplications of genes analyzed by MLPA technique. Thus, they remain without defined genetic diagnosis. Discussion: Subtelomeric changes were not found, suggesting that the predominant sample phenotype, microform HPE, could not be related with subtelomeric changes associated to the disease outbreak. However, it should be noted that the sample universe is relatively small, so this may not be a true example of HPE microform cases. It should also be reinforced the wide variety of factors involved in the onset of this pathology, as well as the involvement of other genes not yet established and environmental causes, not completely understood. Conclusions: No subtelomeric mutations were found in the HPE individuals studied. MLPA technique consists in a rapid, sensitive and cost effective methodology, when compared to other techniques being suitable for use in genetic diagnostic laboratories, since several studies have shown that consists of a reliable method of diagnosis. Due to the relatively small sample size used in this study, and even inconsistent data in literature, further studies are needed to make it possible to perform a differential diagnosis, explaining the wide phenotypic spectrum observed in this disease, as suggested by the multiple hit hypothesis.

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / A doença de Parkinson (DP) é uma das desordens neurodegenerativas mais comuns associada ao envelhecimento, alcançando 2% aos 70 anos. É uma doença caracterizada pela degeneração progressiva de neurônios dopaminérgicos nigrais nos gânglios basais e pela presença de inclusões protéicas citoplasmáticas denominadas corpúsculos e neuritos de Lewy nos neurônios sobreviventes. A etiologia da DP é pouco conhecida, sendo considerada, na maioria dos casos, idiopática. Conhecimentos alcançados nos últimos 15 anos sobre a base genética da DP demonstram, claramente, que os fatores genéticos desempenham um importante papel na etiologia desta desordem. Neste trabalho, rastreamos mutações nos genes que codificam proteínas participantes de vias metabólicas mitocondriais (Parkin, PINK1 e DJ-1) em 136 pacientes brasileiros com manifestação precoce da DP, através do sequenciamento automático e da técnica de MLPA. Avaliamos a presença de variantes de sequência por meio do sequenciamento dos exons 1 a 12 do gene Parkin e dos exons 1 a 8 do gene PINK1. Em Parkin foram identificadas três mutações patogênicas ou potencialmente patogênicas, ambas em heterozigose: p.T240M, p.437L e p.S145N. Em PINK1 não encontramos variantes de ponto patogênicas. Através da técnica de MLPA investigamos alterações de dosagem nos genes Parkin, PINK1 e DJ-1. Identificamos cinco alterações no gene Parkin em quatro pacientes: uma duplicação heterozigota do exon 4 no paciente PAR2256, uma deleção heterozigota do exon 4 no probando PAR2099, uma deleção homozigota do exon 4 na paciente PAR3380 e um probando heterozigoto composto (PAR2396) com duas alterações, uma duplicação do exon 3 e uma deleção dos exons 5 e 6. No gene PINK1 identificamos uma deleção heterozigota do exon 1, que nunca foi descrita na literatura, em um paciente (PAR2083). Não encontramos alteração quantitativa no gene DJ-1. Neste estudo obtivemos uma frequência total de mutações patogênicas (pontuais e de dosagem) nos genes estudados de 7,3%, sendo 6,6% no gene Parkin e 0,7% no gene PINK1. / Parkinson's disease (PD) is one of the most common neurodegenerative disorders associated with aging, reaching 2% at age 70. It is a disease characterized by progressive degeneration of nigra dopaminergic neurons in the basal ganglia and the presence of cytoplasmic protein inclusions known as Lewy bodies and neurites in surviving neurons. The etiology of PD is poorly understood, being considered, in most cases, idiopathic. Knowledge achieved in the last 15 years about the genetic basis of PD clearly shows that genetic factors play an important role in the etiology of this disorder. In this study, we screened mutations in genes that encode proteins participating in mitochondrial metabolic pathways (Parkin, PINK1 and DJ-1) in 136 Brazilian patients with early onset PD, through automatic sequencing and MLPA technique. We evaluated the presence of sequence variants by means of sequencing of exons 1 to 12 of Parkin gene and exons 1 to 8 of PINK1 gene. In Parkin gene were identified three pathogenic or potentially pathogenic mutations, both in heterozygous state: p.T240M, p.437L e p.S145N. In PINK1 gene we did not find pathogenic point mutations. Through the MLPA technique we investigated dosage changes in Parkin, PINK1 and DJ-1 genes. We identified five exon rearrangements in Parkin gene in four patients: a heterozygous duplication of exon 4 in patient PAR2256, a heterozygous deletion of exon 4 in proband PAR2099, a homozygous deletion of exon 4 in patient PAR3380 and a compound heterozygote (PAR2396) with two changes, a duplication of exon 3 and a deletion of exons 5 and 6. In PINK1 gene we identified a heterozygous deletion of exon 1, which has never been described in literature, in one patient (PAR2083). We found no quantitative change in DJ-1 gene. In this study, we obtained an overall frequency of pathogenic mutations (sequence and dosage) in the genes studied of 7.3%, being 6.6% in Parkin gene and 0.7% in PINK1 gene.

