Introdução. Danos no DNA mitocondrial (DNAmt) têm sido descritos em pacientes com doença renal crônica (DRC). Estes danos podem ser avaliados através da deleção 4977pb do DNAmt em diversos tecidos. Métodos. Identificamos a prevalência da deleção 4977pb do DNAmt através da técnica da reação em cadeia da polimerase (PCR) no sangue de pacientes com DRC em tratamento conservador (creatinina >2mg/dl) ou submetidos a hemodiálise. Resultados. A freqüência da ocorrência da deleção do DNAmt foi de 73.1% (38/52) nos pacientes com DRC submetidos a hemodiálise, 57.1% (27/42) nos pacientes com DRC em tratamento conservador e 27.8% (15/54) nos controles (P< 0.001). Não encontramos aumento da freqüência desta deleção em relação a idade dos pacientes com DRC (P= 0.54) ou ao tempo de diálise (P= 0.70). Conclusão. Danos no DNAmt podem ser induzidos pela DRC em especial nos pacientes submetidos a hemodiálise. Desta forma, a deleção 4977pb do DNAmt pode servir como um marcador de danos moleculares em pacientes com DRC. / Background. Damage to mitochondrial DNA (mtDNA) has been described in patients with chronic renal disease (CRD). The presence of mtDNA 4977bp deletion in many different tissues can serve as a marker of this damage. Methods. Polymerase chain reaction techniques (PCR) were used to identify the prevalence of 4977bp deletion in mtDNA from the blood of hemodialysis patients or patients with CRD receiving conservative treatment. Results. The frequency of 4977bp deletion in mtDNA was 73.1% (38/52) in patients undergoing hemodialysis, 57.1% (27/42) in patients with CRD receiving conservative treatment and 27.8% (15/54) in control samples (P< 0.001). Higher frequencies of this mutation were not associated with patient age (P= 0.54) or time on dialysis (P= 0.70). Conclusion. Damage to mtDNA can be induced in CRD, especially in patients undergoing dialysis. Thus, mtDNA with 4977bp deletion can serve as a marker of molecular damage in patients with CRD.

Introdução: Durante as últimas décadas, a utilização de métodos moleculares como Hibridizacão in situ por fluorescência (FISH) e Hibridização Genômica Comparativa (array-CGH) mudou dramaticamente a perspectiva em relação à detecção de rearranjos genômicos submicroscópicos. O número de doenças identificadas como causada por microdeleções/microduplicações cromossômicas aumentou rapidamente, trazendo um papel crucial para a citogenética no diagnóstico destas condições. Objetivo: O objetivo deste estudo foi identificar e caracterizar microdeleções cromossômicas associadas a síndromes de malformações em um laboratório de citogenética de referência de um hospital público do sul do Brasil. Métodos: Estudo retrospectivo e prospectivo, em uma série consecutiva de amostras. O estudo foi baseado em registros hospitalares e laboratoriais de amostras de uma coorte de pacientes com suspeita clínica de microdeleção cromossômica. Foram selecionadas amostras de indivíduos em que o diagnóstico clínico proposto incluia uma suspeita de rearranjo nos cromossomos 4p16.3, 5p15.2, 5q35, 7q11.23, 8q24.12, 15q11-q12, 16p13.3, 17p13.3, 17p11. 2,2 e 22q11 que foram analisados por hibridização in situ por fluorescência (FISH). Em 11 amostras com microdeleções, hibridização genômica comparativa (array-CGH) foi realizada. Resultados: Um total de 504 amostras foram avaliadas, sendo as suspeitas mais comuns a deleção 22q11.2 (29,5%), a síndrome de Prader-Willi (21,6%), a síndrome de Williams-Beuren (15%) e da síndrome de Angelman (13 %). Em 120 deles (23,8%) desequilíbrios cromossómicas relacionadas com o diagnóstico clínico foram encontrados. A del7q11.23 foi a alteração mais frequente (8,5%) detectada, seguida por del22q11.2 (5,3%) e del15q11-q12 (4,5%). Conclusões: Nossos achados reforçam à estratégia de que um teste de citogenética molecular sensível associada com uma avaliação clínico qualificado são cruciais para a detecção e caracterização precisa de deleções cromossômicas submicroscópicas. Além disso, nosso estudo enfatiza a necessidade de educação continuada para o desenvolvimento e utilização de novas tecnologias para o diagnóstico citogenético, as quais, em nossa experiência, puderam ser introduzidas com sucesso em um hospital público do sul do Brasil. / Background: During the past decades, the widespread use of FISH and microarray-based technologies dramatically changed our perspective regarding detection of submicroscopic genomic rearrangements. The number of diseases identified as caused by chromosomal microdeletions/microduplications increased quickly, bringing a new and crucial role for cytogenetics in the diagnosis of these conditions. Objective: The purpose of this study was to identify and chraracterize chromosomal microdeletions associated with malformation syndromes in a reference cytogenetics laboratory from a public hospital of Southern Brazil. Methods: Using retrospective and prospective approaches, we evaluated a consecutive series of samples. The study was based in hospital and laboratorial records of samples from a cohort of subjects with clinical suspicion of a chromosomal microdeletion. We selected samples from subjects in whom a clinical diagnosis was proposed, which included deletion of chromosomes 4p16.3, 5p15.2, 5q35, 7q11.23, 8q24.12, 15q11-q12, 16p13.3, 17p13.3, 17p11.2,2 and 22q11 identified by fluorescence in situ hybridization (FISH) analysis. In 11 samples with microdeletions, array-based comparative genomic hybridization (array-CGH) was performed. Results: A total of 504 samples were evaluated, being the most common suspicions the 22q11.2 deletion (29.5%), the Prader-Willi syndrome (21.6%), the Williams-Beuren syndrome (15%) and the Angelman syndrome (13%). In 120 of them (23.8%) chromosomal imbalances related to the clinical diagnosis were found. The deletion 7q11.23 was the most frequently finding (8.5%), followed by del22q11.2 (5.3%) and del15q11-q12 (4.5%). Conclusions: Our findings provide support to the idea that a sensitive molecular cytogenetic test associated with a qualified clinical evaluation are crucial for the detection and precise characterization of submiscroscopic chromosome deletions. Additionally, our study emphasizes the need of continuing 6 education for the improvement of the cytogenetic diagnosis technology, which was successfully introduced in a public hospital of Southern Brazil.

