Orientador: Nilva Kazue Sakomura / Resumo: O tradicional método dose-resposta usado para determinar a relação ideal dos aminoácidos essenciais (IAAR) se baseia na resposta da ave ao aumento gradativo da concentração do aminoácido teste nas dietas, tem sido considerado muito oneroso, uma vez que é necessário um ensaio para cada aminoácido avaliado. Por outro lado, pelo método da deleção é necessário apenas um ensaio para determinar IAAR, sendo assim mais rápido e prático. Dessa forma, o objetivo desta tese foi determinar a relação ideal dos aminoácidos essenciais para frangas e galinhas poedeiras utilizando o método da deleção. O primeiro estudo teve como objetivo determinar a exigência de nitrogênio para mantença (NMR) e o máximo potencial de retenção de nitrogênio (NRmaxT) para frangas em crescimento. Três ensaios de balanço de nitrogênio foram conduzidos utilizando 56 frangas Hy-line W-36 em cada ensaio (inicial: 14 a 28, cria: 56 a 70 e recria: 98 a 112 dias). Os tratamentos consistiram em seis níveis graduais de nitrogênio nas dietas (N1=8; N2=16; N3=24; N4=32; N5=40 e N6=48 g N /kg de ração), formuladas utilizando a técnica da diluição. As análises de regressão entre nitrogênio ingerido e excretado foram realizadas para ajustar a função exponencial e determinar o NMR, que foi estimado em 294, 331 e 355 mg/PCkg0,67 para as fases inicial, cria e recria, respectivamente. Os valores determinados para NMR foram aplicados para o cálculo do NRmaxT como o valor limiar da função entre o nitrogênio ingerido e o retido. O N... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The traditional dose-response method used to determine the ideal essential amino acid ratio (IAAR) is based on the response of the bird to the gradual increase of the test amino acid concentration in the diets, since it is considered very costly, since a test is required for each amino acid. On the other hand, by the deletion method, only one assay is required to determine IAAR, so it is faster and practical. Thus, the aim of this thesis was to determine the ideal amino acids ratio for pullets and laying hens using the deletion method. The first study was conducted to estimate daily N maintenance requirements (NMR) and the genetic potential for daily N retention (NRmaxT) of pullets in growth phase. Three nitrogen balance trials were conducted, a total of 56 Hy-line W-36 pullets were used in each trial in age periods (starter: 14 to 28, grower: 56 to 70 and developer: 98 to 112 days). The treatments consisted of six graded levels of nitrogen in the diets (L1=8; L2=16; L3=24; L4=32; L5=40 and L6=48 g N /kg of feed), formulated using the dilution technique. The regression analyses between nitrogen intake and nitrogen excretion were performed to fit the exponential function and to determine the NMR. It was estimated the daily NMR as 294, 331 and 355 mg/BWkg0.67 for the initial, grower and developer periods, respectively, were applied for further calculation of NRmaxT as the threshold value of the function between N intake and daily N balance. The NRmaxT was estimated by a statist... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

Orientador: Danilo Moretti Ferreira / Resumo: A síndrome de Williams-Beuren (SWB) é uma doença genética caracterizada por dismorfismos faciais, anomalias cardiovasculares, deficiência intelectual e perfil cognitivo típico. A SWB é causada por uma microdeleção hemizigótica da região cromossômica 7q11.23, de ~1,5Mb a 1,8Mb de genes de copias únicas e deleções maiores ou menores que esses limites são considerados deleções atípicas. O objetivo do trabalho foi detectar perdas ou ganhos de DNA por meio da técnica de MLPA na região crítica da SWB em pacientes com diagnóstico clínico estabelecido pela pontuação de escore da AAP, (2001) e com exame de FISH (-) realizado anteriormente pelo nosso grupo de pesquisa, e assim correlacionar os achados de perdas ou ganhos de DNA com os já descritos na literatura e correlaciona-los aos fenótipos/genótipo descritos em bancos de dados público como DVG, DECIPHER, UCSC Genome Browser dentre outros. Foram selecionados 30 indivíduos com hipótese diagnóstica de SWB e análise citogenética negativa para SWB estabelecida pela técnica da FISH. O diagnóstico clínico de SWB “clássica” foi estabelecido pelo escore da Academia Americana de Pediatria (2001). Foi realizada a extração de DNA das amostras e foi aplicada a técnica de MLPA com o kit SALSA P029 (MRC-Holland, Amsterdam, The Netherlands) com sondas específicas para os principais genes encontrados na região crítica da SWB. Nesta amostra predominou o sexo masculino (2M:1F) e a idade do 1° atendimento foi tardia (mediana 9,5 anos). A casuística ap... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Williams-Beuren Syndrome (WBS) is a genetic disorder characterized by facial dysmorphisms, cardiovascular anomalies, intellectual disability and typical cognitive profile. WBS is caused by a hemizygous microdeletion of the 7q11.23 chromosomal region, ~ 1.5Mb to 1.8Mb of single copy genes, and deletions larger or smaller than those limits are considered atypical deletions. The objective of this study was to detect DNA loss or gain by MLPA technique in the critical region of SWB in patients with clinical diagnosis established by AAP score (2001) and with FISH (-) examination previously performed by our search group, and thus correlate the findings of DNA loss or gain with those already described in the literature and correlate them with the phenotypes / genotype described in public databases such as DVG, DECIPHER, UCSC Genome Browser and others. Thirty individuals with diagnostic hypothesis of WBS and negative cytogenetic analysis for WBS established by the FISH technique were selected. The clinical diagnosis of “classic” WBS was established by the American Academy of Pediatrics score (2001). DNA extraction from the samples was performed and the MLPA technique was applied with the SALSA P029 kit (MRC-Holland, Amsterdam, The Netherlands) with probes specific for the major genes found in the critical region of the SWB. In this sample, the male gender predominated (2M: 1F) and the age of the first attendance was late (median 9.5 years). The sample presented the facial characterist... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

A Distrofia Muscular de Duchenne (DMD) é causada por mutações no gene distrofina que codifica a proteína distrofina, responsável pela manutenção da membrana da fibra muscular. Além do comprometimento muscular, a doença tem sido associada a déficits cognitivos e problemas de comportamento. A presente pesquisa teve como objetivos: avaliar sintomas do transtorno do espectro do autismo (TEA) em uma amostra formada por pacientes com DMD de acordo com os critérios diagnósticos do DSM V; identificar a proporção de pacientes com indício de deficiência intelectual (DI); examinar a possibilidade de prejuízos das funções executivas (flexibilidade e planejamento) nesses pacientes e verificar possiveis associações das mutações downstream ao exon 45 (inicial da isoforma cerebral da distrofina Dp140) a sintomas de autismo, deficiencia intelectual ou déficits nas funções executivas. O estudo seguiu metodologia de pesquisa exploratória. Participaram do estudo 67 pacientes com DMD com idades de 5 a 17 anos (Média= 10,74 e DP= 3,2) e 19 controles com idades de 04 a 14 anos (Média=8,73 e DP= 2,94). A bateria de avaliação incluiu a Escala de Avaliação do Autismo na Infância (CARS) para avaliação dos sintomas de autismo, o Teste das Matrizes Progressivas Coloridas de Raven para exame de inteligencia não verbal e subtestes da bateria Cambridge Neuropsychological Test Automated Battery (CANTAB) para avaliação das funções executivas de flexibilidade (Intra-Extra Dimensional Set Shift - IED) e planejamento (Stockings of Cambridge - SOC). A Escala de Brooke foi utilizada para avaliação do comprometimento motor dos membros superiores dos pacientes com DMD. Dentre os pacientes submetidos à escala CARS e ao teste de Raven, 20% atingiram o ponto de corte para autismo (7% com risco para TEA somente e 13% com risco para TEA e DI) e 19% apresentou classificação de inteligência indicativa de deficiência intelectual (sem risco para TEA). Em análise dos grupos de pacientes com DMD com e sem risco para autismo, observou-se diferença significativa em 14 das 15 questões da