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / A doença de Parkinson (DP) é uma das desordens neurodegenerativas mais comuns associada ao envelhecimento, alcançando 2% aos 70 anos. É uma doença caracterizada pela degeneração progressiva de neurônios dopaminérgicos nigrais nos gânglios basais e pela presença de inclusões protéicas citoplasmáticas denominadas corpúsculos e neuritos de Lewy nos neurônios sobreviventes. A etiologia da DP é pouco conhecida, sendo considerada, na maioria dos casos, idiopática. Conhecimentos alcançados nos últimos 15 anos sobre a base genética da DP demonstram, claramente, que os fatores genéticos desempenham um importante papel na etiologia desta desordem. Neste trabalho, rastreamos mutações nos genes que codificam proteínas participantes de vias metabólicas mitocondriais (Parkin, PINK1 e DJ-1) em 136 pacientes brasileiros com manifestação precoce da DP, através do sequenciamento automático e da técnica de MLPA. Avaliamos a presença de variantes de sequência por meio do sequenciamento dos exons 1 a 12 do gene Parkin e dos exons 1 a 8 do gene PINK1. Em Parkin foram identificadas três mutações patogênicas ou potencialmente patogênicas, ambas em heterozigose: p.T240M, p.437L e p.S145N. Em PINK1 não encontramos variantes de ponto patogênicas. Através da técnica de MLPA investigamos alterações de dosagem nos genes Parkin, PINK1 e DJ-1. Identificamos cinco alterações no gene Parkin em quatro pacientes: uma duplicação heterozigota do exon 4 no paciente PAR2256, uma deleção heterozigota do exon 4 no probando PAR2099, uma deleção homozigota do exon 4 na paciente PAR3380 e um probando heterozigoto composto (PAR2396) com duas alterações, uma duplicação do exon 3 e uma deleção dos exons 5 e 6. No gene PINK1 identificamos uma deleção heterozigota do exon 1, que nunca foi descrita na literatura, em um paciente (PAR2083). Não encontramos alteração quantitativa no gene DJ-1. Neste estudo obtivemos uma frequência total de mutações patogênicas (pontuais e de dosagem) nos genes estudados de 7,3%, sendo 6,6% no gene Parkin e 0,7% no gene PINK1. / Parkinson's disease (PD) is one of the most common neurodegenerative disorders associated with aging, reaching 2% at age 70. It is a disease characterized by progressive degeneration of nigra dopaminergic neurons in the basal ganglia and the presence of cytoplasmic protein inclusions known as Lewy bodies and neurites in surviving neurons. The etiology of PD is poorly understood, being considered, in most cases, idiopathic. Knowledge achieved in the last 15 years about the genetic basis of PD clearly shows that genetic factors play an important role in the etiology of this disorder. In this study, we screened mutations in genes that encode proteins participating in mitochondrial metabolic pathways (Parkin, PINK1 and DJ-1) in 136 Brazilian patients with early onset PD, through automatic sequencing and MLPA technique. We evaluated the presence of sequence variants by means of sequencing of exons 1 to 12 of Parkin gene and exons 1 to 8 of PINK1 gene. In Parkin gene were identified three pathogenic or potentially pathogenic mutations, both in heterozygous state: p.T240M, p.437L e p.S145N. In PINK1 gene we did not find pathogenic point mutations. Through the MLPA technique we investigated dosage changes in Parkin, PINK1 and DJ-1 genes. We identified five exon rearrangements in Parkin gene in four patients: a heterozygous duplication of exon 4 in patient PAR2256, a heterozygous deletion of exon 4 in proband PAR2099, a homozygous deletion of exon 4 in patient PAR3380 and a compound heterozygote (PAR2396) with two changes, a duplication of exon 3 and a deletion of exons 5 and 6. In PINK1 gene we identified a heterozygous deletion of exon 1, which has never been described in literature, in one patient (PAR2083). We found no quantitative change in DJ-1 gene. In this study, we obtained an overall frequency of pathogenic mutations (sequence and dosage) in the genes studied of 7.3%, being 6.6% in Parkin gene and 0.7% in PINK1 gene.