A síndrome de Sotos (MIM 117550) é caracterizada pelo crescimento pré e pós-natal acelerado, fácies típica com testa proeminente, hipertelorismo, estrabismo, fissura palpebral antimongolóide, as orelhas grandes, o palato alto e estreito, mãos e pés grandes e possibilidade de erupção prematura dos dentes. É também freqüentemente associada com anomalias cerebrais, cardiovasculares e urinárias, e, ocasionalmente, é acompanhado por lesões malignas, como tumor de Wilms e hepatocarcinoma. Com o avanço da idade, a face gradualmente se alonga, o queixo fica mais proeminente, a altura chega próxima ao normal e a macrocefalia não é mais pronunciada. A casuística total foi de 65 pacientes com suspeita de diagnóstico clínico da síndrome de Sotos. Esses 65 pacientes foram testados por MLPA com o Kit Salsa P026B e três deleções foram encontradas: deleção total do gene FGFR4 e regiões flanqueadas, incluindo o gene FGFR4 e dois casos de deleções parciais do gene, uma com os exons 13 e 14 deletados, e outra com deleção desde o gene FGFR4 até o exon 17 do gene FGFR4, todas \"de novo\". Na nossa amostra a freqüência de deleções foi de cerca de 5%, semelhante à observada nas populações nãojaponesas. Os pacientes com as deleções apresentam a \"fácies típica\" com abaulamento frontal, o queixo proeminente, a implantação frontal do cabelo alta; a macrocefalia, a dolicocefalia, as mãos grandes; a hipotonia neonatal e a icterícia neonatal também estão presentes nos três pacientes. Entretanto, os três pacientes nasceram com o comprimento e o peso dentro dos padrões de normalidade e não acima do percentil 97 como descrito para a Sos. Para a pesquisa de mutações no gene FGFR4, foram selecionados trinta pacientes com \"fácies típica\" da síndrome de Sotos e macrocefalia. O seqüenciamento até o momento foi realizado em quatro pares de \"primers\" referentes ao exon 5 do gene FGFR4. Dois SNPs foram encontrados, um no fragmento 5B e um no fragmento 5D. Os dois SNPs ocorreram por uma substituição da base nitrogenada C-> T e são substituições sinônimas. A comparação do estudo de Tatton-Brown, et al, (2005b) que analisou as características clínicas e comportamentais de 266 pacientes com síndrome de Sotos, cujo mecanismo genético foi desvendado, com a nossa amostra de 30 pacientes nos permitiu sugerir como critérios mínimos para o diagnóstico clínico da síndrome de Sotos a \"fácies típica\" (abaulamento frontal, testa proeminente, hipertelorismo, estrabismo, fissura palpebral antimongolóide) e a macrocefalia. As alterações no gene FGFR4 (microdeleções e mutações) são essencialmente específicas para a síndrome de Sotos e, por isso, o diagnóstico genético para qualquer caso em que haja alteração do gene FGFR4, é o de síndrome de Sotos. / Sotos syndrome (MIM 117550) is autosomal dominant condition characterized by prenatal and postnatal overgrowth, macrocephaly and a typical facial gestalt with frontal bossing, hypertelorism, antimongoloid slant of the palpebral fissures, prominent jaw, large ears, high and narrow palate and large hands and feet. The syndrome is also frequently associated with brain, cardiovascular, and urinary anomalies and is occasionally accompanied by malignant lesions such Wilms tumour and hepatocarcinoma. FGFR4 microdeletions were investigated in sixty five patients with clinical diagnosis of Sotos syndrome by multiplex ligation dependent probe amplification ( MLPA, Kit Salsa P026B). We identified one patient with a total deletion of FGFR4 and FGFR4, one with FGFR4 exon13-14 deletion and another with a deletion that included FGFR4 and FGFR4 exon1-17. All deletions were \"de novo\". In our sample, the frequency of deletions was ~5%, similar to that found in non-Japanese populations. The clinical features of the three patients with microdeletions are: the typical facial gestalt with frontal bossing, prominent jaw and high anterior hairline; macrocephaly, dolichocephaly, large hands; neonatal hypotonia and jaundice. However, those three patients presented normal length and weight at birth. Clinical and behavioral features of 30 patients presenting a typical facial gestalt and macrocephaly, cardinal characteristics of Sotos syndrome were described. The comparison of the clinical and behavioral features to those described for 266 patients with a genetic diagnosis of Sotos syndrome indicates that a high clinical suspition of Sotos syndrome includes the typical facial gestalt (frontal bossing, hipertelorism, strabismus, prominent jaw, antimongoloid slant of the palpebral fissures) and macrocephaly. Other features associated with Sotos syndrome, such as overgrowth, learning disability, behavioral problems confirms the clinical diagnosis. FGFR4 microdeletion investigations detects only 5% of the Brazilian patients with Sotos syndrome. Screening for intragenic FGFR4 mutations may not be necessary in classic Sotos syndrome cases. However, identification of an FGFR4 abnormality is diagnostic of Sotos syndrome.