escala CARS (p<0,05, teste t). Mediante análise qualitativa, verificou-se que o grupo com risco para TEA apresentou médias mais altas em relação aos grupos com risco para DI e risco para DI e TEA nas questões referentes à resposta emocional, comunicação verbal, resposta intelectual e às impressões gerais do avaliador da escala CARS. O grupo sem risco para TEA apresentou escores mais elevados quanto às respostas emocional e intelectual. No grupo sem risco para TEA, observou-se correlação negativa entre idade e a questão de comunicação verbal da escala CARS, evidenciando melhora desta capacidade conforme o aumento da idade (p<0,05, correlação de Pearson). Em análise subseqüente com três grupos (TEA, DI, TEA + DI), o grupo com risco para TEA apresentou escores mais elevados (indicativos de maior intensidade de sintomas de autismo) na questão referente a medo e nervosismo, enquanto o grupo com risco para TEA e DI obteve maiores pontuações nas questões de resposta auditiva e comunicação verbal da escala CARS (p<0,05, teste de Kruskal-Wallis). O grupo com risco para DI obteve escores mais baixos (indicativos de menor intensidade de sintomas de autismo) nas questões referentes à imitação, resposta emocional, uso corporal, uso de objetos, paladar, olfato e tato, comunicação não verbal e impressões gerais do examinador (p<0,05). Conforme as análises de mutações genéticas, o grupo com mutações downstream ao exon 45 apresentou maior propensão para deficiência intelectual conforme a questão referente à resposta intelectual da escala CARS. Quanto à análise de funções executivas, o grupo com DMD apresentou prejuízos nas capacidades de flexibilidade cognitiva (teste IED) e planejamento (teste SOC) em relação ao grupo controle (p<0,05, teste de Mann-Whitney). Os déficits de planejamento não foram atribuídos a dificuldades motoras, uma vez que não houve IX diferença significativa entre grupos quanto aos tempos de resposta no teste SOC. O estudo mostrou evidencias da associação da Distrofia Muscular de Duchenne ao Transtorno do Espectro Autista, à deficiência intelectual e a prejuízos em funções executivas. Os resultados suportam achados prévios da associação entre mutações distais do gene distrofina e prejuízo intelectual. A escala CARS mostrou-se sensível na diferenciação entre casos de autismo e deficiência intelectual em pacientes com DMD. Estudos futuros são necessários para a elucidação de características de autismo em pacientes com DMD com e sem o diagnóstico desse transtorno do desenvolvimento / Duchenne Muscular Dystrophy (DMD) is caused by mutations in the dystrophin gene that encodes the dystrophin protein, which is responsible for maintaining the integrity of the muscle fiber membrane. In addition to muscle impairment, the disease has been associated to cognitive deficits and behavioral problems. The objectives of the present study were: to evaluate patients with DMD for symptoms of autism spectrum disorder (ASD) according to the DSM-V criteria; to identify the proportion of patients with evidence of intellectual disability (ID) in this sample; to examine the possibility of impairment of executive functions (flexibility and planning) in these patients and to verify possible associations between mutations downstream from exon 45 (first exon for the brain isoform D140) and symptoms of autism, intellectual disability or deficits in executive functions. The study followed exploratory research methodology. Sixty seven patients with DMD with ages ranging from 5 to 17 years (mean = 10.74 and SD = 3.2) and 19 controls aged 04 to 14 years (Mean = 8.73 and SD = 2.94) participated in the study. The assessment battery included the the Childhood Autism Rating Scale (CARS) for assessing symptoms of autism, the Raven\'s Colored Progressive Matrices Test for nonverbal intelligence evaluation, and subtests of the Cambridge Neuropsychological Test Automated Battery (CANTAB) for assessment of flexibility (Intra-Extra Dimensional Set Shift - IED) and planning (Stockings of Cambridge - SOC). The Brooke Scale was used to assess motor impairment in the upper limbs of DMD group. Among the patients who were evaluated with the CARS scale and the Raven\'s test, 20% reached the cut-off point for autism (7% at risk for only ASD and 13% at risk for ASD and ID). 19% presented evidence of intellectual disability (no risk for ASD). Comparison analysis between patients with and without risk for autism revealed significant difference in 14 of the 15 CARS scale itens (p<0.05, t-test). Qualitative analysis showed that the group with risk for ASD presented higher means in relation to the groups at risk for ID and risk for ID and ASD with higher CARS scores in the scalesitens related to emotional response, verbal communication, intellectual response and to the general impressions of the examiner. The non-risk group presented higher scores regarding emotional and intellectual responses. In this group, a negative correlation was observed between age and verbal communication suggesting improvement in this capacity in older patients (p <0.05, Pearson\'s correlation). In the subsequent analysis considering three groups at risk for (a) ASD only, (b) ID only, and (c) ASD and ID, patients at risk for ASD presented higher scores (indicating higher severity of symptoms of ASD) on the item concerning fear and nervousness, while the group at risk for ASD and ID obtained higher scores on the items regarding auditory response and verbal communication (CARS scale, p <0.05, Kruskal-Wallis test). The group at risk for only ID showed significant lower scores (suggesting lower severity of symptoms) on items related to imitation, emotional response, body use, object use, taste, smell and touch, nonverbal communication and general impressions of the examiner (p <0.05). Analyzes of genetic features showed that patients with mutations downstream from exon 45 presented higher propensity to intellectual deficiency according to the item concerning intellectual response (CARS scale). Executive functions analyses revealed impairments in cognitive flexibility (IED) and planning (SOC) among DMD patients in relation to the control group (p <0.05, Mann-Whitney test). Planning deficits were not attributed to motor difficulties, since there was no significant difference between groups regarding the response times in the SOC tasks. The study showed evidence of the association of Duchenne Muscular Dystrophy with Autistic XI Spectrum Disorder, intellectual disability and impairment in executive functions. The present results support previous findings regarding the association between distal mutations in the dystrophin gene and intellectual impairment. The CARS scale was sensitive to differentiation between autism and intellectual disability in patients with DMD. Future studies are needed to elucidate autism characteristics in DMD patients with and without the diagnosis of this developmental disorder

Objetivos: estudar indivíduos com (G1) e sem (G2) sinais da Síndrome Velocardiofacial (SVCF) para verificar diferenças entre eles quanto à extensão e espessura velar, profundidade nasofaríngea, razão entre profundidade nasofaríngea e extensão velar (PNF/EV), tamanho da falha velofaríngea, ângulo velar, movimento do véu palatino e das paredes laterais e posterior da faringe e à presença da tonsila faríngea; diferenças para as medidas de extensão e espessura velar, profundidade nasofaríngea e razão PNF/EV dos grupos estudados com os valores de normalidade propostos por Subtelny (1957); e correlação entre o tamanho da falha velofaríngea e a razão PNF/EV. Material e Método: estudo prospectivo com 60 indivíduos de ambos os sexos sem fissura palatina evidente e com disfunção velofaríngea (DVF), não operados, sendo 30 com sinais clínicos da SVCF (G1) (idade de 5,4 a 51 anos, com média de 15,7±9,5 anos) e 30 sem os sinais da SVCF (G2) (idade de 4,5 a 33 anos, com média de 15±7,6 anos). O exame videofluoroscópico foi realizado nas projeções lateral e frontal para análise da extensão e espessura velar, profundidade nasofaríngea, falha velofaríngea e ângulo velar, movimento do véu palatino, paredes laterais e posterior da faringe e presença da tonsila faríngea. Resultados: quanto às medidas de extensão e espessura velar, profundidade nasofaríngea e razão PNF/EV, não houve diferença entre os grupos quando se comparou os casos