Submitted by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2018-07-19T10:42:04Z No. of bitstreams: 2 Dissertação - Rebeca Mota Goveia - 2018.pdf: 2457051 bytes, checksum: 721dc25f2c29d54fc3bd4f0f13c5fc83 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Approved for entry into archive by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2018-07-19T11:18:57Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Dissertação - Rebeca Mota Goveia - 2018.pdf: 2457051 bytes, checksum: 721dc25f2c29d54fc3bd4f0f13c5fc83 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Made available in DSpace on 2018-07-19T11:18:57Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Dissertação - Rebeca Mota Goveia - 2018.pdf: 2457051 bytes, checksum: 721dc25f2c29d54fc3bd4f0f13c5fc83 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Previous issue date: 2018-03-07 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / Introduction: Breast cancer is the second most common cancer in the world, and the most common among women, only 5% to 10% are hereditary and half of them are caused by hereditary breast and ovarian cancer (HBOC) , caused by variations in the BRCA1 and BRCA2 genes. Objectives: The present study aimed to identify the prevalence of deletions and duplications in BRCA1 and BRCA2 genes in breast cancer patients in Goiás, Brazil. Materials and methods: We evaluated 46 breast cancer patients who met National Comprehensive Cancer Network (NCCN) criteria for HBOC syndrome screening. A 4 ml blood sample was collected for DNA extraction using commercial kit and the MLPA (Multiplex Ligation Dependent Probe Amplification) technique was performed using the SALSA MLPA P002 BRCA1 and SALSA MLPA P045 BRCA2 / CHECK2 kits. Results and discussion: The majority of the patients were female (97.83%) and the mean age of the patients was 37.52 years. In this group, 43.47% of the patients were younger than 35 years at the time of diagnosis and 35% of them were diagnosed with triple negative tumors. The most common molecular subtype was luminal A (46.2%) followed by triple negative tumors (28.20%). No patient was found with rearrangements in BRCA1. In the BRCA2 gene, one patient (2.12%) presented a false positive result for the heterozygous deletion of exon 27, which may have been caused by the presence of a small change in the probe binding region. Conclusion: This was the first study performed to analyze large deletions and duplications in patients from the central-western region of Brazil. We can conclude that the frequency of large deletions and duplications in the BRCA1 and BRCA2 genes in the Goian population is low. / Introdução: O câncer de mama é o segundo tipo de câncer mais freqüente no mundo, e o mais comum entre as mulheres, apenas 5% a 10% são hereditários e metade deles são causados ​​pela síndrome do câncer de mama e ovário hereditário (HBOC), causada por variações nos genes BRCA1 e BRCA2. Objetivos: O presente estudo teve como objetivo identificar a prevalência de deleções e duplicações nos genes BRCA1 e BRCA2 em pacientes com câncer de mama no estado de Goiás, Brasil. Materiais e métodos: Avaliamos 46 pacientes com câncer de mama que atenderam aos critérios do National Comprehensive Cancer Network (NCCN) para pesquisa da síndrome HBOC. Foi coletada uma amostra de sangue de 4 ml para extração de DNA usando kit comercial e a técnica MLPA (Multiplex Ligation Dependent Probe Amplification) foi realizada usando os kits SALSA MLPA P002 BRCA1 e SALSA MLPA P045 BRCA2 / CHECK2. Resultados e discussão: A maioria dos pacientes era do sexo feminino (97.83%) e a idade média dos pacientes era de 37,52 anos. Neste grupo 43.47% dos pacientes possuíam idade inferior a 35 anos no momento do diagnóstico sendo que 35% destes foram diagnosticados com tumores triplo negativo. O subtipo molecular mais comum foi o luminal A (46.2%) seguido de tumores triplo negativos (28.20%). Nenhum paciente foi encontrado com rearranjos no gene BRCA1. No gene BRCA2, um paciente (2,12%) apresentou um resultado falso positivo para a deleção em heterozigoze do éxon 27, fato que pode ter sido ocasionado pela presença de uma pequena alteração na região de ligação da sonda. Conclusão: Este foi o primeiro estudo realizado para análise de grandes deleções e duplicações em pacientes da região centro-oeste do Brasil. Podemos concluir que a frequência de grandes deleções e duplicações nos genes BRCA1 e BRCA2 na população goiana é baixa.