Introdução. Danos no DNA mitocondrial (DNAmt) têm sido descritos em pacientes com doença renal crônica (DRC). Estes danos podem ser avaliados através da deleção 4977pb do DNAmt em diversos tecidos. Métodos. Identificamos a prevalência da deleção 4977pb do DNAmt através da técnica da reação em cadeia da polimerase (PCR) no sangue de pacientes com DRC em tratamento conservador (creatinina >2mg/dl) ou submetidos a hemodiálise. Resultados. A freqüência da ocorrência da deleção do DNAmt foi de 73.1% (38/52) nos pacientes com DRC submetidos a hemodiálise, 57.1% (27/42) nos pacientes com DRC em tratamento conservador e 27.8% (15/54) nos controles (P< 0.001). Não encontramos aumento da freqüência desta deleção em relação a idade dos pacientes com DRC (P= 0.54) ou ao tempo de diálise (P= 0.70). Conclusão. Danos no DNAmt podem ser induzidos pela DRC em especial nos pacientes submetidos a hemodiálise. Desta forma, a deleção 4977pb do DNAmt pode servir como um marcador de danos moleculares em pacientes com DRC. / Background. Damage to mitochondrial DNA (mtDNA) has been described in patients with chronic renal disease (CRD). The presence of mtDNA 4977bp deletion in many different tissues can serve as a marker of this damage. Methods. Polymerase chain reaction techniques (PCR) were used to identify the prevalence of 4977bp deletion in mtDNA from the blood of hemodialysis patients or patients with CRD receiving conservative treatment. Results. The frequency of 4977bp deletion in mtDNA was 73.1% (38/52) in patients undergoing hemodialysis, 57.1% (27/42) in patients with CRD receiving conservative treatment and 27.8% (15/54) in control samples (P< 0.001). Higher frequencies of this mutation were not associated with patient age (P= 0.54) or time on dialysis (P= 0.70). Conclusion. Damage to mtDNA can be induced in CRD, especially in patients undergoing dialysis. Thus, mtDNA with 4977bp deletion can serve as a marker of molecular damage in patients with CRD.

Submitted by Erika Demachki (erikademachki@gmail.com) on 2017-05-18T19:09:17Z No. of bitstreams: 2 Tese - Marcela Suriani Ribeiro - 2017.pdf: 1795199 bytes, checksum: fb63e9f789cfefb42f31cba029a29f4f (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Approved for entry into archive by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2017-05-19T10:43:53Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Tese - Marcela Suriani Ribeiro - 2017.pdf: 1795199 bytes, checksum: fb63e9f789cfefb42f31cba029a29f4f (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Made available in DSpace on 2017-05-19T10:43:53Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Tese - Marcela Suriani Ribeiro - 2017.pdf: 1795199 bytes, checksum: fb63e9f789cfefb42f31cba029a29f4f (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Previous issue date: 2017-04-28 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / The genus Trichoderma includes species that have the ability to antagonize plant pathogens in a complex process ranging from antibiosis, competition for nutrients, mycoparasitism and induction of defense mechanisms in plants or a combination of these. Trichoderma species are known for their ability to produce lytic enzymes such as exoglucanases, endoglucanases, chitinases, and proteases that is essential for phytopathogen cell wall degradation. In the development and differentiation processes of Trichoderma, β-glucanases contributes significantly to the morphogenetic-morphological process that lead to the presence of β-glucans as the main component of fungi wall. In this work, we studied the functional role of the gluc31 gene that encodes an endo β-1,3-glucanase of the GH16 family of Trichoderma harzianum ALL42 through the deletion of this gene. This study demonstrated that the absence of Δgluc31 gene did not affect the in vivo mycoparasitism ability of the mutant T. harzianum ALL42, however the involvement of this gene in cell wall remodeling and synthesis were demonstrated. In the absence of the gluc31 gene, a higher deposition of chitin polymers on the cell wall of the mutant hyphae was observed. The absence of the gluc31 gene in T. harzianum also demonstrated an effect on the expression of other genes belonging to the family 16 of glycosyl hydrolases, due to the function redundancy found among the glucanases. / O gênero Trichoderma inclui espécies que possuem habilidade de antagonizar patógenos de plantas em um processo complexo que vão desde antibiose, competição por nutrientes, micoparasitismo, indução de mecanismos de defesa em plantas ou ainda uma combinação desses. Espécies de Trichoderma são conhecidas por sua capacidade de produzir enzimas líticas tais como exoglucanases, endoglucanases, quitinases e proteases que desempenham papéis importantes na degradação da parede de fitopatógenos. Nos processos de desenvolvimento e diferenciação de Trichoderma, as β-glucanases contribuem de forma significativa no processo morfogenéticomorfolítico uma vez que a β-glucanas é o componente principal da sua parede. Nesse trabalho, realizou-se o estudo do papel funcional do gene gluc31 que codifica uma endo β-1,3-glucanase da família GH16 de Trichoderma harzianum ALL42, através da deleção deste gene. Observamos que a ausência do gene gluc31 não afetou a capacidade de micoparasitismo, in vitro, da espécie mutante de T. harzianum ALL42, entretanto, o envolvimento deste gene na síntese e remodelamento da parede celular foi demonstrado. Na ausência do gene gluc31, uma maior quantidade de polímero de quitina na parede celular das hifas da linhagem mutante Δgluc31 foi observado. A ausência do gene gluc31 em T. harzianum demonstrou ainda um efeito sobre a expressão dos outros genes pertencentes à família 16 de glicosil hidrolases em ensaios de RT-qPCR, devido a redundância de função entre as glucanases.