maiores de 18 anos, bem como os menores de 18 anos pareados por idade; mas quando a idade não foi pareada nos casos menores de 18 anos, a espessura velar foi menor (p=0,019) e a razão PNF/EV foi maior (p=0,048) no G1 e, ao se analisar independente da faixa etária, a razão PNF/EV foi maior no G1 (p=0,024). Em relação às medidas de normalidade, a extensão velar foi menor no G1 (p=0,007), a espessura velar foi menor no G1 (p=0,000) e G2 no (p=0,000), a profundidade nasofaríngea e a razão PNF/EV foram maiores no G1 (p=0,000) e no G2 (p=0,000), entretanto ao se considerar a variação de 2 desvios-padrão em relação aos valores de normalidade, não houve diferença entre os grupos para todas as medidas. Também não houve diferença entre os grupos quanto ao ângulo de elevação velar (p=0,232) e presença (p=0,698) e tamanho da falha velofaríngea (p=0,293), movimento velar (p=0,085) e das paredes laterais (p=0,763) e posterior (p=0,237) da faringe, além do tamanho da tonsila faríngea (p=0,307). Não houve correlação entre a falha velofaríngea e a razão PNF/EV no G1 (p=0,153) e no G2 (p=0,598). Conclusões: a razão PNF/EV foi maior nos indivíduos com DVF e sinais da SVCF comparados aos indivíduos com DVF sem os sinais da síndrome, sugerindo ser este um indicador velofaríngeo para a SVCF, enquanto os aspectos funcionais da velofaringe não diferiram entre os indivíduos com e sem os sinais da SVCF. Não houve correlação entre o tamanho da falha no fechamento velofaríngeo e a razão PNF/EV nos grupos com e sem sinais da SVCF. / Objective: to study individuals with (G1) and without (G2) signs of velocardiofacial syndrome (VCFS), so as to verify differences in terms of length and thickness of the soft palate, nasopharyngeal depth, ratio of nasopharyngeal depth to velar length (PD/VL), velopharyngeal gap size, velar angle, soft palate movement, lateral and posterior pharyngeal walls movement and the presence of adenoidal tissue; differences for the measurements of velar length and thickness, nasopharyngeal depth and PD/VL ratio for the groups studied with the normality values proposed by Subtelny (1957); and correlation between the size of velopharyngeal gap and the PD/VL ratio. Methods: a prospective study with 60 subjects from both genders, with no evident cleft palate, with velopharyngeal dysfunction (VPD), non operated, being 30 with clinical signs of VCFS (age range 5.4 to 51 yrs, mean 15.7±9.5 yrs), and 30 with no signs of VCFS (age range 4.5 to 33 yrs, mean 15±7.6 yrs). The videofluoroscopy was performed in lateral and frontal views, for the analysis of velar length and thickness, nasopharyngeal depth, velopharyngeal gap, velar angle, soft palate movement, lateral and posterior pharyngeal walls movement and the presence of adenoidal tissue. Results: there was no difference in the measurements of velar length and thickness, nasopharyngeal depth and PD/VL ratio, between the groups, when cases over 18 yrs, as well as those under 18, paired by age, were compared; however, when age was not paired in the cases under 18 yrs, the velar thickness was smaller (p=0.019) and the PD/VL ratio was greater (p=0.048) in G1 and, by analyzing regardless the age range, the PD/VL ratio was greater in G1 (p=0.024). In relation to normality measurements, the velar length was smaller in G1 (p=0.007), the velar thickness was smaller in G1 (p=0.000) and G2 (p=0.000), the nasopharyngeal depth and the PD/VL ratio were greater in G1 (p=0.000) and G2 (p=0.000), nevertheless, when considering the variation of 2 standard deviations in relation to the normality values, there was no difference between the groups for all measurements. No difference was seen between the groups, as to the velar angle (p=0.232) and presence (p=0.698) and size of velopharyngeal gap (p=0.293), velar movement (p=0.085) and lateral (p=0.763) and posterior (p=0.237) pharyngeal walls movement, besides the size of adenoidal tissue (p=0.307). No correlation was seen between the velopharyngeal gap and the PD/VL ratio in G1 (p=0.153) and G2 (p=0.598). Conclusions: the PD/VL ratio was greater in individuals with VPD and signs of VCFS, as compared to individuals with VPD with no signs of the syndrome, suggesting that this is a velopharyngeal indicator for VCFS, whereas velopharyngeal functional aspects did not differ between individuals with and without signs of VCFS. There was no correlation between the size of the velopharyngeal gap and the PD/VL ratio, in the groups with and without signs of VCFS.

Objetivo: Descrever as manifestações clínicas de indivíduos com hipótese diagnostica da Sindrome de deleção 22q11 (SD22q11) confirmados por testes genéticos, na primeira avaliação e durante o acompanhamento dos mesmos em avaliações subsequentes para uma melhor definição do curso natural da doença. Local: Laboratório de Genética e Citogenética Humana do HRAC-USP Bauru/SP. Casuística e metodologia: O presente trabalho é retrospectivo e analisou os dados de prontuários de 72 indivíduos cadastrados no HRAC-USP, os quais receberam hipótese diagnóstica da SD22q11 e foram confirmadas por teste genético (MLPA ou FISH). A avaliação envolveu a analise dos dados relatados por todos os setores do HRAC-USP. Resultados e discussão: Foramanalisados 72prontuários deindivíduos com a SD22q11. Constatamos que a idade media dos indivíduos quando do cadastro no HRAC-USP foi de seis anos. Também constatamos que houve um longo período de tempo entre os retornos ao hospital e que, nesses retornos, nem todas as especialidades foram contempladas. Esses fatos prejudicaram a analise da historia natural da anomalia em questão. Com relação às características fenotipicas, observamos a presença de sinais clínicos típicos, como por exemplo: face alongada, lábios finos, hipoplasia alar, anormalidades menores na orelha, dígitos longos e fendas palpebrais, fissuras labiopalatinas, cardiopatias congenitas, dificuldade de aprendizagem, atraso de linguagem e distúrbios comportamentais. A fissura oral foi à manifestação otorrinolaringológica mais frequente, presente em 75% dos pacientes, onde as fissuras submucosas foram as mais frequentes (43%). As características cognitivas como, atraso de fala (87%), dificuldades de aprendizagem (95%) e distúrbios comportamentais (81%), tiveram um resultado significativo, descritas em quase todos os indivíduos. As cardiopatias congênitas estavam presentes em 47,2% dos prontuários analisados. De um modo geral, comparando a frequência dos sinais clínicos encontrados neste trabalho com dados da literatura, constatamos que as frequências encontram-se dentro do esperado. Conclusão: A maioria dos indivíduos cadastrados no HRAC-USP, pertencentes ao grupo de estudo, apresentou idade superior a 06 anos. Portanto, a observação do curso natural da historia da SD22q11 para avaliar características fenotípicas que surgissem ao longo da evolução clinica do indivíduo e que pudessem ajudar no diagnóstico, ficou prejudicada. Mesmo nos casos onde o indivíduo foi cadastrado no HRAC-USP com idade inferior a dois anos, o diagnóstico foi tardio devido a falta de uma ação multidisciplinar e interdisciplinar no hospital. Mesmo não sendo possível avaliar as características fenotípicas surgidas durante a historia natural da doença, constatamos que as manifestações clínicas relatadas nos prontuários cursam com as características da SD22q11 e em frequências que corroboram com as da literatura / To describe clinical manifestations observed in medical records of individuals registered in the hospital with a diagnostic hypothesis of 22q11.2DS confirmed by genetic tests (MLPA OR FISH), since the first assessment in the HRAC-USP and during the follow up of these individuals in subsequent assessments, in order to achieve a better definition to the natural courses of the disease. Local: Laboratory of Human Genetics and Cytogenetics (HRAC-USP Bauru/SP). Methods: This retrospective study analyzed 72 medical records of individuals registered at the HRAC-USP, who were diagnosed with 22q11DS and who had this diagnosis confirmed by a genetic test (MLPA OR FISH). The assessment concerned the analysis of reported data in all sectors of the HRAC-USP. Results and Discussion: 72 medical records of individuals with 22q11DS were analyzed. It was verified that the average age of individuals when registering at the HRAC-USP was six years old. It was also verified that it