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Os mastocitomas são formações cutâneas neoplásicas que mais acometem os cães, por isso inúmeras pesquisas estão sendo direcionadas no descobrimento de novas opções de tratamento, diagnóstico e prognóstico desta doença. O objetivo deste trabalho foi avaliar a expressão de um conjunto de proteínas que estão interligadas ou interligam vias de sinalização, na tentativa de identificar proteínas que se apresentem diferencialmente expressas nos mastocitomas caninos de diferentes graus. Realizamos um estudo da expressão deste conjunto de proteínas em 18 tumores oriundos dos arquivos do Serviço de patologia animal do Departamento de Patologia da FMVZ-USP. Realizamos coleta de material fresco de outras 18 amostras de mastocitomas cutâneos caninos, as quais foram submetidas ao cultivo celular, e então foram estabelecidas 10 linhagens de mastocitomas cutâneos caninos a fim de se avaliar este mesmo grupo de marcadores moleculares in vitro. As amostras do arquivo foram submetidas à imunomarcação das seguintes proteínas: PTEN, c-kit, E-caderina, β-catenina, α-catenina, p120-catenina, MMP-7. Nas linhagens tumorais estabelecidas analisamos o ciclo celular, ploidia de DNA, proliferação celular pelo CFSE, análise ultraestrutural pela microscopia eletrônica de transmissão, análise mutacional do gene c-Kit, e análise por imunocitoquímica e imunofluorescência dos seguintes marcadores moleculares: PTEN, c-kit, E-caderina, β-catenina, α-catenina, p120-catenina, MMP-7, CX32, CX43, vimentina, triptase. Os resultados demonstram a alteração da expressão das proteínas do complexo E-caderina/catenina, do c-Kit, da proteína PTEN e MMP-7 de acordo com o grau do mastocitoma canino. Observamos além da redução de expressão uma localização subcelular de todas estas proteínas nos tumores mais agressivos como nos mastocitomas de grau 3. O mesmo foi observado para as proteínas Cx 43 e 32. Realizamos levantamento do histórico clínico dos 18 casos de mastocitoma caninos oriundos do arquivo, e os parâmetros clínicos avaliados foram: idade, raça, gênero, localização, tempo de evolução, alteração linfonodo, metástases, tempo sobrevida, intervalo recidiva, óbito. Foram associados a um pior prognóstico os pacientes que apresentaram os seguintes parâmetros: animais idosos, presença de metástase, localização no tórax e graduação tumoral. Nas linhagens tumorais estabelecidas, a análise da ploidia revelou que todas as linhagens de mastocitomas são diploides e o CFSE mostrou que a proliferação máxima ocorre dentro de 24hs de cultivo. A análise ultraestrutural comprova que as células das linhagens são mastócitos tumorais. A análise pela imunocitoquimica dos marcadores em estudo revelaram padrões similares aos encontrados na imunoistoquimica. Pela expressão da vimentina e da triptase confirmamos mais uma vez se tratar de linhagens de mastócitos em cultivo. Na análise mutacional do gene c-kit encontramos mutações no éxon 8 e 11, mas não no éxon 17. Nossos resultados revelam a ocorrência simultânea de inúmeras alterações moleculares nos mastocitoma caninos. As proteínas avaliadas têm funções e vias distintas, mas, que se interligam podendo regular ou serem reguladas, dependendo do momento em que se encontra a célula. A desestabilização do complexo E-caderina-cateninas parece ser o programa efetor na progressão dos mastocitomas caninos. A finalidade maior de se realizar estudos morfológicos, funcionais e moleculares das neoplasias é contribuir, mais cedo ou mais tarde, para o controle destas doenças. Esperamos, com este trabalho, ter fornecido informações importantes que favorecerão a busca por melhores tratamentos dos mastocitomas caninos. / Mast cell tumors are malignant skin formations that most affect dogs, so many research projects are being directed at the discovery of new treatment options, diagnosis and prognosis of this disease. The objective of this study was to evaluate the expression of a set of proteins that are interlinked or interconnected signaling pathways, in an attempt to identify proteins that show differentially expressed in canine mast cell tumors of different grades. We performed a study of the expression of this set of 18 proteins in tumors originating from the files of the Service of Animal Pathology, Department of Pathology of the FMVZ - USP. We collected other 18 new samples of canine cutaneous mast cell tumors , which were subjected to cell culture , and 10 strains of canine cutaneous mast cell tumors were established in order to evaluate in vitro this same group of molecular markers. The samples were subjected to immunostainings the following proteins: PTEN, c-kit, E-cadherin, β-catenin, α-catenin, p120-catenin, MMP-7. In established tumor cell lines we analyzed the cell cycle, DNA ploidy, cell proliferation by CFSE, ultrastructural analysis by transmission electron microscopy , mutational analysis of c-kit gene, and analysis by immunocytochemistry and immunofluorescence of the following molecular markers: PTEN, c-kit, E-cadherin, β-catenin, α-catenin, p120-catenin, MMP-7, CX32, Cx43, vimentin, tryptase. The results demonstrate the altered expression of the proteins, c- Kit, MM7 and PTEN proteins according to the level of the canine mastocytoma E-caderina/catenina complex. It has been observed a reduced expression as well as alterations in subcellular localization of all these proteins in more aggressive tumors as in grade 3 mast cell tumors. The same was observed for Cx 43 and 32 proteins. It has been performed a survey of the medical records of 18 cases of canine mast cell tumors retrieved from the archives, and clinical parameters evaluated were age, race, gender, location, time of evolution, change lymph node metastasis, survival time, recurrence interval, death. Older animals, metastasis, and tumor location in the chest, and mast cell tumor grade: patients who had the following parameters were associated with a worse prognosis. In the established tumor cell lines, ploidy analysis revealed that all lines are diploid mastocytoma and CFSE proliferation showed that the maximum occurs within 24 hours of cultivation. The ultrastructural analysis showed that the tumor cells are mast cell lineages. Analysis by immunocytochemistry markers studied showed similar patterns to those found in immunohistochemistry. By expression of vimentin and tryptase confirmed once again the case of mast cell lines in culture. In mutational analysis of the c kit, mutations were found in exon 8 and 11, but not in exon 17. Our results show the simultaneous occurrence of numerous molecular alterations in canine mast cell tumors. Proteins have different functions and evaluated pathways, but that interlock may regulate or be regulated, depending on the moment of the cell. The destabilization of the complex E-cadherin-catenins seems to be the effector program in the progression of canine mast cell tumors. The main purpose of performing morphological, functional and molecular studies of tumors is to contribute, sooner or later, to the control of these diseases. Hopefully, with this work, we have provided important information which will facilitate the search for better treatment of canine mast cell tumors

Os mastocitomas são formações cutâneas neoplásicas que mais acometem os cães, por isso inúmeras pesquisas estão sendo direcionadas no descobrimento de novas opções de tratamento, diagnóstico e prognóstico desta doença. O objetivo deste trabalho foi avaliar a expressão de um conjunto de proteínas que estão interligadas ou interligam vias de sinalização, na tentativa de identificar proteínas que se apresentem diferencialmente expressas nos mastocitomas caninos de diferentes graus. Realizamos um estudo da expressão deste conjunto de proteínas em 18 tumores oriundos dos arquivos do Serviço de patologia animal do Departamento de Patologia da FMVZ-USP. Realizamos coleta de material fresco de outras 18 amostras de mastocitomas cutâneos caninos, as quais foram submetidas ao cultivo celular, e então foram estabelecidas 10 linhagens de mastocitomas cutâneos caninos a fim de se avaliar este mesmo grupo de marcadores moleculares in vitro. As amostras do arquivo foram submetidas à imunomarcação das seguintes proteínas: PTEN, c-kit, E-caderina, β-catenina, α-catenina, p120-catenina, MMP-7. Nas linhagens tumorais estabelecidas analisamos o ciclo celular, ploidia de DNA, proliferação celular pelo CFSE, análise ultraestrutural pela microscopia eletrônica de transmissão, análise mutacional do gene c-Kit, e análise por imunocitoquímica e imunofluorescência dos seguintes marcadores moleculares: PTEN, c-kit, E-caderina, β-catenina, α-catenina, p120-catenina, MMP-7, CX32, CX43, vimentina, triptase. Os resultados demonstram a alteração da expressão das proteínas do complexo E-caderina/catenina, do c-Kit, da proteína PTEN e MMP-7 de acordo com o grau do mastocitoma canino. Observamos além da redução de expressão uma localização subcelular de todas estas proteínas nos tumores mais agressivos como nos mastocitomas de grau 3. O mesmo foi observado para as proteínas Cx 43 e 32. Realizamos levantamento do histórico clínico dos 18 casos de mastocitoma caninos oriundos do arquivo, e os parâmetros clínicos avaliados foram: idade, raça, gênero, localização, tempo de evolução, alteração linfonodo, metástases, tempo