Submitted by Neusa Fagundes (neusa.fagundes@unioeste.br) on 2018-03-05T19:50:05Z No. of bitstreams: 2 Debora_Dudek2017.pdf: 1099947 bytes, checksum: eb7356b2bdfdfe7d3d4da8e48d12d05c (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Made available in DSpace on 2018-03-05T19:50:05Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Debora_Dudek2017.pdf: 1099947 bytes, checksum: eb7356b2bdfdfe7d3d4da8e48d12d05c (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Previous issue date: 2017-02-07 / Conselho Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento Científico e Tecnológico - CNPq / Second generation bioethanol employs lignocellulosic materials in its preparation. One of the steps for these materials degradation utilizes cellulases produced by microorganisms. Among these, Trichoderma reesei fungus is one of the main cellulases producers used in industry. This fungus genetic modification can lead to enzimes production optimization, reducing cost and improving biofuels manufacture. Thus, the present work objective was delete the sequence encoding zinc fingers motifs of cellulase ACE1repressor transcription factor from T. reesei RUT-C30 fungus, seeking enzymatic production optimization. In primers construction for amplification ACE1 regions 5’ and 3' and the hph selection marker, which confers hygromycin B resistance, Joint Genome Institute - JGI site and the BioEdit ® program were used. The deletion cassette with pRS426 vector construction was mediated by Saccharomyces cerevisiae SC9721 yeast. After the cassette construction, T. reesei RUT-C30 transformation was made by protoplast and this transformation confirmation was effected by part of the hph using hphNestF and hphNestR amplification primers. After transformation with mutants obtained, endoglucanase, exoglucanase and total cellulase activity was quantified with carboxymethylcellulose substrates (CMC), microcrystalline cellulose (Avicel®) and Whatman paper filter (PF), respectively. The enzymatic production and biomass hydrolysis efficiency were performed comparing RUT-C30 strain for mutants. After deletion cassette construction, a 3501 bp fragment amplification confirmed the cassette formation. Posteriorly, RUT-C30 strain transformation, a 989 bp amplification was observed, confirming the 3 mutants target sequence deletion. With cellulase activity assay, 3 transformed strain showed higher enzymatic production when compared to RUT-C30 strain. In this comparison, a significant statistical difference was observed of RUT-C30Δace1-1 strain with Avicel® and PF (p <0.001) CMC (p <0.01), RUT-C30Δace1-2 strain with CMC (p<0,01) e PF (p<0,05), and RUT-C30Δace1-3 strain with Avicel (p<0,001), CMC and PF (p<0,01). The mutants also showed greater efficiency in biomass hydrolysis, with release sugar increase between 21 and 42%. Based on this study, mutants are promising for most efficient and viable ethanol production. Nevertheless, additional tests must be carried out to better understand these fungi applicability in the industrial level. / O bioetanol de segunda geração emprega materiais lignocelulósicos na sua elaboração. Uma das etapas para a degradação destes materiais utiliza celulases produzidas por microrganismos. Dentre estes, o fungo Trichoderma reesei é um dos principais produtores de celulases utilizadas na indústria. A modificação genética deste fungo pode levar à otimização da produção de suas enzimas, diminuindo o custo e melhorando a fabricação de biocombustíveis. Desta forma, o objetivo do trabalho foi deletar a região dos motivos dedos de zinco no gene que codifica o fator de transcrição repressor de celulase ACE1 do fungo T. reesei RUT-C30, buscando a otimização na produção enzimática. Na construção dos primers para amplificação das regiões 5’ e 3’ de ace1 e do marcador de seleção hph, que confere resistência à higromicina B, utilizou-se o site Joint Genome Institute – JGI e o programa BioEdit®. A construção do cassete de deleção com o vetor pRS426 foi mediado pela levedura Saccharomyces cerevisiae SC9721. Posteriormente, a construção do cassete, a transformação de T. reesei RUT-C30 foi realizada através de protoplasto e a confirmação desta transformação foi efetuada por amplificação de parte do hph utilizando os primers hphNestF e hphNestR. Após a transformação, com os mutantes obtidos, a atividade de endoglucanase, exoglucanase e celulase total foi quantificada com os substratos carboximetilcelulose (CMC), celulose microcristalina (Avicel®) e papel de filtro Whatman (PF), respectivamente. A produção enzimática e a eficiência na hidrólise da biomassa foram realizadas comparando-se a linhagem RUT-C30 aos mutantes. Após a construção do cassete de deleção, a amplificação de um fragmento de 3501 pb confirmou a formação do cassete. E, posteriormente à transformação da linhagem RUT-C30, o amplificado de 989 pb foi observado, confirmando a deleção da sequência alvo em 3 mutantes. Com o ensaio de atividade de celulases, as 3 linhagens transformadas mostraram maior produção enzimática quando comparadas à linhagem RUT-C30. Nessa comparação, foi observada diferença estatística significativa da linhagem RUT-C30Δace1-1 com Avicel® e PF (p<0,001), da linhagem RUTC30Δace1- 2 com CMC (p<0,01) e PF (p<0,05) e da linhagem RUT-C30Δace1-3 com Avicel (p<0,001), CMC e PF (p<0,01). Os mutantes também apresentaram maior eficiência na hidrólise da biomassa, com aumento na liberação de açúcar entre 21 e 42%. Com base nos dados deste estudo, os mutantes apresentam-se promissores para a produção mais eficiente e viável de etanol. Apesar disso, testes adicionais devem ser realizados para melhor entendimento da aplicabilidade destes fungos a nível industrial.