took a long period of time for these individuals to return to the hospital and, when they did, not all specialties were contemplated. These facts harmed the analysis of the natural history of the anomaly. About the phenotypic characteristics, some typical clinical signs were observed, such as: long face, thin lips, hypoplasia nasal alar, minor abnormalities in the ear, long digits and narrow palpebral fissures, palatal abnormalities, congenital heart defects, learning disabilities, delay speech and behavioral disorders. An oral cleft was the most frequent otorhinolaryngology manifestation, present in 75% of the patients; among which submucous cleft palate were the most frequent (43%). Cognitive features such as, delay speech (87%), learning disabilities (95%) and behavioral disorders (81%) had a significant result, described in almost all individuals. Congenital heart defects were observed at 4% to 48% of individuals with 22q11.2DS, in this study it was observed in 47.2%. In general, comparing the frequency of some clinical signs observed in this study with the literature data, it was verified that the frequencies were within expectations. Conclusion: Most of the individuals registered at the HRAC belonging to the study group were over 6 years old. Therefore, the observation of natural course of the history of 22q11DS to evaluate the phenotypic characteristics that would arise during the clinical evolution of the individual and that could help in the diagnosis was harmed. Even in cases when the individual was registered at the HRAC-USPunder the age of two, the diagnosis was delayed due to lack of a multidisciplinary and interdisciplinary action in the hospital. Even not being possible to measure the phenotypic characteristics that emerged during the natural history of the disease, it was verified that the clinical manifestations reported in the records occur with the 22q11DS characteristics and in frequencies that corroborate with the literature

Introdução: A Holoprosencefalia (HPE) é uma malformação craniofacial decorrente de falhas no processo de formação do sistema nervoso durante o desenvolvimento embrionário. Sua etiologia é heterogênea e complexa, envolvendo fatores ambientais e genéticos. Estudos recentes sugerem que alterações subteloméricas possam ser um dos fatores etiológicos para o aparecimento da HPE. Objetivos: Investigar possíveis alterações (microdeleções/duplicações) nas regiões subteloméricas em indivíduos com diagnóstico de HPE. Metodologia: Avaliação genética de 25 amostras de DNA de indivíduos matriculados no HRAC-USP, com diagnóstico de HPE através da técnica de MLPA (Multiplex ligation-dependent probe amplification), segundo protocolo proposto por Schouten et al. (2002). Estes indivíduos já foram previamente triados para mutações/deleções nos genes candidatos à HPE (SHH, ZIC2, TGIF, GLI2 e PTCH1) através do sequenciamento direto de Sanger e da técnica de MLPA, sem resultado positivo para qualquer alteração. Resultados: Dentre os 25 indivíduos analisados, o fenótipo predominante foi a microforma da doença. Os principais achados clínicos da amostra estudada foram: hipotelorismo, microcefalia e fissura de lábio e palato (100%), nariz achatado (84%), presença de um incisivo central único (24%) e ponte nasal baixa (64%). Quatro pacientes apresentaram comprometimento no SNC (16%). Nenhum indivíduo apresentou quaisquer alterações, como microdeleções e/ou duplicações nos genes contidos nas regiões subteloméricas, através da análise pela técnica de MLPA. Dessa forma, estes permanecem sem diagnóstico genético definido. Discussão: A não detecção de alterações subteloméricas sugere que o fenótipo predominante na amostra, microforma, possa não apresentar alterações subteloméricas relacionadas ao aparecimento da doença. Entretanto, deve-se salientar que o universo amostral é relativamente pequeno, de forma que este possa não ser um exemplo fiel dos casos de microforma da HPE. Reforça-se, ainda, a grande variedade de fatores envolvidos no surgimento desta patologia, bem como o envolvimento de outros genes ainda não estabelecidos, além das causas ambientais, ainda não completamente elucidadas. Conclusões: Não foram encontradas alterações subteloméricas nos pacientes com diagnóstico de HPE estudados. A técnica de MLPA consiste em uma metodologia rápida, sensível, eficaz e de baixo custo, quando comparada a outras técnicas, sendo indicada para o uso em laboratórios de diagnóstico genético, uma vez que diversos estudos já mostraram que consiste em um método confiável de diagnóstico. Devido ao tamanho relativamente pequeno da amostra utilizada neste estudo, e os dados ainda inconsistentes da literatura atual, estudos adicionais são necessários para que seja possível a realização de um diagnóstico diferencial, explicando o amplo espectro fenotípico observado nesta doença, conforme sugerido pela hipótese dos múltiplos fatores. / Introduction: Holoprosencephaly (HPE), a craniofacial malformation, results from flaws in formation process of the nervous system during embryonic development. The etiology is heterogeneous and complex, involving environmental and genetic factors. Recent studies suggest that subtelomeric aberrations could be an etiological factor to the onset of HPE. Objectives: Investigate possible changes (microdeletions/duplications) in subtelomeric regions in individuals diagnosed with HPE. Methodology: Genetic evaluation of 25 DNA samples from individuals enrolled at HRAC-USP, diagnosed with HPE (performed by Syndromology Division HRAC/USP) by MLPA technique, as proposed by Schouten et al (2002). Patients were previously screened for mutations/deletions in HPE candidate genes (SHH ZIC2, TGIF, GLI2 and PTCH1) by direct Sanger sequencing and MLPA technique, without any match. Analyses were performed at the Laboratory of Molecular Genetics, Hospital for Rehabilitation of Craniofacial Anomalies, HRAC-USP. Results: Among the 25 individuals analyzed, the predominant phenotype was HPE microform. The main clinical findings of the study sample were: hypotelorism, microcephaly, and cleft lip/palate (100%); flat nose (84%); presence of a single central incisor (24%) and low nasal bridge (64%). Four patients had CNS commitment (16%). No subtelomeric mutations were found in our sample, such as microdeletions/duplications of genes analyzed by MLPA technique. Thus, they remain without defined genetic diagnosis. Discussion: Subtelomeric changes were not found, suggesting that the predominant sample phenotype, microform HPE, could not be related with subtelomeric changes associated to the disease outbreak. However, it should be noted that the sample universe is relatively small, so this may not be a true example of HPE microform cases. It should also be reinforced the wide variety of factors involved in the onset of this pathology, as well as the involvement of other genes not yet established and environmental causes, not completely understood. Conclusions: No subtelomeric mutations were found in the HPE individuals studied. MLPA technique consists in a rapid, sensitive and cost effective methodology, when compared to other techniques being suitable for use in genetic diagnostic laboratories, since several studies have shown that consists of a reliable method of diagnosis. Due to the relatively small sample size used in this study, and even inconsistent data in literature, further studies are needed to make it possible to perform a differential diagnosis, explaining the wide phenotypic spectrum observed in this disease, as suggested by the multiple hit hypothesis.