Introdução: A Holoprosencefalia (HPE) é uma malformação craniofacial decorrente de falhas no processo de formação do sistema nervoso durante o desenvolvimento embrionário. Sua etiologia é heterogênea e complexa, envolvendo fatores ambientais e genéticos. Estudos recentes sugerem que alterações subteloméricas possam ser um dos fatores etiológicos para o aparecimento da HPE. Objetivos: Investigar possíveis alterações (microdeleções/duplicações) nas regiões subteloméricas em indivíduos com diagnóstico de HPE. Metodologia: Avaliação genética de 25 amostras de DNA de indivíduos matriculados no HRAC-USP, com diagnóstico de HPE através da técnica de MLPA (Multiplex ligation-dependent probe amplification), segundo protocolo proposto por Schouten et al. (2002). Estes indivíduos já foram previamente triados para mutações/deleções nos genes candidatos à HPE (SHH, ZIC2, TGIF, GLI2 e PTCH1) através do sequenciamento direto de Sanger e da técnica de MLPA, sem resultado positivo para qualquer alteração. Resultados: Dentre os 25 indivíduos analisados, o fenótipo predominante foi a microforma da doença. Os principais achados clínicos da amostra estudada foram: hipotelorismo, microcefalia e fissura de lábio e palato (100%), nariz achatado (84%), presença de um incisivo central único (24%) e ponte nasal baixa (64%). Quatro pacientes apresentaram comprometimento no SNC (16%). Nenhum indivíduo apresentou quaisquer alterações, como microdeleções e/ou duplicações nos genes contidos nas regiões subteloméricas, através da análise pela técnica de MLPA. Dessa forma, estes permanecem sem diagnóstico genético definido. Discussão: A não detecção de alterações subteloméricas sugere que o fenótipo predominante na amostra, microforma, possa não apresentar alterações subteloméricas relacionadas ao aparecimento da doença. Entretanto, deve-se salientar que o universo amostral é relativamente pequeno, de forma que este possa não ser um exemplo fiel dos casos de microforma da HPE. Reforça-se, ainda, a grande variedade de fatores envolvidos no surgimento desta patologia, bem como o envolvimento de outros genes ainda não estabelecidos, além das causas ambientais, ainda não completamente elucidadas. Conclusões: Não foram encontradas alterações subteloméricas nos pacientes com diagnóstico de HPE estudados. A técnica de MLPA consiste em uma metodologia rápida, sensível, eficaz e de baixo custo, quando comparada a outras técnicas, sendo indicada para o uso em laboratórios de diagnóstico genético, uma vez que diversos estudos já mostraram que consiste em um método confiável de diagnóstico. Devido ao tamanho relativamente pequeno da amostra utilizada neste estudo, e os dados ainda inconsistentes da literatura atual, estudos adicionais são necessários para que seja possível a realização de um diagnóstico diferencial, explicando o amplo espectro fenotípico observado nesta doença, conforme sugerido pela hipótese dos múltiplos fatores. / Introduction: Holoprosencephaly (HPE), a craniofacial malformation, results from flaws in formation process of the nervous system during embryonic development. The etiology is heterogeneous and complex, involving environmental and genetic factors. Recent studies suggest that subtelomeric aberrations could be an etiological factor to the onset of HPE. Objectives: Investigate possible changes (microdeletions/duplications) in subtelomeric regions in individuals diagnosed with HPE. Methodology: Genetic evaluation of 25 DNA samples from individuals enrolled at HRAC-USP, diagnosed with HPE (performed by Syndromology Division HRAC/USP) by MLPA technique, as proposed by Schouten et al (2002). Patients were previously screened for mutations/deletions in HPE candidate genes (SHH ZIC2, TGIF, GLI2 and PTCH1) by direct Sanger sequencing and MLPA technique, without any match. Analyses were performed at the Laboratory of Molecular Genetics, Hospital for Rehabilitation of Craniofacial Anomalies, HRAC-USP. Results: Among the 25 individuals analyzed, the predominant phenotype was HPE microform. The main clinical findings of the study sample were: hypotelorism, microcephaly, and cleft lip/palate (100%); flat nose (84%); presence of a single central incisor (24%) and low nasal bridge (64%). Four patients had CNS commitment (16%). No subtelomeric mutations were found in our sample, such as microdeletions/duplications of genes analyzed by MLPA technique. Thus, they remain without defined genetic diagnosis. Discussion: Subtelomeric changes were not found, suggesting that the predominant sample phenotype, microform HPE, could not be related with subtelomeric changes associated to the disease outbreak. However, it should be noted that the sample universe is relatively small, so this may not be a true example of HPE microform cases. It should also be reinforced the wide variety of factors involved in the onset of this pathology, as well as the involvement of other genes not yet established and environmental causes, not completely understood. Conclusions: No subtelomeric mutations were found in the HPE individuals studied. MLPA technique consists in a rapid, sensitive and cost effective methodology, when compared to other techniques being suitable for use in genetic diagnostic laboratories, since several studies have shown that consists of a reliable method of diagnosis. Due to the relatively small sample size used in this study, and even inconsistent data in literature, further studies are needed to make it possible to perform a differential diagnosis, explaining the wide phenotypic spectrum observed in this disease, as suggested by the multiple hit hypothesis.

Lipoprotein lipase deficiency is a malfunkction of a key enzyme for lipoprotein metabolism. Lipoprotein lipase deficiency can cause serious episodes of pancreatitis. The deficiency is caused by pathology in the LPL gene. There are many variants in the LPL gene and quite a lot of them are pathogenic.The first gene therapy in Europe was licensed for the treatment of lipoprotein lipase deficienciency using a gain-of-function variant of the LPL gene. A pattern of examination was established to including MLPA, Light SNiP, quantitative real time PCR and sequencing in order to find pacients for the treatment. Three pacients suitable for the gene therapy Alipogene tiparvovec (AAV1-LPL S447X) were found amongst a group of patients with history of pancreatitis.