Objetivo: Investigar a presença de alterações (deleção e/ou duplicação) na região 22q11 em indivíduos até 02 anos de idade com fissura de palato, com o intuito de realizar diagnóstico precoce da síndrome da deleção 22q11 (SD22q11). Local: Laboratório de Genética e Citogenética Humana, HRAC/USP, Bauru-SP. Casuística e metodologia: Foram selecionados 55 indivíduos, de ambos os sexos, com idade até 2 anos e com fissura de palato, cadastrados e em tratamento no Hospital de Reabilitação de Anomalias Craniofaciais/USP. Todos os indivíduos foram analisados utilizando citogenética convencional por bandamento G e pela técnica de MLPA. Resultados e discussão: Foram analisados 55 indivíduos, dos quais 46 apresentaram fissura de palato isolada, 6 apresentaram fissura de palato e cardiopatia, 1 fissura de palato e atraso no desenvolvimento neuropsicomotor, 1 caso apresentou fissura de palato submucosa e 1 caso com fissura de palato submucosa e atraso no desenvolvimento neuropsicomotor. Não foram observadas anomalias cromossômicas numéricas ou estruturais por meio da análise citogenética. Embora não tenhamos encontrado nenhuma alteração, a análise citogenética inicial foi importante para detectar possíveis alterações em outras regiões cromossômicas que pudessem resultar em um fenótipo semelhante ao da SD22q11. Também não foram detectadas deleção ou duplicação na região 22q11 pela técnica de MLPA, a qual se mostrou um método rápido, sensível, eficaz e com um custo relativamente baixo em comparação a outras técnicas, para a investigação de alterações na região 22q11. Nossos resultados, associados aos da literatura, demonstram que a prevalência da deleção 22q11 nos casos de fissura de palato isolada é muito baixa. Mesmo sendo considerada como sugestiva da SD22q11, não detectamos nenhuma alteração na região 22q11 nos 6 indivíduos com cardiopatia. Somente foi possível identificar atraso no desenvolvimento em 2 indivíduos, ambos com dois anos de idade. Isso demonstra a dificuldade de realizar diagnóstico em idade precoce. Conclusão: O teste de rotina para investigação da deleção/duplicação da região 22q11 não se justifica em crianças com idade até dois anos que apresentam fissura de palato como principal achado clínico. Esses indivíduos devem ter um acompanhamento clínico criterioso, porque um comprometimento comportamental ou mental, bem como as características dismórficas da SD22q11 podem evoluir com o tempo. Devido ao tamanho relativamente pequeno desse estudo, e os dados inconsistentes da literatura atual, mais estudos são necessários para estabelecer critérios para indicação da rotina de investigação de deleção/duplicação 22q11 em indivíduos com anomalias palatinas. / Purpose: To investigate alterations (deletions/duplications) in the 22q11 region in individuals with cleft palate aged 0-2 years, in order to perform early diagnosis of 22q11 deletion syndrome (SD22q11). Local: Genetics and Human Cytogenetics Laboratory, HRAC/USP, Bauru-SP. Methods: We selected 55 individuals with cleft palate, both genders, registered and in treatment at Hospital de Reabilitação de Anomalias Craniofaciais/USP. All individuals were investigated by cytogenetics and MLPA techniques. Results and Discussion: 46 out of 55 individuals, presented isolated cleft palate, 6 cleft palate and heart malformations, 1 cleft palate and developmental delay, 1 submucous cleft, and 1 submucous cleft and developmental delay. G karyotype did not show any chromosomal abnormalities. Although we did not detect any alterations, the initial cytogenetics analysis was important to exclude alteration in other chromosomal region that could result in a similar phenotype. Deletion or duplication in 22q11 region by MLPA was not detected, which shown to be a rapid, sensitive, and low cost method in comparison with other methods to investigate 22q11 region. Results, associated with the literature, have shown that the prevalence of the 22q11 alteration is very low in cleft palate. The presence of heart malformation is suggestive of 22q11DS. Besides, there were no alterations in 22q11 region in 6 patients with cleft palate and heart malformations. We were able to identify developmental delay in only 2 individual, both aged 2 years which demonstrates the difficulty of making early diagnosis. Conclusion: There is no justification for routine screening for 22q11 region deletion/duplication in children aged 0-2 years with cleft palate as main feature. These individuals should be carefully followed because behavioral or mentalimpairments as well as dysmorphic features characteristic of 22q11DS may evolve with time.