Submitted by JULIANO CESAR DE PAULA DORIGAM null (dorigam@ig.com.br) on 2016-04-05T22:07:08Z No. of bitstreams: 1 Tese_Juliano_Cesar_de_Paula_Dorigam.pdf: 1417249 bytes, checksum: daa9830f113e4e5b6e1457a8d00e5535 (MD5) / Rejected by Ana Paula Grisoto (grisotoana@reitoria.unesp.br), reason: Solicitamos que realize uma nova submissão seguindo as orientações abaixo: No campo “Versão a ser disponibilizada online imediatamente” foi informado que seria disponibilizado o texto completo porém no campo “Data para a disponibilização do texto completo” foi informado que o texto completo deverá ser disponibilizado apenas 6 meses após a defesa. Caso opte pela disponibilização do texto completo apenas 6 meses após a defesa selecione no campo “Versão a ser disponibilizada online imediatamente” a opção “Texto parcial”. Esta opção é utilizada caso você tenha planos de publicar seu trabalho em periódicos científicos ou em formato de livro, por exemplo e fará com que apenas as páginas pré-textuais, introdução, considerações e referências sejam disponibilizadas. Se optar por disponibilizar o texto completo de seu trabalho imediatamente selecione no campo “Data para a disponibilização do texto completo” a opção “Não se aplica (texto completo)”. Isso fará com que seu trabalho seja disponibilizado na íntegra no Repositório Institucional UNESP. Por favor, corrija esta informação realizando uma nova submissão. Agradecemos a compreensão. on 2016-04-07T17:56:34Z (GMT) / Submitted by JULIANO CESAR DE PAULA DORIGAM null (dorigam@ig.com.br) on 2016-04-07T18:03:38Z No. of bitstreams: 1 Tese_Juliano_Cesar_de_Paula_Dorigam.pdf: 1417249 bytes, checksum: daa9830f113e4e5b6e1457a8d00e5535 (MD5) / Approved for entry into archive by Felipe Augusto Arakaki (arakaki@reitoria.unesp.br) on 2016-04-07T20:27:46Z (GMT) No. of bitstreams: 1 dorigam_jcp_dr_jabo.pdf: 1417249 bytes, checksum: daa9830f113e4e5b6e1457a8d00e5535 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-04-07T20:27:46Z (GMT). No. of bitstreams: 1 dorigam_jcp_dr_jabo.pdf: 1417249 bytes, checksum: daa9830f113e4e5b6e1457a8d00e5535 (MD5) Previous issue date: 2016-02-26 / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / O tradicional método dose-resposta usado para determinar a relação ideal dos aminoácidos essenciais (IAAR) tem sido considerado muito oneroso, principalmente quando reprodutores são usados, pois é necessário um ensaio para cada aminoácido essencial (EAA). Por outro lado, o método da deleção tem sido considerado um meio rápido e prático para determinar a IAAR, pois apenas um ensaio é necessário. Dessa forma, o objetivo desta tese foi determinar a relação ideal dos aminoácidos essenciais para reprodutores (matrizes e galos) e frangos de corte utilizando o método da deleção. O primeiro estudo teve como objetivo estimar o perfil de aminoácidos essenciais e a relação ideal para a mantença de aves pelo método da deleção. Um ensaio de balanço de nitrogênio foi realizado utilizando 198 galos adultos, alojados individualmente em gaiolas metabólicas. Os tratamentos foram 33 dietas purificadas sendo 11 dietas com uma mistura de aminoácidos que fornecem alto consumo de proteínas de 500 mg N /BWkg0.75 por dia, 11 dietas que fornecem a ingestão média de proteína de 250 mg N /BWkg0.75 por dia (em cada dieta um aminoácido testado foi reduzido a 50%) e 11 dietas proporcionando baixa ingestão de proteína de 125 mg de N /BWkg0.75 por dia (formulada omitindo o aminoácido testado). Cada tratamento teve seis repetições. Após 48 h de jejum, recebendo água mais sacarose, os galos foram alimentados com 40 g das dietas por tubo, uma vez por dia, durante três dias. As excretas foram coletadas no prazo de 72 horas após a primeira ingestão. As dietas e as excretas foram analisadas quanto ao teor de nitrogênio. Para cada um dos aminoácidos estudados, uma regressão linear foi ajustada entre balanço de nitrogênio e ingestão do aminoácido. As exigências de mantença foram estimadas como a ingestão de aminoácidos para manter o equilíbrio de nitrogênio igual a zero. As exigências diárias dos aminoácidos para mantença foram estimadas em: Lys 11, Met 29, Thr 23, Trp 5, Arg 50, Val 29, His 6, Gly 54, Phe 49, Leu 78 e Ile 21 mg /BWkg0.75 por dia. Portanto, concluiu-se que a proporção de aminoácidos para mantença seria Lys 100, Met 276, Thr 220, Trp 48, Arg 467, Val 275, His 60, Gly 511, Phe 467, Leu 735 e Ile 198% independente da unidade usada. O perfil de aminoácidos essenciais e a relação ideal para mantença das aves, estimado neste estudo, contribui para a melhoria do modelo fatorial para estimar exigências de aminoácidos essenciais para aves. No segundo estudo, duas abordagens utilizando o método da deleção dos aminoácidos (AA), um com abate comparativo e outro com balanço de nitrogênio, foram utilizados para reavaliar as pressupostas relações ideais entre os aminoácidos essenciais (EAA): lisina (Lys), metionina+cistina (Met+Cys), treonina (Thr), triptofano (Trp), arginina (Arg), valina (Val), isoleucina (Ile), leucina (Leu), fenilalanina + tirosina (Phe+Tyr), glicina + serina (Gly+Ser), e histidina (His) para o crescimento de frangos de corte do genótipo Cobb 500 durante três períodos (I: 6 a 21, II: 22 a 37, e III: 38-53 d). Por ensaio, 120 frangos, machos, foram alojados em gaiolas metabólicas para avaliação dos dados de balanço de nitrogênio e eficiência de utilização de cada AA. Uma dieta balanceada em AA (BD) foi formulada de acordo com as recomendações das tabelas brasileiras (Rostagno et al., 2011) para a proteína ideal de frangos de corte em crescimento. As dietas com diferentes AAs limitantes foram criadas pela deleção da BD com amido de milho para alcançar 0,70 do nível de AA como BD e resuplementado com AA cristalinos, exceto o AA em estudo. As dietas com a deleção de cada AA levaram a uma piora significativa na utilização da proteína e indicou posição limitante válida destes AA. Além disso, no início e no final do ensaio, um grupo de aves com peso médio de cada repetição foi abatida sem perda de sangue para determinar a deposição de nitrogênio pela técnica do abate comparativo. O valor médio das relações ideais dos onze EAA testados, determinadas pelo abate comparativo, nos três períodos foram: Lys 100, Met+Cys 65, Thr 66, Trp 17, Arg 108, Val 79, Ile 61, Leu 122, Phe+Tyr 128, Gly+Ser 155, e His 41. Com base nos dados de eficiência dos AA observados, as relações ideais determinadas pelo balanço de nitrogênio foram: Lys 100, Met+Cys 72, Thr 65, Trp 17, Arg 106, Val 76, Ile 67, Leu 107, Phe + Tyr 115, Gly+Ser 137, e His 35. Existem algumas diferenças entre os resultados obtidos pelos dois métodos (Louvain e Goettingen), mas o método de Goettingen apresentou resultados mais condizentes com a literatura e menor variação nos resultados. No terceiro estudo, o objetivo foi determinar os parâmetros do modelo para a máxima retenção de nitrogênio (NRmaxT), a exigência de mantença de nitrogênio (NMR) e a eficiência de utilização de lisina (bc-1) para determinar a exigência de lisina (Lys) de aves reprodutoras pesadas. Os ensaios de balanço de nitrogênio foram realizados em dois períodos (I: 31-35 semanas e II: 46-50 semanas). Foram utilizados sete tratamentos com oito repetições e uma ave por gaiola; os tratamentos consistiram de sete dietas com níveis de proteína variando de 58,8-311,9 g/kg de ração, com a Lys sendo limitante na proteína dietética (c = 3,91 g de Lys em 100 g de CP). Para cada período, os dados de nitrogênio ingerido (NI), nitrogênio excretado (NEX), nitrogênio na massa de ovos (NEM), nitrogênio depositado (ND, ND = NI-NEX) e nitrogênio retido (NR, NR = ND + NEM + NMR) foram obtidos num ensaio de balanço de nitrogênio de 25 dias. A NMR foi calculada pela relação exponencial entre NEX e NI. O NRmaxT e o b (inclinação relacionadas com a qualidade da proteína) foram estimados pelo ajuste exponencial entre NR e NI. Foi obtido o bc-1 dividindo b por c. Com base no teste da razão de verossimilhança para os parâmetros do modelo, os valores obtidos foram 255 mg /BWkg0.67 para NMR, 0,000117 para b e 1684 mg/BWkg0.67 (período I) e 1484 mg/BWkg0.67 (período II) para NRmaxT. As ingestões de Lys foram estimadas pela função Lys = (ln (NRmaxT) -ln (NRmaxT-NR)):(16 × bc-1)) função, que resultou nas ingestões de Lys de 915 e 876 mg/d para matrizes nos períodos I e II, respectivamente. O estudo conclui que a exigência Lys ideal esta de acordo com os dados da literatura, mas as recomendações podem ser adaptadas de acordo com o consumo de ração, a deposição de proteína desejada e a eficiência de utilização do AA na dieta. No quarto estudo, o objetivo foi aplicar os dados de eficiência (bc-1) dos AAs lisina (Lys), metionina+cistina (Met+Cys), treonina (Thr), triptofano (trp), arginina (Arg), valina (Val), isoleucina (Ile), leucina (Leu), fenilalanina+tirosina (Phe+Tyr), glicina + serina (Gli+Ser) e histidina (His) para obter uma relação ideal de AA (IAAR) para matrizes. Os ensaios de balanço de nitrogênio foram realizados de 31 a 35 semanas e de 46 a 50 semanas. Foram utilizados doze tratamentos com oito repetições e uma ave por gaiola. Uma dieta balanceada (BD) foi formulada para atender