sobrevida, intervalo recidiva, óbito. Foram associados a um pior prognóstico os pacientes que apresentaram os seguintes parâmetros: animais idosos, presença de metástase, localização no tórax e graduação tumoral. Nas linhagens tumorais estabelecidas, a análise da ploidia revelou que todas as linhagens de mastocitomas são diploides e o CFSE mostrou que a proliferação máxima ocorre dentro de 24hs de cultivo. A análise ultraestrutural comprova que as células das linhagens são mastócitos tumorais. A análise pela imunocitoquimica dos marcadores em estudo revelaram padrões similares aos encontrados na imunoistoquimica. Pela expressão da vimentina e da triptase confirmamos mais uma vez se tratar de linhagens de mastócitos em cultivo. Na análise mutacional do gene c-kit encontramos mutações no éxon 8 e 11, mas não no éxon 17. Nossos resultados revelam a ocorrência simultânea de inúmeras alterações moleculares nos mastocitoma caninos. As proteínas avaliadas têm funções e vias distintas, mas, que se interligam podendo regular ou serem reguladas, dependendo do momento em que se encontra a célula. A desestabilização do complexo E-caderina-cateninas parece ser o programa efetor na progressão dos mastocitomas caninos. A finalidade maior de se realizar estudos morfológicos, funcionais e moleculares das neoplasias é contribuir, mais cedo ou mais tarde, para o controle destas doenças. Esperamos, com este trabalho, ter fornecido informações importantes que favorecerão a busca por melhores tratamentos dos mastocitomas caninos. / Mast cell tumors are malignant skin formations that most affect dogs, so many research projects are being directed at the discovery of new treatment options, diagnosis and prognosis of this disease. The objective of this study was to evaluate the expression of a set of proteins that are interlinked or interconnected signaling pathways, in an attempt to identify proteins that show differentially expressed in canine mast cell tumors of different grades. We performed a study of the expression of this set of 18 proteins in tumors originating from the files of the Service of Animal Pathology, Department of Pathology of the FMVZ - USP. We collected other 18 new samples of canine cutaneous mast cell tumors , which were subjected to cell culture , and 10 strains of canine cutaneous mast cell tumors were established in order to evaluate in vitro this same group of molecular markers. The samples were subjected to immunostainings the following proteins: PTEN, c-kit, E-cadherin, β-catenin, α-catenin, p120-catenin, MMP-7. In established tumor cell lines we analyzed the cell cycle, DNA ploidy, cell proliferation by CFSE, ultrastructural analysis by transmission electron microscopy , mutational analysis of c-kit gene, and analysis by immunocytochemistry and immunofluorescence of the following molecular markers: PTEN, c-kit, E-cadherin, β-catenin, α-catenin, p120-catenin, MMP-7, CX32, Cx43, vimentin, tryptase. The results demonstrate the altered expression of the proteins, c- Kit, MM7 and PTEN proteins according to the level of the canine mastocytoma E-caderina/catenina complex. It has been observed a reduced expression as well as alterations in subcellular localization of all these proteins in more aggressive tumors as in grade 3 mast cell tumors. The same was observed for Cx 43 and 32 proteins. It has been performed a survey of the medical records of 18 cases of canine mast cell tumors retrieved from the archives, and clinical parameters evaluated were age, race, gender, location, time of evolution, change lymph node metastasis, survival time, recurrence interval, death. Older animals, metastasis, and tumor location in the chest, and mast cell tumor grade: patients who had the following parameters were associated with a worse prognosis. In the established tumor cell lines, ploidy analysis revealed that all lines are diploid mastocytoma and CFSE proliferation showed that the maximum occurs within 24 hours of cultivation. The ultrastructural analysis showed that the tumor cells are mast cell lineages. Analysis by immunocytochemistry markers studied showed similar patterns to those found in immunohistochemistry. By expression of vimentin and tryptase confirmed once again the case of mast cell lines in culture. In mutational analysis of the c kit, mutations were found in exon 8 and 11, but not in exon 17. Our results show the simultaneous occurrence of numerous molecular alterations in canine mast cell tumors. Proteins have different functions and evaluated pathways, but that interlock may regulate or be regulated, depending on the moment of the cell. The destabilization of the complex E-cadherin-catenins seems to be the effector program in the progression of canine mast cell tumors. The main purpose of performing morphological, functional and molecular studies of tumors is to contribute, sooner or later, to the control of these diseases. Hopefully, with this work, we have provided important information which will facilitate the search for better treatment of canine mast cell tumors