A infertilidade é um problema de saúde pública com um significativo impacto social, econômico e psicológico. Em todo o mundo, a incidência da infertilidade entre a população geral é estimada em 10-15%. Cerca de 50% da infertilidade dos casais são de origem masculina. Em mais da metade dos homens inférteis, a causa da infertilidade é desconhecida (idiopática). Etiologicamente, a infertilidade masculina apresenta causas genéticas e não genéticas. Dentre as causas genéticas mais conhecidas temos mutação do receptor de andrógenos, mutação do gene regulador da condutibilidade transmembrana da fibrose cística (CFTR), anomalias cromossômicas clássicas, anomalias meióticas, microdeleções do cromossomo Y, etc. As anomalias cromossômicas são encontradas com muito mais frequência em homens inférteis, com uma incidência de 4-16% em relação à incidência de 0,4% na população fértil. Estudos mostram que as CNVs também podem estar relacionadas com a infertilidade masculina, especificamente com a falha na espermatogênese. CNVs encontradas tanto no cromossomo Y quanto nos cromossomos autossômicos também foram associadas a possíveis falhas na espermatogênese. Um outro fator que também pode estar envolvido com a infertilidade masculina é a expressão desregulada dos miRNAs. O presente trabalho teve como objetivo promover a análise em larga escala da distribuição de CNVs e do perfil transcricional dos miRNAs em amostras de biopsias testiculares de paciente com azoospermia. Para o estudo das CNVs nós utilizamos a metodologia do CytoScan HDTM da Affymetrix. O perfil transcricional de miRNAs nos indivíduos estudados foi avaliado por meio da tecnologia de microarranjos também da plataforma Affymetrix. Para estas analises montamos dois grupos de estudo (Parada de Maturação (MA) de Células Germinativas e Síndrome de Células Sertoli Only (SCOS)) e um grupo controle (azoospermia obstrutiva e espermatogênese normal). Através das análises das CNVs nós encontramos 94 CNVs nos cromossomos autossômicos e sexuais, 35 (37%) CNVs foram classificadas como benignas, 24 (23%) como potencialmente benignas, sete CNVs (7,4%) como patogênicas e sete foram classificadas como potencialmente patogênica. Todas as CNVs classificadas como patogênica estão presentes no cromossomo Y, cinco CNVs são do tipo duplicação e duas do tipo deleção. A CNV do tipo duplicação foi encontrada no paciente MA e a CNV do tipo deleção foi encontrada no paciente SCOS. As CNVs se sobrepõem e quando analisadas em conjunto (formando uma única CNV de cada condição) elas apresentam um tamanho parecido. Estas CNVs apresentam genes envolvidos na espermatogênese. As CNVs classificadas como potencialmente patogênicas estavam presentes nos cromossomos autossômicos e cromossomo X. Nestas CNVs estavam presentes genes que foram associados com a falha na espermatogênese. A análise da expressão dos miRNAs revelou um perfil transicional muito mais alterado nos pacientes com SCOS. As duas condições apresentaram miRNAs exclusivos, mas também compartilharam: 30 miRNAs. Nós identificamos duas famílias de miRNAs (miR449 e miR34) diferencialmente expressos nas duas condições e que apresentam expressão preferencial no testículo. Nossos resultados mostram que alterações no número de copias (CNVs) no cromossomo Y levam a infertilidade masculina e CNVs nos cromossomos autossômicos e X podem levar a infertilidade masculina. As alterações do tipo deleção podem levar a uma falha na espermatogênese maior que as alterações do tipo duplicação. A expressão diferencial dos miRNAs em tecido testicular de pacientes com diferenças histopatológicas (SCOS e MA) apresentam um padrão de expressão de miRNAs diferentes devido ao tipo de células germinativas que eles apresentam no tecido epitelial do testículo. / Infertility is a public health problem with significant social, economic and psychological impact. Worldwide, the incidence of infertility in the general population is estimated at 10- 15%. Approximately 50% of infertility of couples is of male origin. In more than half of infertile men, the cause of infertility is unknown (idiopathic). Etiologically, male infertility has genetic and non-genetic causes. Among the best known genetic causes we found the mutation of the androgen receptor, the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR), classic chromosomal abnormalities, meiotic abnormalities and microdeletions of the Y chromosome. Chromosomal abnormalities are found much more frequently in infertile men, with an incidence of 4-16% in the incidence of 0.4% in the fertile population. Studies show that CNVs can also be related to male infertility, specifically in the failure of spermatogenesis. CNVs found in both the Y and autosomes chromosomes were also associated with possible failures in spermatogenesis. Another factor that may also be involved in male infertility is the deregulated expression of miRNAs. This work aimed to promote the analysis of large-scale distribution of CNVs and the transcriptional profile of miRNAs in testicular biopsy samples from patients with azoospermia. For the study of CNV we used the CytoScan HDTM Affymetrix methodology and the transcriptional profile of miRNAs in the samples was assessed by means of microarray technology from Affymetrix platform. For these analyzes we set up two study groups (Stop Maturation (MA) of Germ Cells and Sertoli Cell Only Syndrome (SCOS)) and compared them to a control group (obstructive azoospermia, normal spermatogenesis). Through analysis of CNVs, we found 94 CNVs in sexual and autosomes chromosomes, 35 (37%) were classified as benign CNVs, 24 (23%) as a potentially benign seven CNVs (7.4%) as pathogenic and 7 were classified as potentially pathogenic. All CNVs classified as pathogenic are present on the Y chromosome, five CNVs are of duplication type and two are deletion type. The duplication type CNV was found in MA patients and deletion type CNV was found in SCOS patient. We identified that CNVs overlap and when analyzed jointed - as a single CNV of each condition - they have a similar size. These CNVs have genes involved in spermatogenesis. CNVs classified as potentially pathogenic were present in autosomes and in the X chromosome. In these CNVs were present genes that were associated with failure in spermatogenesis. The analysis of the expression of miRNAs revealed a transitional profile much more altered in patients with SCOS. The two conditions presented exclusive miRNAs, but shared 30 miRNAs differentially expressed when compared to the control group. We identify two families of miRNAs (miR449 and miR34) which exhibit preferential expression in testis as differentially expressed in both conditions. Our results show that changes in the number of copies (CNVs) on the Y chromosome lead to male infertility and CNVs in autosomes and X chromosomes may lead to male infertility. The deletion type changes can lead to a failure of spermatogenesis greater than the duplication type changes. The differential expression of miRNAs in patients with testicular tissue histopathologic differences (SCOS and MA) has a different pattern of miRNA expression due to the type of germ cells they present in epithelial tissue of the testis.