a IAAR e a exigência de outros nutrientes para matrizes. As dietas limitantes foram formuladas diluindo BD com amido de milho e resuplementados com AAs cristalinos e outros ingredientes para alimentação animal, com exceção do AA em estudo. Em cada período, os dados de nitrogênio ingerido (NI), nitrogênio excretado (NEX), nitrogênio na massa de ovo (NEM), nitrogênio depositado (ND, ND = NI-NEX) e nitrogênio retido (NR, NR = ND + NEM + NMR) foram obtidos em um ensaio de 25 dias. Os valores de qualidade de proteínas (b) foram estimadas por b = (ln (NRmaxT) -ln (NRmaxT-NR)) : (NI)), onde NRmaxT é o potencial para a retenção máxima de nitrogênio de matrizes. Os valores de bc-1 foram obtidos dividindo b pela concentração do AA na dieta (c, g AA / 16 g de N). A posição limitante de cada AA foi confirmada e os valores de bc-1 foram usados para obter um IAAR média: Lys (100), Met + Cys (83), Trp (24), Thr (81), Arg (114), Val (90), Ile (93), Leu (105), Phe + Tyr (109), Gly + Ser (95), e His (35). A IAAR estava de acordo com a recomendação da literatura, validando este procedimento alternativo para a determinação da IAAR para aves reprodutoras pesadas. Finalmente, o objetivo deste quinto estudo foi aplicar o método da deleção para obter uma IAAR para aves reprodutoras pesadas. Os ensaios de balanço de nitrogênio foram realizados de 31 a 35 semanas e de 46 a 50 semanas. Foram utilizados doze tratamentos com oito repetições e uma ave por gaiola. Uma dieta balanceada (BD) foi formulada para atender rigorosamente a IAAR e a exigência de outros nutrientes. As dietas limitantes foram formuladas diluindo BD com amido de milho e resuplementados com aminoácidos cristalinos (EAA) e outros ingredientes para alimentação animal, com exceção do EAA em estudo. Cada ensaio durou 25 dias. As perdas de penas, a produção de ovos e o peso do ovo foram registrados diariamente e as amostras foram armazenadas para determinar NEM e o nitrogênio nas perdas de penas (NDFL), respectivamente. No início e no final de cada período, um grupo de matrizes foi abatido para determinar o nitrogênio depositado no corpo (NDB) e penas (NDF). A NR foi calculada como a soma de NDB, NDF, NDFL, NEM, e a exigência de nitrogênio para mantença (NMR = 255 mg /BWkg0.67 por dia). A redução percentual no NR resultante da deleção de cada EAA em relação à BD e o percentual do AA para excluir a partir da BD foram utilizados para calcular a exigência ótima do AA na dieta. A IAAR média determinada foi: Lis (100), Met + Cys (86), Trp (23), Thr (80), Arg (113), Vai (90), Ile (91), Leu (133), Phe + Tyr (108), Gly+Ser (94), e His (35). A IAAR determinada neste estudo estava de acordo com a recomendação da literatura para frangos de corte, especialmente usando o método de Goettingen, validando o método da deleção para determinar o IAAR. Além disso, o método foi padronizado para matrizes reprodutoras e os resultados deste estudo permitiram atualizar a relação ideal para estas aves. Da mesma forma, o método da deleção para determinar a IAAR de mantença também foi padronizado e o perfil ideal atualizado. Por fim, a padronização destes métodos vai permitir que a pesquisa brasileira usufrua de um procedimento rápido e de baixo custo para estimar e avaliar a IAAR. / The traditional dose-response method used to determine the ideal essential amino acid ratio (IAAR) has been considered too costly, especially when breeders are used, because an assay for each essential amino acid (EAA) is necessary. On the other hand, the deletion method has been considered a quick and practical way to determine the IAAR, because only one assay is required. Thus, the aim of this thesis was to determine the optimal ratio of essential amino acids for breeders (broiler breeder hens and roosters) and broilers using the deletion method. The first study aimed to estimate the essential amino acid profile and the ideal ratio for maintenance of poultry by deletion method. A nitrogen (N) balance trial was conducted using 198 adult roosters, housed individually in metabolic cages. The treatments were 33 purified diets being 11 diets with an EAA mixture providing high protein intake of 500 mg N/BWkg0.75 per day, 11 diets providing medium protein intake of 250 mg N/BWkg0.75 per day (in each diet one EAA tested was reduced 50%) and 11 diets providing low protein intake of 125 mg N/BWkg0.75 per day (made by omitting the EAA tested). Each treatment had six replicates. After 48 h of fasting receiving water plus sucrose, the roosters were fed 40 g of the diets by tube once a day for three days. The excreta were collected within 72 h after the first feeding. The diets and excreta were analyzed for nitrogen content. For each EAA studied, a linear regression was fitted by N balance and EAA intake. The maintenance requirements were estimated as the EAA intake to maintain the N balance equal to zero. The daily EAA requirements for maintenance were estimated to be: Lys 11, Met 29, Thr 23, Trp 5, Arg 50, Val 29, His 6, Gly 54, Phe 49, Leu 78 and Ile 21 mg/BWkg0.75 per day. Therefore, the EAA ratio for maintenance was concluded to be Lys 100, Met 276, Thr 220, Trp 48, Arg 467, Val 275, His 60, Gly 511, Phe 467, Leu 735 and Ile 198% independent of the scale. The EAA profile and the ideal ratio for maintenance of poultry estimated in this study contribute to improve factorial model for estimating EAA requirements for poultry. In the second study, two approaches using amino acid deletion method, one with comparative slaughter and another with N balance, were used to re-evaluate the actual assumptions of ideal ratios between the EAA: lysine (Lys), methionine+cystine (Met+Cys), threonine (Thr), tryptophan (Trp), arginine (Arg), valine (Val), isoleucine (Ile), leucine (Leu), phenylalanine+tyrosine (Phe+Tyr), glycine+serine (Gly+Ser), and histidine (His) for growing broilers of Cobb 500 genotype during three periods (I: 6 to 21, II: 22 to 37, and III: 38 to 53 d). Per trial, 120 male chickens were housed in metabolic cages for assessment of individual N-balance and AA efficiency data. An AA balanced diet (BD) was formulated according to recommendations of Brazilian tables (Rostagno et al., 2011) for the ideal protein in growing broilers. The diets with different limiting AAs were created by dilution of BD with corn starch to achieve 0.70 of the AA level in BD and supplemented with crystalline AAs, except the AA under study. The AA diluted diets led to significant impairment of protein utilization and indicated valid limiting position of these AAs. Also, at start and the end of the trial a group of birds with mean body weight of each replicate was killed with no blood loss to determine nitrogen deposition by comparative slaughter technique. The mean value of the optimum ratios of the eleven tested EAAs determined by comparative slaughter in the three periods are: Lys100, Met+Cys 65, Thr 66, Trp 17, Arg 108, Val 79, Ile 61, Leu 122, Phe+Tyr 128, Gly+Ser 155, and His 41. Based on observed AA efficiency data, the optimum ratios determined by nitrogen balance are: Lys 100, Met+Cys 72, Thr 65, Trp 17, Arg 106, Val 76, Ile 67, Leu 107, Phe+Tyr 115, Gly+Ser 137, and His 35. There are some differences among the results obtained by the two methods (Louvain and Goettingen approach), but the Goettingen approach provided result in accordance with the literature and less variation in the results. The third study aimed to determine the model parameters for maximum nitrogen retention (NRmaxT), nitrogen maintenance requirement (NMR) and the efficiency of lysine utilization (bc-1) to determine the lysine (Lys) requirements of broiler breeder hens. The N balance trials were performed in two periods (I: 31-35 wks and II: 46-50 wks). Seven treatments were used with eight replicates and one hen per cage; the treatments consisted of seven diets with protein levels ranging from 58.8 to 311.9 g/kg of feed, with Lys being limiting in the dietary protein (c = 3.91 g of Lys in 100 g of CP). For each period, the data of nitrogen intake (NI), nitrogen excretion (NEX), nitrogen in egg mass (NEM), nitrogen deposition (ND, ND=NI-NEX) and nitrogen retention (NR, NR=ND+NEM+NMR) were obtained in a balance trial of 25 days. The NMR was calculated by the exponential relationship between NEX and NI. The NRmaxT and b (slope related to protein quality) were estimated by the exponential fit between