Submitted by Aelson Maciera (aelsoncm@terra.com.br) on 2017-03-29T20:16:13Z No. of bitstreams: 1 DissNSMS.pdf: 2315984 bytes, checksum: 1245c9af0e2575904b71a6d6569edf15 (MD5) / Approved for entry into archive by Ronildo Prado (ronisp@ufscar.br) on 2017-04-11T19:16:23Z (GMT) No. of bitstreams: 1 DissNSMS.pdf: 2315984 bytes, checksum: 1245c9af0e2575904b71a6d6569edf15 (MD5) / Approved for entry into archive by Ronildo Prado (ronisp@ufscar.br) on 2017-04-11T19:16:36Z (GMT) No. of bitstreams: 1 DissNSMS.pdf: 2315984 bytes, checksum: 1245c9af0e2575904b71a6d6569edf15 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-04-11T19:43:37Z (GMT). No. of bitstreams: 1 DissNSMS.pdf: 2315984 bytes, checksum: 1245c9af0e2575904b71a6d6569edf15 (MD5) Previous issue date: 2016-04-20 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Cervical cancer is the second largest cause of deaths from malignant cancer among women worldwide. Many studies show the importance of the HPV virus in the onset of cervical cancer, but because of the monoclonal nature of this cancer, it is suspected that HPV infection may not be considered the only causal factor responsible for the development of cervical carcinoma. Studies have indicated that EBV may have a role in cooperation with the HPV16 tumor development. Such cooperation could influence the tumor microenvironment by creating a favorable niche for its progression. Cancer cells secrete enzymes that degrade the extracellular matrix (ECM). Such enzymes such as matrix metalloproteinases (MMPs) facilitate cell movement in tissues and induce the activity of growth factors that promote angiogenesis. Among the group of MMPs, MMP-7 seems to have a crucial role in the development of carcinogenesis, since its action has been associated with the cleavage and release of adhesion molecules important. In this sense, this study was performed to establish the relationship between the HPV coinfection / EBV and expression of MMP-7. They were examined immunohistochemically histological slides of cervical lesions biopsies of 60 patients aged 35 to 65 years. The samples were divided into high grade lesion and low grade and evaluated semiquantitatively by scoring system ranging from 0 to +++. Histopathological indexes the degree of injury were established. It observed a statistically significant association between high-grade lesion, the expression of MMP-7 and the presence of the HPV virus, with p = 0.007 at the junction portion squamocolumnar and p = 0.023 in the portion of the ectocervix. / O câncer cervical é responsável pela segunda maior causa de mortes por neoplasia malignas entre as mulheres no mundo. Muitos estudos comprovam a importância do vírus HPV no surgimento do câncer cervical, porém devido à natureza monoclonal desta neoplasia, suspeita-se que a infecção pelo HPV não possa ser considerada o único fator causal responsável pelo desenvolvimento do carcinoma de colo de útero. Estudos já apontaram que o EBV pode ter um papel de cooperação com o HPV16 no desenvolvimento tumoral. Tal cooperação poderia influenciar o microambiente tumoral criando um nicho favorável para a sua progressão. Células de câncer secretam enzimas que degradam a matriz extracelular (MEC). Tais enzimas, como as metaloproteinases de matriz (MMPs) facilitam a movimentação celular nos tecidos e induzem a atividade de fatores de crescimento que promovem a angiogênese. Dentre o grupo das MMPs, a MMP-7 parece ter papel crucial no desenvolvimento da carcinogênese, pois sua ação já foi associada com a clivagem e a liberação de importantes moléculas de adesão. Neste sentido, foi realizado este estudo para estabelecer a relação entre a co-infecção HPV/EBV e a expressão da MMP-7. Foram examinadas imunohistoquimicamente lâminas histológicas de biópsias de lesões de colo uterino de 60 pacientes com idades entre 35 e 65 anos. As amostras foram divididas em lesão de alto grau e de baixo grau e avaliados semiquantitativamente através de um sistema de escore variando de 0 à +++. Índices histopatológicos quanto ao grau das lesões foram estabelecidos. Foi observada uma associação estatisticamente significante entre a lesão de alto grau, a expressão da MMP-7 e a presença do vírus HPV, com p=0,007 na porção da junção escamocolunar e p=0,023 na porção da ectocérvice.