Orientador: Marcelo Brocchi / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-27T16:38:13Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Neves_MeirieledaSilvadas_M.pdf: 2620199 bytes, checksum: 70b2df72cfdb93196c91a87c813e12e9 (MD5) Previous issue date: 2015 / Resumo: O gênero Salmonella pertence à família Enterobacteriaceae que agrupa bacilos Gram-negativos, anaeróbios facultativos, fermentadores e geralmente flagelados. S. enterica é um dos patógenos de origem alimentar mais prevalente, sendo que infecções causadas por essa bactéria podem estar relacionadas a praticamente todos os tipos de alimentos. O trabalho foi proposto com o intuito de realizar a caracterização fenotípica e molecular de linhagens atenuadas de Salmonella enterica Typhimurium para genes codificadores de proteínas associadas ao nucleóide (NAPs Nucleoid associated Proteins). As características fenótipicas dos mutantes nulos de Salmonella enterica para os genes ihfA ou ihfB, codificadores das subunidades A e B de IHF, foram avaliadas através de crescimento in vitro, motilidade, sobrevivência frente ao estresse nutricional (sobrevivência em fase estacionária), sob condições ácidas, na presença de sais biliares e quanto à capacidade de invasão e sobrevivência em macrófagos (linhagem J774A.1). Testes de confirmação da atenuação e avaliação da capacidade de induzir proteção em caso de infecção por S. enterica foram realizados utilizando o modelo murino. Os mutantes não apresentaram diferença no crescimento in vitro e na capacidade de sobreviver na presença de sais biliares em comparação com a linhagem selvagem. As linhagens mutantes para os genes ihfA ou ihf ihf ihfB) apresentaram uma menor capacidade de sobrevivência sob condições ácidas quando comparadas com a linhagem selvagem. A motilidade dos mutantes simples também foi reduzida. Os mutantes simples e duplo apresentaram maior capacidade de sobreviver sob estresse nutricional quando comparados com a linhagem selvagem. O mutante para o gene ihfA e o duplo mutante apresentaram um aumento na capacidade de invadir macrófagos. ihf ihfB mostraram uma capacidade aumentada em sobreviver no interior de macrófagos quando comparadas com a linhagem selvagem. Os mutantes nulos viii de Salmonella enterica para os genes ihfA ou ihfB apresentam atenuação, em diferentes graus, quanto à virulência e apresentaram capacidade de induzir proteção no modelo murino de infecção por S. enterica. Esses resultados demonstram que essa proteína apresenta função relacionada com a virulência bacteriana, sendo um importante alvo de estudo na busca de linhagens atenuadas / Abstract: The genus Salmonella belongs to the Enterobacteriaceae family that comprises Gram-negative bacillus, facultative anaerobe, fermenting and generally flagellate. S. enterica is one of the most prevalent food-borne pathogen, and infections caused by this bacterium can be associated to almost all types of food. The work was proposed with the purpose of performing phenotypic and molecular characterization of attenuated strains of Salmonella enterica Typhimurium for genes encoding proteins associated with the nucleoid (NAPs - Nucleoid associated Proteins). The phenotypic characteristics of the null mutants of Salmonella enterica for genes ihfA or ihfB, encoding the A and B subunits of IHF, were evaluated by in vitro growth, motility, survival under nutritional stress (survival in the stationary phase), under acidic conditions, in the presence of bile salts and for the ability of invasion and survival in macrophages (J774A.1 strain). Attenuation tests and evaluation of the capacity to induce protection in case of infection by S. enterica were performed using the murine model. The mutants showed no difference in the in vitro growth and the ability to survive in the presence of bile salts in comparison with the wild type strain. The single mutant for ihfA or ihf ihf ihfB) showed decreased survival under acidic conditions when compared to the wild type strain. Motility of single mutants was also reduced. Single and double mutants showed higher ability to survive under nutritional stress when compared with the wild type strain. The mutant gene for ihfA and the double mutant showed an increased ability to invade ihf ihfB mutants showed an increased ability to survive within macrophages when compared with the wild type strain. Null mutants of Salmonella enterica for ihfA or ihfB genes exhibited attenuation, to varying degrees, for virulence and showed ability to induce protection in a murine model of infection by S. enterica. x These results demonstrate that this protein has function associated to bacterial virulence and is an important subject of study in search for attenuated strains / Mestrado / Genetica de Microorganismos / Mestra em Genética e Biologia Molecular