A complexidade da fisiologia da audição resulta da participação e interação de produtos de grande número de genes, razão pela qual a surdez hereditária exibe enorme heterogeneidade genética. Estudos moleculares nas duas últimas décadas permitiram a identificação de vários genes responsáveis por surdez; entretanto, muitos ainda restam ser identificados. A maioria dos estudos de mapeamento de genes de surdez até então conduzidos privilegiou estratégias que buscavam mutações de ponto. Outros mecanismos mutacionais, como deleções e duplicações, foram pouco investigados. Portanto, a contribuição das CNVs (Copy Number Variations) na surdez hereditária é pouco conhecida. O objetivo desse trabalho foi identificar novos genes que possam ter papel na etiologia da surdez sindrômica ou não-sindrômica por meio da investigação de microdeleções e microduplicações em pacientes com perda auditiva. Selecionamos 25 genes candidatos (CTTN, FGF3, FGF19, FOXC1, FOXF2, FOXQ1, IMMP2L, KIF5C, LRRN3, MAP1A, MYLK4, PPP3CA, SHANK2, SLC5A7, STRC, TMC1, TMC2, TMC3, TMC4, TMC5, TMC6, TMC7, TMC8, TPCN2 e TUBB2A) para a triagem de microrrearranjos por meio da técnica de MLPA (Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification). Os genes candidatos foram selecionados a partir de rearranjos detectados em um estudo prévio realizado por meio de array-CGH (array-based Comparative Genomic Hybridization) em indivíduos com surdez sindrômica estudados em nosso laboratório, e também a partir de dados da literatura. Nossa casuística foi composta por 163 indivíduos, dos quais 74 são pacientes com surdez associada a outros sinais (sindrômicos), a maioria casos isolados, e 89 são pacientes com surdez não-sindrômica, propósitos de famílias em que segrega surdez de herança autossômica dominante ou recessiva. Desenhamos uma sonda sintética intragênica de MLPA para cada um dos genes candidatos. Foram detectadas seis deleções em TMC6 (3,7%), seis deleções e uma duplicação em STRC (4,3%) e uma duplicação em IMMP2L (0,6%). A triagem de alterações nesses três genes em 189 indivíduos fenotipicamente normais revelou quatro deleções em TMC6 (2,1%), oito deleções e três duplicações em STRC (5,8%) e três deleções em IMMP2L (1,6%). Todas as alterações em TMC6, tanto nos casos de surdez como nos controles, eram na realidade artefatos devidos a problemas de hibridação da sonda correspondente. No gene STRC, previamente já relacionado à surdez, os rearranjos nos indivíduos afetados devem se tratar de polimorfismos sem efeito fenotípico por serem muito frequentes na população. Contudo, é possível que haja nesses pacientes mutações adicionais que não puderam ser rastreadas e que poderiam contribuir ao fenótipo, em combinação com o rearranjo detectado, como já descrito em um caso da literatura. A duplicação em IMMP2L em uma paciente com surdez não-sindrômica, herdada da mãe igualmente afetada, mostrou-se a mais provavelmente relacionada ao fenótipo, pois o estudo complementar por meio de array-CGH revelou que o rearranjo inclui uma duplicação parcial da porção 3 de outro gene, DOCK4. O produto desse gene possui uma isoforma que se localiza nos estereocílios das células ciliadas e se liga a uma importante proteína relacionada à audição, a harmonina. Portanto, nossa hipótese é a de que a duplicação seja a causa da surdez na família e que DOCK4 seja um novo gene responsável por surdez. A associação de IMMP2L com surdez é menos provável devido ao grande número de CNVs não patogênicas já descritas que incluem partes desse gene. Estudos complementares são necessários para mapear a duplicação com mais precisão. Além disso, o rastreamento de mutações em DOCK4 em outras famílias com surdez pode vir a confirmar o possível papel desse gene na etiologia da surdez. / Several genes contribute to the complexity of physiology of hearing. Consequently, hereditary deafness is extremely heterogeneous from the genetic point of view. In the last two decades, several genes responsible for hereditary hearing loss have been identified, but a large number of genes remains to be found, as evidenced by the unexplained cases of inherited deafness. The search for point mutations in candidate genes after mapping based on linkage studies has been the main strategy in the identification of such genes. Other mutation mechanisms, such as deletions and duplications, have been rarely investigated, and the contribution of DNA copy number variants (CNVs) to hearing loss is not well known. This study aimed at identifying novel genes, which might play a role in the etiology of syndromic and non-syndromic deafness, through the search of gene microdeletions and microduplications. We selected 25 candidate genes (CTTN, FGF3, FGF19, FOXC1, FOXF2, FOXQ1, IMMP2L, KIF5C, LRRN3, MAP1A, MYLK4, PPP3CA, SHANK2, SLC5A7, STRC, TMC1, TMC2, TMC3, TMC4, TMC5, TMC6, TMC7, TMC8, TPCN2 and TUBB2A) based on their involvement in microimbalances detected by Array-based Comparative Genomic Hybridization (aCGH) in a previous study of a Brazilian sample of individuals with syndromic hearing loss from our laboratory and others reported in the literature. We studied 163 subjects, 74 of them