Made available in DSpace on 2014-12-17T15:32:28Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Tese_GeorgeJFN.pdf: 2720479 bytes, checksum: 6d72db8b12a0e5f743d69a67430d66b7 (MD5) Previous issue date: 2010-02-18 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Cient?fico e Tecnol?gico / Matrix metalloproteinase-7 (MMP-7) and -9 (MMP-9) modulate important functions strictly related to the development, invasion and metastasis of several human cancers among them the squamous cell carcinoma of the tongue (SCCT). However, individual genetic factors such as the functional single nucleotide polymorphisms (SNPs) influence the pattern of protein expression of these MMPs and thus may be related to the variability observed in the clinical behavior of patients with SCCT. In this context, the present cross-sectional study aimed to evaluate the association between the frequency of the functional SNPs MMP-7 -181 A/G and MMP-9 -1562 C/T and the clinical (age, gender and metastasis) and pathological (malignancy histological grading and immunohistochemistry expression) features of SCCT cases. Genotyping of these SNPs were performed by PCR-RFLP on DNA samples from 71 cases of SCCT and 60 individuals without cancer who constitute the control group. Among the results of this research, it was observed that the frequency of the polymorphic alleles MMP-7 -181 G and MMP-9 -1562 T in SCCT patients was 28% and 12%, respectively, and the frequency of the heterozygotes A/G (PR = 2.00; p < 0.001) and C/T (PR = 1.54; p = 0.014) were significantly higher in the patient group than in the controls. The prevalence of patients carrying the combination of SNPs studied was significantly associated with SCCT cases (PR = 2.00; p = 0.011) and metastasis (PR = 2.00; p < 0.001). Furthermore, with the frequency of SNPs analyzed, the age, gender, histological grading and immunoreactivity of MMP-7 and MMP-9 formed clinical and pathological parameters relevant to the identification of population subgroups more related to the development of SCCT and metastasis. Based on these results, it is suggested that the protein expression levels of MMP-7 and -9 substantially influence the balance between their pro- and anticancer biological functions and hence the clinicopathological profile of the squamous cell carcinoma of the tongue / As metaloproteinases da matriz extracelular-7 (MMP-7) e -9 (MMP-9) modulam importantes fun??es relacionadas ao desenvolvimento, invas?o e met?stase de diversos c?nceres humanos, dentre os quais o carcinoma epiderm?ide de l?ngua (CEL). Entretanto, fatores gen?ticos individuais, tais como polimorfismos de nucleot?deo ?nico (SNPs) funcionais, influenciam no padr?o de express?o proteica dessas MMPs, podendo estar relacionados ? variabilidade no comportamento cl?nico tumoral observado em pacientes com CEL. Neste contexto, o presente trabalho objetivou, atrav?s de an?lise em sec??o transversal, estudar a associa??o entre a frequ?ncia dos SNPs funcionais MMP-7 -181 A/G e MMP-9 -1562 C/T e as caracter?sticas cl?nicas (idade, sexo e met?stase) e patol?gicas (grada??o histol?gica e express?o imuno-histoqu?mica) em uma s?rie de casos de CEL. A genotipagem dos referidos SNPs foi executada por PCR-RFLP em amostras de DNA de 71 casos de CEL e de 60 indiv?duos sem c?ncer, que constitu?ram o grupo controle. Dentre os resultados da presente pesquisa, evidenciou-se que a frequ?ncia dos alelos polim?rficos MMP-7 -181 G e MMP-9 -1562 T nos pacientes com CEL foi de 28% e 12%, respectivamente, sendo as frequ?ncias dos heterozigotos A/G (RP = 2.00; p < 0.001) e C/T (RP = 1.54; p = 0.014) significativamente maiores neste grupo de pacientes que no grupo controle. A preval?ncia dos pacientes portadores da combina??o dos SNPs estudados associou-se significativamente aos casos de CEL (RP = 2.00; p = 0.011) e ? met?stase (RP = 2.00; p < 0.001). Ademais, junto ? frequ?ncia dos SNPs analisados, a idade, sexo, grada??o histol?gica e imunoexpress?o da MMP-7 e -9 constitu?ram par?metros clinicopatol?gicos relevantes para a identifica??o de subgrupos populacionais mais predispostos ao desenvolvimento do CEL e met?stase. Frente a estes resultados, sugere-se que os n?veis de express?o da MMP-7 e -9 influenciam consideravelmente no balan?o entre suas fun??es pr? e antineopl?sicas e, consequentemente, no perfil clinicopatol?gico do carcinoma epiderm?ide de l?ngua.