INTRODUÇÃO: Os defeitos cardíacos congênitos (DCC) são um grupo de anormalidades estruturais mais prevalentes ao nascimento e uma das principais causas de morbidade e mortalidade infantil. Os fatores genéticos são importantes na etiologia dos DCC. Estudos têm mostrado a contribuição da variação no número de cópias (CNV) na gênese das malformações cardíacas. A deleção 22q11.2 é a causa mais comum de microdeleção humana e está relacionada com defeito cardíaco (DCC) conotruncal. O MLPA (Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification) é um método eficaz para detectar microdeleções/microduplicações em pacientes com DCC. OBJETIVO: Detectar a presença da variação no número de cópias gênicas em pacientes portadores de cardiopatia conotruncal pela técnica de MLPA e associar ao fenótipo do paciente. MÉTODOS: Foram avaliados 39 pacientes (23 do sexo masculino, 16 do sexo feminino) com idade entre 2 dias e 19 anos (mediana de 6 anos), todos com cardiopatia conotruncal, a maioria dos pacientes (56%) apresentavam tetralogia de Fallot. Avaliação clínica e laboratorial foi realizada em todos os pacientes. O cariótipo foi normal em todos pacientes. MLPA foi realizada com os kits P064, P036/P070 e P250. RESULTADOS: Foram detectadas CNVs em sete pacientes: deleção 22q11.2, duplicação 22q11.2, duplicação 15q11.2, duplicação 20p12.2, deleção 19p, duplicação 15q e duplicação 8p23.2 com duplicação 10p12.31. As cardiopatias encontradas nestes pacientes foram: dupla via de saída de ventrículo direito (2), coartação da aorta, tetralogia de Fallot (3) e transposição de grandes artérias. Os achados clínicos extracardíacos encontrados nestes pacientes foram dismorfismo facial, dente neonatal, atrofia e displasia cerebral, atresia duodenal, dificuldade de aprendizado, insuficiência velofaríngea, aplasia de timo, refluxo gastroesofágico, hérnia umbilical, asma, infecções de vias aéreas frequente, déficit de crescimento e somente três apresentavam retardo no desenvolvimento neuropsicomotor (dup 15q11.2, dup 15q, del 22q11.2). As características clínicas foram compatíveis com o relatado na literatura associado com a microdeleção/microduplicação encontrada. Nenhuma destas alterações foram herdadas de seus pais testados em seis casos. CONCLUSÃO: O uso do MLPA possibilitou a detecção de CNVs em pacientes com DCC. O diagnóstico precoce das CNVs em pacientes com DCC auxilia na prevenção de morbidade e diminuição da mortalidade nestes pacientes, contudo em um país com regiões com poucos recursos laboratoriais genéticos uma avaliação clínica minuciosa em todo paciente com DCC é imprescindível para direcionar qual melhor exame deve ser realizado / INTRODUCTION: Congenital heart defects (CHD) are a group of structural abnormalities most prevalent birth and a major cause of infant morbidity and mortality. Genetic factors are important in the etiology of CHD. Studies have shown the contribution of copy number variation (CNV) in the genesis of cardiac malformations. The deleletion 22q11.2 is the most common cause of human microdeletion and is related conotruncal cardiac defect (DCC). The MLPA (Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification) is an effective method to detect microdeletions/micoduplications in patients with CHD. PURPOSE: Detect the presence of gene copies number variation in the patients with conotruncal heart defect by MLPA technique and associate the phenotype of the patient. METHODS: 39 patients (23 males, 16 females) aged 2 days old - 19 years old (median= 6 years old) with conotruncal cardiac defect were evaluated. Tetralogy of Fallot was more prevalent heart defect (56%). All patients were evaluated clinical and laboratory. Karyotypes were normal in all pacients. MLPA was performed with the P064, P036/P070 and P250 kits. RESULTS: CNVs were detected in seven patients: 22q11.2 deletion, 22q11.2 duplication, 15q11.2 duplication, 20p12.2 duplication, 19p deletion, 15q duplication and 8p23.2 duplication with 10p12.31 duplication. The congenital heart defect found in these patients were: double outlet right ventricle (2), coarctation of the aorta, tetralogy of Fallot (3) and transposition of the great arteries. Clinical findings in these patients were facial dysmorphism, neonatal tooth, brain atrophy and dysplasia, duodenal atresia, learning disabilities, velopharyngeal insufficiency, thymic aplasia, gastroesophageal reflux, umbilical hernia, asthma, frequent infections of the airways , failure to thrive, and only three had delayed psychomotor development (dup 15q 11.2, dup 15q, del 22q11.2) The clinical features were consistent with those reported in the literature associated with the microdeletion /microduplication found. None of these alterations were inherited from six parents tested. CONCLUSIONS: MLPA was effective to detect CNVs in patients with CHD. Early diagnosis of CNVs in patients with CHD assists in preventing morbidity and decreased mortality in these patients, however, in a country with regions with few genetic laboratory resources a thorough clinical evaluation in all patients with CHD is essential to direct which should be further analyzed performed