presenting syndromic deafness, the majority were isolated cases, and 89 being probands of families in which nonsyndromic deafness had an autosomal dominant or recessive mode of inheritance. Gene deletions or duplications were screened by Multiplex Ligant-dependent Probe Amplification (MLPA) using one synthetic intragenic probe designed for each candidate gene. We detected six deletions in TMC6 (3,7%), six deletions and one duplication in STRC (4,3%), and one duplication in IMMP2L (0,6%). The screening of imbalances in these genes in a control sample of 189 hearing individuals revealed four deletions in TMC6 (2,1%), eight deletions and three duplications in STRC (5,8%) and three deletions in IMMP2L (1,6%). The imbalances found in TMC6, both in affected and control individuals, were in fact artifacts due to problems in the hybridization of the corresponding probe. As to the STRC gene, previously related to deafness, the imbalances are more likely to be 4 polymorphisms with no phenotypic effect. However, the possibility remains that additional undetected mutations in affected individuals contribute to their phenotype, in combination with the microrearrangement, as already reported in the literature. The duplication in IMMP2L in a non-syndromic patient, and also present in her affected mother, is most likely causative of deafness, since a complementary study performed with aCGH revealed that the rearrangement included a partial duplication of the 3 end of another gene, DOCK4. An isoform of the DOCK4 protein localizes to the stereocilia in the inner ear and interacts with harmonin, a protein already known to be involved in hearing. We hypothesize that this duplication may be the cause of deafness in the family and, this being the case, DOCK4 appears as a novel deafness gene. The causal association between IMMP2L and deafness is less plausible, because of the large number of reported non-pathogenic CNVs that include parts of this gene. Further studies are required to precisely map this duplication. In addition, the screening of mutations in DOCK4 in other families with hearing impairment is required to evaluate its possible role in the etiology of deafness.

A síndrome de Waardenburg é uma síndrome geneticamente heterogênea, com uma taxa de penetrância muito alta e expressividade extremamente variável. O objetivo desse estudo foi a caracterização molecular de uma amostra brasileira de pacientes com SW, dando continuidade ao estudo clínico feito em Pardono (2005), por meio do estudo de 48 probandos classificados com a síndrome de Waardenburg tipo 1 ou 2. Foram estudados os genes PAX3, MITF, SOX10, SNAI2, EDN3 e EDNRB, por meio do sequenciamento pelo método de Sanger, e investigadas as microdeleções e microduplicações dos genes PAX3, MITF e SOX10 pela técnica de MLPA (Multiplex Ligationdependent Probe Amplification). Dentre os resultados obtidos, identificou-se 17 mutações potencialmente patogênicas (35,4% dos probandos). Dessas, seis são variações de número de cópias (12,5% dos probandos). Além disso, foi realizado um levantamento na base de dados LOVD (Leiden Open Variation Database), no qual constam 105 mutações não sinônimas exônicas consideradas causativas da SW. Diversos algoritmos foram utilizados para avaliar a possível patogenicidade dessas mutações, os quais levam em conta as frequências das mutações na base de dados do projeto 1000 genomas e 6500 exomas, anotam as previsões dadas pelos programas Polyphen2, MutationTaster, LRT e SIFT e verificam a conservação em mamíferos e primatas. Por meio dessa análise, verificou-se que em 19 mutações desse tipo (18%) faltam evidências de sua patogenicidade, colocando-se em dúvida a sua relação com a síndrome de Waardenburg / Waardenburg syndrome (WS) is a genetically heterogeneous syndrome, with a very high penetrance rate and highly variable expressivity. The focus of this study was the molecular characterization of a Brazilian sample of patients with WS (48 probands classified with Waardenburg syndrome type 1 or 2). The analysis of genes PAX3, MITF, SOX10, SNAI2, EDN3 and EDNRB were performed by the Sanger sequencing method. Microduplications and microdeletions in genes PAX3, MITF and SOX10 were investigated by MLPA technique (Multiplex Ligationdependent Probe Amplification). We detected 17 mutations considered as potentially pathogenic in 17 probands of the sample (35,4 % of probands). Among these, six are copy number variations (12,5% of probands). In addition, we performed a survey using the database of LOVD (Leiden Open Variation Database), which contains 105 non-synonymous exonic mutations considered causative of WS. Several algorithms were used to evaluate the possible pathogenicity of these mutations, taking into account the frequency of mutations in the database project in 1000 genomes and 6500 exomes, and using programs : Polyphen2, MutationTaster, LRT and SIFT. These algorithms also verify the conservation of the variations in mammals and primates. Through this analysis, lack of evidence was found for the pathogenicity of 19 non-synonymous mutations (18%) and association of these with Waardenburg syndrome is questioned