NR and NI. The bc-1 was obtained dividing b by c. Based on the likelihood ratio test for the model parameters, the obtained values were 255 mg/BWkg0.67 for NMR, 0.000117 for b and 1684 mg/BWkg0.67 (period I) and 1484 mg/BWkg0.67 (period II) for NRmaxT. The Lys intakes were estimated by the function Lys = (ln(NRmaxT)-ln(NRmaxT-NR)):(16×bc-1)), which resulted in the Lys intakes of 915 and 876 mg/d for breeder hens in the periods I and II, respectively. The current study concludes that the optimal Lys requirement is in range with literature data, but the recommendations can be adapted according to feed intake, aimed protein deposition and dietary AA efficiency. The fourth study aimed to apply the individual AA efficiency data (bc-1) for lysine (Lys), methionine+cystine (Met+Cys), threonine (Thr), tryptophan (Trp), arginine (Arg), valine (Val), isoleucine (Ile), leucine (Leu), phenylalanine+tyrosine (Phe+Tyr), glycine+serine (Gly+Ser) and histidine (His) to derive an ideal AA ratio (IAAR) for breeder hens. N-balance trials were performed from 31 to 35 wks and from 46 to 50 wks. Twelve treatments with eight replicates and one hen per cage were used. A balanced diet (BD) was formulated to meet the IAAR and the requirement of other nutrients for breeder hens. The limiting diets were formulated diluting BD with corn starch and refilled with crystalline AAs and other feed ingredients, except for the AA under study. In each period, the data of N-intake (NI), N-excretion (NEX), N in egg mass (NEM), N-deposition (ND, ND=NI-NEX) and N-retention (NR, NR=ND+NEM+NMR) were obtained in a balance trial of 25 days. The b values (protein quality) were estimated by b = (ln(NRmaxT)-ln(NRmaxT-NR)):(NI)), where NRmaxT is the potential for maximum nitrogen retention of breeder hens. The bc-1 values were obtained dividing b by the dietary AA concentration (c, g AA/16g N). The limiting position of each AA was confirmed and the bc-1 values were used to obtain an average IAAR: Lys (100), Met+Cys (83), Trp (24), Thr (81), Arg (114), Val (90), Ile (93), Leu (105), Phe+Tyr (109), Gly+Ser (95), and His (35). The IAAR was in the line with the recommendation from the literature, validating this alternative procedure for predicting dietary IAAR for broiler breeder hens. Finally, the aim of the fifith study was to apply the deletion method to derive an IAAR for broiler breeder hens. The nitrogen balance trials were performed from 31 to 35 wks and from 46 to 50 wks. Twelve treatments with eight replicates and one hen per cage were used. A balanced diet (BD) was formulated to strictly meet the IAAR and the requirement of other nutrients. The limiting diets were formulated diluting BD with corn starch and refilled with crystalline amino acids (AA) and other feed ingredients, except for the AA under study. Each feeding trial lasted 25 days. The feather losses, egg production and egg weight were recorded daily and the samples were stored to further determine NEM and nitrogen in feather losses (NDFL), respectively. At the start and the end of each period, a group of breeder hens were slaughtered to further determine nitrogen deposition in the body (NDB) and feathers (NDF). The NR was calculated as the sum of NDB, NDF, NDFL, NEM, and the nitrogen maintenance requirement (NMR=255 mg/BWkg0.67 per day). The percent reduction in NR resulting from the individual AA deletions relative to BD and the percent of the AA to delete from the BD were used to calculate the optimum in-feed AA requirement. The average IAAR determined was: Lys (100), Met+Cys (86), Trp (23), Thr (80), Arg (113), Val (90), Ile (91), Leu (133), Phe+Tyr (108), Gly+Ser (94), and His (35). The IAAR determined in this study corroborate with the recommendations for broilers in the literature, particularly when using the Goettingen approach, validating the deletion method for determining the IAAR. In addition, the method has been standardized for broiler breeder hens and the results of this study allowed updating the ideal ratio for these birds. Likewise, the deletion method for determining the IAAR for maintenance was also standardized and the ideal profile updated. Finally, the standardization of these methods will allow Brazilian research enjoy a rapid and low-cost procedure to estimate and evaluate the IAARs. / FAPESP: 2013/07136-5

Submitted by Rosangela Silva (rosangela.silva3@unioeste.br) on 2018-05-25T11:53:11Z No. of bitstreams: 2 Indianara Kawana Bueno.pdf: 2050489 bytes, checksum: 3865a86596759f1ff761267b04d8a615 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Made available in DSpace on 2018-05-25T11:53:11Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Indianara Kawana Bueno.pdf: 2050489 bytes, checksum: 3865a86596759f1ff761267b04d8a615 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Previous issue date: 2018-03-09 / The research for renewable energy sources became even more essential due the imminent depletion of the fossil fuel sources. In this context Brazil has a prominent position on the world stage, since it has already used ethanol from sugar cane for some decades. The second generation ethanol (2G) is produced from the lignocellulosic biomass of the vegetable, which is composed by cellulose, hemicellulose and lignin. The hydrolysis of these compounds requires a specific and high cost enzymatic cocktail. On this scenario, the Trichoderma reesei fungus gains spotlight, since it is one the microorganisms with the highest potential to produce hydroliytic enzymes. Therefore, the attempt to increase the cellulases production of this fungus is an important for the production of biofuels more attractive to the market. The aim of this work is to confirm the deletion of the sequence which codifies the zinc finger motif of the transcription factor ACE1 for cellulose repression from the T. reesei RUT-C30 strain and to characterize the enzymatic production of these mutant strains named T. reesei RUT-C30Δzface1. The enzymatic quantification was carried using the substrates carboxymethyl cellulose, microcrystalline cellulose and Whatman paper filter. The deletion confirmation occurred by the absence of the amplification gene ace1 on the mutants and the amplification of a 429 pb fragment of the RUT-C30 parental strain when the same primers and PCR conditions where used. These results suggest that the deletion of the zinc finger motif of the from ACE1 transcription factor is a prominent way to achieve an economically viable production of bioethanol. / Com a depleção eminente das fontes de combustíveis fósseis, torna-se cada vez mais imprescindível a busca por fontes renováveis de energia. Neste âmbito, o Brasil tem destaque no cenário mundial, pois já utiliza o etanol a partir da cana-de-açúcar há algumas décadas. O etanol de segunda geração (2G) é produzido a partir da massa lignocelulolítica do vegetal, que é composta de celulose, hemicelulose e lignina. A hidrólise desses compostos necessita de um coquetel enzimático específico e de alto custo. Neste cenário, o fungo Trichoderma reesei ganha destaque, pois é um dos microrganismos com maior potencial para produção de enzimas hidrolíticas. Desta forma, as tentativas de aumentar a produção de celulases desse fungo, torna a produção do bioetanol uma alternativa mais atrativa ao mercado. Este trabalho teve como objetivos confirmar a deleção da sequência que codifica o dedo de zinco do fator de transcrição do repressor de celulase ACE1 da linhagem T. reesei RUT-C30 e caracterizar a produção enzimática dessas linhagens mutantes denominadas T. reesei RUT-C30Δzface1. A confirmação de deleção ocorreu pela ausência de amplificação do gene ace1 nos mutantes e amplificação de um fragmento de 479 pb na linhagem parental RUT-C30, quando utilizados os mesmos primers e condições de reação de PCR. A dosagem enzimática com os substratos carboximetilcelulose (CMC), celulose microcristalina (Avicel®) e papel de filtro Whatman (PF), mostraram que o RUT-C30Δzface1 tem a atividade celulolítica aumentada em até 3,2 vezes em Avicel e 2,1 vezes em CMC e PF em comparação à linhagem parental RUT-C30. Em 24 horas de hidrólise os mutantes apresentaram liberação de açúcar 1,4 vezes maior em relação ao RUT-C30. Estes resultados sugerem que a deleção parcial do fator de transcrição ACE1 é um proeminente caminho para a conquista de uma produção de bioetanol economicamente viável.

Objetivo: Descrever as manifestações clínicas de indivíduos com hipótese diagnostica da Sindrome de deleção 22q11 (SD22q11) confirmados por testes genéticos, na primeira avaliação e durante o acompanhamento dos mesmos em avaliações subsequentes para uma melhor definição do curso natural da doença. Local: Laboratório de Genética e Citogenética Humana do HRAC-USP Bauru/SP. Casuística e metodologia: O presente trabalho é retrospectivo e analisou os dados de prontuários de 72 indivíduos cadastrados no HRAC-USP, os quais receberam hipótese diagnóstica da SD22q11 e foram confirmadas por teste genético (MLPA ou FISH). A avaliação envolveu a analise dos dados relatados por todos os setores do HRAC-USP. Resultados e discussão: Foramanalisados 72prontuários deindivíduos com a SD22q11. Constatamos que a idade media dos indivíduos quando do cadastro no HRAC-USP foi de seis anos. Também constatamos que houve um longo período de tempo entre os retornos ao hospital e que, nesses retornos, nem todas as especialidades foram contempladas. Esses fatos prejudicaram a analise da historia natural da anomalia em questão. Com relação às características fenotipicas, observamos a presença de sinais clínicos típicos, como por exemplo: face alongada, lábios finos, hipoplasia alar, anormalidades menores na orelha, dígitos longos e fendas palpebrais, fissuras labiopalatinas, cardiopatias congenitas, dificuldade de aprendizagem, atraso de linguagem e distúrbios comportamentais. A fissura oral foi à manifestação otorrinolaringológica mais frequente, presente em 75% dos pacientes, onde as fissuras submucosas foram as mais frequentes (43%). As características cognitivas como, atraso de fala (87%), dificuldades de aprendizagem (95%) e distúrbios comportamentais (81%), tiveram um resultado significativo, descritas em quase todos os indivíduos. As cardiopatias congênitas estavam presentes em 47,2% dos prontuários analisados. De um modo geral, comparando a frequência dos sinais clínicos encontrados neste trabalho com dados da literatura, constatamos que as frequências encontram-se dentro do esperado. Conclusão: A maioria dos indivíduos cadastrados no HRAC-USP, pertencentes ao grupo de estudo, apresentou idade superior a 06 anos. Portanto, a observação do curso natural da historia da SD22q11 para avaliar características fenotípicas que surgissem ao longo da evolução clinica do indivíduo e que pudessem ajudar no diagnóstico, ficou prejudicada. Mesmo nos casos onde o indivíduo foi cadastrado no HRAC-USP com idade inferior a dois anos, o diagnóstico foi tardio devido a falta de uma ação multidisciplinar e interdisciplinar no hospital. Mesmo não sendo possível avaliar as características fenotípicas surgidas durante a historia natural da doença, constatamos que as manifestações clínicas relatadas nos prontuários cursam com as características da SD22q11 e em frequências que corroboram com as da literatura / To describe clinical manifestations observed in medical records of individuals registered in the hospital with a diagnostic hypothesis of 22q11.2DS confirmed by genetic tests (MLPA OR FISH), since the first assessment in the HRAC-USP and during the follow up of these individuals in subsequent assessments, in order to achieve a better definition to the natural courses of the disease. Local: Laboratory of Human Genetics and Cytogenetics (HRAC-USP Bauru/SP). Methods: This retrospective study analyzed 72 medical records of individuals registered at the HRAC-USP, who were diagnosed with 22q11DS and who had this diagnosis confirmed by a genetic test (MLPA OR FISH). The assessment concerned the analysis of reported data in all sectors of the HRAC-USP. Results and Discussion: 72 medical records of individuals with 22q11DS were analyzed. It was verified that the average age of individuals when registering at the HRAC-USP was six years old. It was also verified that it took a long period of time for these individuals to return to the hospital and, when they did, not all specialties were contemplated. These facts harmed the analysis of the natural history of the anomaly. About the phenotypic characteristics, some typical clinical signs were observed, such as: long face, thin lips, hypoplasia nasal alar, minor abnormalities in the ear, long digits and narrow palpebral fissures, palatal abnormalities, congenital heart defects, learning disabilities, delay speech and behavioral disorders. An oral cleft was the most frequent otorhinolaryngology manifestation, present in 75% of the patients; among which submucous cleft palate were the most frequent (43%). Cognitive features such as, delay speech (87%), learning disabilities (95%) and behavioral disorders (81%) had a significant result, described in almost all individuals. Congenital heart defects were observed at 4% to 48% of individuals with 22q11.2DS, in this study it was observed in 47.2%. In general, comparing the frequency of some clinical signs observed in this study with the literature data, it was verified that the frequencies were within expectations. Conclusion: Most of the individuals registered at the HRAC belonging to the study group were over 6 years old. Therefore, the observation of natural course of the history of 22q11DS to evaluate the phenotypic characteristics that would arise during the clinical evolution of the individual and that could help in the diagnosis was harmed. Even in cases when the individual was registered at the HRAC-USPunder the age of two, the diagnosis was delayed due to lack of a multidisciplinary and interdisciplinary action in the hospital. Even not being possible to measure the phenotypic characteristics that emerged during the natural history of the disease, it was verified that the clinical manifestations reported in the records occur with the 22q11DS characteristics and in frequencies that corroborate with the literature

Introdução: A Holoprosencefalia (HPE) é uma malformação craniofacial decorrente de falhas no processo de formação do sistema nervoso durante o desenvolvimento embrionário. Sua etiologia é heterogênea e complexa, envolvendo fatores ambientais e genéticos. Estudos recentes sugerem que alterações subteloméricas possam ser um dos fatores etiológicos para o aparecimento da HPE. Objetivos: Investigar possíveis alterações (microdeleções/duplicações) nas regiões subteloméricas em indivíduos com diagnóstico de HPE. Metodologia: Avaliação genética de 25 amostras de DNA de indivíduos matriculados no HRAC-USP, com diagnóstico de HPE através da técnica de MLPA (Multiplex ligation-dependent probe amplification), segundo protocolo proposto por Schouten et al. (2002). Estes indivíduos já foram previamente triados para mutações/deleções nos genes candidatos à HPE (SHH, ZIC2, TGIF, GLI2 e PTCH1) através do sequenciamento direto de Sanger e da técnica de MLPA, sem resultado positivo para qualquer alteração. Resultados: Dentre os 25 indivíduos analisados, o fenótipo predominante foi a microforma da doença. Os principais achados clínicos da amostra estudada foram: hipotelorismo, microcefalia e fissura de lábio e palato (100%), nariz achatado (84%), presença de um incisivo central único (24%) e ponte nasal baixa (64%). Quatro pacientes apresentaram comprometimento no SNC (16%). Nenhum indivíduo apresentou quaisquer alterações, como microdeleções e/ou duplicações nos genes contidos nas regiões subteloméricas, através da análise pela técnica de MLPA. Dessa forma, estes permanecem sem diagnóstico genético definido. Discussão: A não detecção de alterações subteloméricas sugere que o fenótipo predominante na amostra, microforma, possa não apresentar alterações subteloméricas relacionadas ao aparecimento da doença. Entretanto, deve-se salientar que o universo amostral é relativamente pequeno, de forma que este possa não ser um exemplo fiel dos casos de microforma da HPE. Reforça-se, ainda, a grande variedade de fatores envolvidos no surgimento desta patologia, bem como o envolvimento de outros genes ainda não estabelecidos, além das causas ambientais, ainda não completamente elucidadas. Conclusões: Não foram encontradas alterações subteloméricas nos pacientes com diagnóstico de HPE estudados. A técnica de MLPA consiste em uma metodologia rápida, sensível, eficaz e de baixo custo, quando comparada a outras técnicas, sendo indicada para o uso em laboratórios de diagnóstico genético, uma vez que diversos estudos já mostraram que consiste em um método confiável de diagnóstico. Devido ao tamanho relativamente pequeno da amostra utilizada neste estudo, e os dados ainda inconsistentes da literatura atual, estudos adicionais são necessários para que seja possível a realização de um diagnóstico diferencial, explicando o amplo espectro fenotípico observado nesta doença, conforme sugerido pela hipótese dos múltiplos fatores. / Introduction: Holoprosencephaly (HPE), a craniofacial malformation, results from flaws in formation process of the nervous system during embryonic development. The etiology is heterogeneous and complex, involving environmental and genetic factors. Recent studies suggest that subtelomeric aberrations could be an etiological factor to the onset of HPE. Objectives: Investigate possible changes (microdeletions/duplications) in subtelomeric regions in individuals diagnosed with HPE. Methodology: Genetic evaluation of 25 DNA samples from individuals enrolled at HRAC-USP, diagnosed with HPE (performed by Syndromology Division HRAC/USP) by MLPA technique, as proposed by Schouten et al (2002). Patients were previously screened for mutations/deletions in HPE candidate genes (SHH ZIC2, TGIF, GLI2 and PTCH1) by direct Sanger sequencing and MLPA technique, without any match. Analyses were performed at the Laboratory of Molecular Genetics, Hospital for Rehabilitation of Craniofacial Anomalies, HRAC-USP. Results: Among the 25 individuals analyzed, the predominant phenotype was HPE microform. The main clinical findings of the study sample were: hypotelorism, microcephaly, and cleft lip/palate (100%); flat nose (84%); presence of a single central incisor (24%) and low nasal bridge (64%). Four patients had CNS commitment (16%). No subtelomeric mutations were found in our sample, such as microdeletions/duplications of genes analyzed by MLPA technique. Thus, they remain without defined genetic diagnosis. Discussion: Subtelomeric changes were not found, suggesting that the predominant sample phenotype, microform HPE, could not be related with subtelomeric changes associated to the disease outbreak. However, it should be noted that the sample universe is relatively small, so this may not be a true example of HPE microform cases. It should also be reinforced the wide variety of factors involved in the onset of this pathology, as well as the involvement of other genes not yet established and environmental causes, not completely understood. Conclusions: No subtelomeric mutations were found in the HPE individuals studied. MLPA technique consists in a rapid, sensitive and cost effective methodology, when compared to other techniques being suitable for use in genetic diagnostic laboratories, since several studies have shown that consists of a reliable method of diagnosis. Due to the relatively small sample size used in this study, and even inconsistent data in literature, further studies are needed to make it possible to perform a differential diagnosis, explaining the wide phenotypic spectrum observed in this disease, as suggested by the multiple hit hypothesis.