A síndrome de Waardenburg é uma síndrome geneticamente heterogênea, com uma taxa de penetrância muito alta e expressividade extremamente variável. O objetivo desse estudo foi a caracterização molecular de uma amostra brasileira de pacientes com SW, dando continuidade ao estudo clínico feito em Pardono (2005), por meio do estudo de 48 probandos classificados com a síndrome de Waardenburg tipo 1 ou 2. Foram estudados os genes PAX3, MITF, SOX10, SNAI2, EDN3 e EDNRB, por meio do sequenciamento pelo método de Sanger, e investigadas as microdeleções e microduplicações dos genes PAX3, MITF e SOX10 pela técnica de MLPA (Multiplex Ligationdependent Probe Amplification). Dentre os resultados obtidos, identificou-se 17 mutações potencialmente patogênicas (35,4% dos probandos). Dessas, seis são variações de número de cópias (12,5% dos probandos). Além disso, foi realizado um levantamento na base de dados LOVD (Leiden Open Variation Database), no qual constam 105 mutações não sinônimas exônicas consideradas causativas da SW. Diversos algoritmos foram utilizados para avaliar a possível patogenicidade dessas mutações, os quais levam em conta as frequências das mutações na base de dados do projeto 1000 genomas e 6500 exomas, anotam as previsões dadas pelos programas Polyphen2, MutationTaster, LRT e SIFT e verificam a conservação em mamíferos e primatas. Por meio dessa análise, verificou-se que em 19 mutações desse tipo (18%) faltam evidências de sua patogenicidade, colocando-se em dúvida a sua relação com a síndrome de Waardenburg / Waardenburg syndrome (WS) is a genetically heterogeneous syndrome, with a very high penetrance rate and highly variable expressivity. The focus of this study was the molecular characterization of a Brazilian sample of patients with WS (48 probands classified with Waardenburg syndrome type 1 or 2). The analysis of genes PAX3, MITF, SOX10, SNAI2, EDN3 and EDNRB were performed by the Sanger sequencing method. Microduplications and microdeletions in genes PAX3, MITF and SOX10 were investigated by MLPA technique (Multiplex Ligationdependent Probe Amplification). We detected 17 mutations considered as potentially pathogenic in 17 probands of the sample (35,4 % of probands). Among these, six are copy number variations (12,5% of probands). In addition, we performed a survey using the database of LOVD (Leiden Open Variation Database), which contains 105 non-synonymous exonic mutations considered causative of WS. Several algorithms were used to evaluate the possible pathogenicity of these mutations, taking into account the frequency of mutations in the database project in 1000 genomes and 6500 exomes, and using programs : Polyphen2, MutationTaster, LRT and SIFT. These algorithms also verify the conservation of the variations in mammals and primates. Through this analysis, lack of evidence was found for the pathogenicity of 19 non-synonymous mutations (18%) and association of these with Waardenburg syndrome is questioned

A complexidade da fisiologia da audição resulta da participação e interação de produtos de grande número de genes, razão pela qual a surdez hereditária exibe enorme heterogeneidade genética. Estudos moleculares nas duas últimas décadas permitiram a identificação de vários genes responsáveis por surdez; entretanto, muitos ainda restam ser identificados. A maioria dos estudos de mapeamento de genes de surdez até então conduzidos privilegiou estratégias que buscavam mutações de ponto. Outros mecanismos mutacionais, como deleções e duplicações, foram pouco investigados. Portanto, a contribuição das CNVs (Copy Number Variations) na surdez hereditária é pouco conhecida. O objetivo desse trabalho foi identificar novos genes que possam ter papel na etiologia da surdez sindrômica ou não-sindrômica por meio da investigação de microdeleções e microduplicações em pacientes com perda auditiva. Selecionamos 25 genes candidatos (CTTN, FGF3, FGF19, FOXC1, FOXF2, FOXQ1, IMMP2L, KIF5C, LRRN3, MAP1A, MYLK4, PPP3CA, SHANK2, SLC5A7, STRC, TMC1, TMC2, TMC3, TMC4, TMC5, TMC6, TMC7, TMC8, TPCN2 e TUBB2A) para a triagem de microrrearranjos por meio da técnica de MLPA (Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification). Os genes candidatos foram selecionados a partir de rearranjos detectados em um estudo prévio realizado por meio de array-CGH (array-based Comparative Genomic Hybridization) em indivíduos com surdez sindrômica estudados em nosso laboratório, e também a partir de dados da literatura. Nossa casuística foi composta por 163 indivíduos, dos quais 74 são pacientes com surdez associada a outros sinais (sindrômicos), a maioria casos isolados, e 89 são pacientes com surdez não-sindrômica, propósitos de famílias em que segrega surdez de herança autossômica dominante ou recessiva. Desenhamos uma sonda sintética intragênica de MLPA para cada um dos genes candidatos. Foram detectadas seis deleções em TMC6 (3,7%), seis deleções e uma duplicação em STRC (4,3%) e uma duplicação em IMMP2L (0,6%). A triagem de alterações nesses três genes em 189 indivíduos fenotipicamente normais revelou quatro deleções em TMC6 (2,1%), oito deleções e três duplicações em STRC (5,8%) e três deleções em IMMP2L (1,6%). Todas as alterações em TMC6, tanto nos casos de surdez como nos controles, eram na realidade artefatos devidos a problemas de hibridação da sonda correspondente. No gene STRC, previamente já relacionado à surdez, os rearranjos nos indivíduos afetados devem se tratar de polimorfismos sem efeito fenotípico por serem muito frequentes na população. Contudo, é possível que haja nesses pacientes mutações adicionais que não puderam ser rastreadas e que poderiam contribuir ao fenótipo, em combinação com o rearranjo detectado, como já descrito em um caso da literatura. A duplicação em IMMP2L em uma paciente com surdez não-sindrômica, herdada da mãe igualmente afetada, mostrou-se a mais provavelmente relacionada ao fenótipo, pois o estudo complementar por meio de array-CGH revelou que o rearranjo inclui uma duplicação parcial da porção 3 de outro gene, DOCK4. O produto desse gene possui uma isoforma que se localiza nos estereocílios das células ciliadas e se liga a uma importante proteína relacionada à audição, a harmonina. Portanto, nossa hipótese é a de que a duplicação seja a causa da surdez na família e que DOCK4 seja um novo gene responsável por surdez. A associação de IMMP2L com surdez é menos provável devido ao grande número de CNVs não patogênicas já descritas que incluem partes desse gene. Estudos complementares são necessários para mapear a duplicação com mais precisão. Além disso, o rastreamento de mutações em DOCK4 em outras famílias com surdez pode vir a confirmar o possível papel desse gene na etiologia da surdez. / Several genes contribute to the complexity of physiology of hearing. Consequently, hereditary deafness is extremely heterogeneous from the genetic point of view. In the last two decades, several genes responsible for hereditary hearing loss have been identified, but a large number of genes remains to be found, as evidenced by the unexplained cases of inherited deafness. The search for point mutations in candidate genes after mapping based on linkage studies has been the main strategy in the identification of such genes. Other mutation mechanisms, such as deletions and duplications, have been rarely investigated, and the contribution of DNA copy number variants (CNVs) to hearing loss is not well known. This study aimed at identifying novel genes, which might play a role in the etiology of syndromic and non-syndromic deafness, through the search of gene microdeletions and microduplications. We selected 25 candidate genes (CTTN, FGF3, FGF19, FOXC1, FOXF2, FOXQ1, IMMP2L, KIF5C, LRRN3, MAP1A, MYLK4, PPP3CA, SHANK2, SLC5A7, STRC, TMC1, TMC2, TMC3, TMC4, TMC5, TMC6, TMC7, TMC8, TPCN2 and TUBB2A) based on their involvement in microimbalances detected by Array-based Comparative Genomic Hybridization (aCGH) in a previous study of a Brazilian sample of individuals with syndromic hearing loss from our laboratory and others reported in the literature. We studied 163 subjects, 74 of them presenting syndromic deafness, the majority were isolated cases, and 89 being probands of families in which nonsyndromic deafness had an autosomal dominant or recessive mode of inheritance. Gene deletions or duplications were screened by Multiplex Ligant-dependent Probe Amplification (MLPA) using one synthetic intragenic probe designed for each candidate gene. We detected six deletions in TMC6 (3,7%), six deletions and one duplication in STRC (4,3%), and one duplication in IMMP2L (0,6%). The screening of imbalances in these genes in a control sample of 189 hearing individuals revealed four deletions in TMC6 (2,1%), eight deletions and three duplications in STRC (5,8%) and three deletions in IMMP2L (1,6%). The imbalances found in TMC6, both in affected and control individuals, were in fact artifacts due to problems in the hybridization of the corresponding probe. As to the STRC gene, previously related to deafness, the imbalances are more likely to be 4 polymorphisms with no phenotypic effect. However, the possibility remains that additional undetected mutations in affected individuals contribute to their phenotype, in combination with the microrearrangement, as already reported in the literature. The duplication in IMMP2L in a non-syndromic patient, and also present in her affected mother, is most likely causative of deafness, since a complementary study performed with aCGH revealed that the rearrangement included a partial duplication of the 3 end of another gene, DOCK4. An isoform of the DOCK4 protein localizes to the stereocilia in the inner ear and interacts with harmonin, a protein already known to be involved in hearing. We hypothesize that this duplication may be the cause of deafness in the family and, this being the case, DOCK4 appears as a novel deafness gene. The causal association between IMMP2L and deafness is less plausible, because of the large number of reported non-pathogenic CNVs that include parts of this gene. Further studies are required to precisely map this duplication. In addition, the screening of mutations in DOCK4 in other families with hearing impairment is required to evaluate its possible role in the etiology of deafness.