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Muc4, a heterodimeric transmembrane mucin containing EGF-like domains, has been described as an ErbB2-binding protein which modulates signaling via the ErbB2-ErbB3 pathway. In Muc4-transfected MCF-7 cells, Muc4 expression resulted in alteration of both the time course and phosphorylation levels of NRG beta 1 induced phosphorylation and activation of both ErbB2 and ErbB3. Muc4 significantly enhanced the autophosphorylation of ErbB2 over the early (defined 0-30 min) and intermediate (30-120 min) NRG beta 1 treatment times at three sites, Y1248, Y1221 and Y1139. The sites displayed differential maximal phosphorylation times. At Y1248 and Y1139, maximal phosphorylation occurred entirely during the early treatment phase. However, Y1221/2 showed maximal phosphorylation during the intermediate phase with a smaller peak during the early phase. The ratio of phosphorylated ErbB3 and total receptor level was significantly enhanced (in cells that expressed Muc4 compared without Muc4) over both the early and intermediate NRG beta 1 treatment time at the Y1289 site. This motif is one of several similar ErbB3 motifs whose phosphorylation mediates the binding of PI3-kinase. This phospholipid kinase is a key modulator of numerous cellular pathways leading to proliferation, motility and survival. Aberrancies in the ErbB2-ErbB3 signaling pathway have been implicated in the aggressive behavior of tumor cells, and the identification and characterization of modulators of this pathway are being sought as targets of potential therapeutic interventions. Muc4 significantly enhanced activated ERK in the absence of NRG beta 1 treatment while a NRG beta 1 mediated activation of AKT was observed. At early NRG beta 1 treatment time phases, Muc4 co-localized with phosphorylated ErbB2 (pY1248) independent of NRG beta 1 treatment; co-localization of Muc4 and ErbB2 receptor (activated/receptor forms) was observed at the apical surface or around the cell surface membrane. These data provide evidence in the Muc4-transfected MCF-7 cells for the biological NRG beta 1 mediated ErbB2 and ErbB3 activation. Our data suggests that Muc4 affects steady state phosphorylation levels and duration of the phosphorylation signal of both ErbB receptors, and that NRG beta 1 might affect ErbB2 and ErbB3 signaling differently. Additionally, the results of the timing of phosphorylation studies suggest the possibility that temporal aspects of phosphorylation at different sites may determine the pathways activated preferentially in the subsequent signaling cascades.

MUC4 is a heterodimeric mucin glycoprotein expressed in the epithelia of tissues. Previous studies in our laboratory demonstrated that MUC4 protein expression is regulated by exogenous growth factors and that MUC4 is found in complex with the receptor tyrosine kinase ErbB2. MUC4 protein expression in airway epithelia was evaluated using molecular biology techniques. The impact of the protein on ErbB2 activation was evaluated post mechanical wounding of airway epithelia, and upon MUC4 RNA silencing. MUC4 levels were increased with exposure to the differentiating agent retinoic acid and decreased upon exposure to epidermal growth factor, a proliferative agent. In the absence of MUC4, ErbB2 phosphorylation was diminished. These results support the hypothesis that MUC4 expression is enhanced during differentiation of epithelia. Furthermore these findings provide evidence for an additional level of ErbB regulation in airway injury and subsequent epithelial wound healing.

Notre travail s’est focalisé sur l’utilisation du trastuzumab‐immunoPET afin d’étudier et deguider une approche nouvelle visant à surmonter la résistance au médicament trastuzumab,causée par la surexpression de MUC4 dans le cancer du sein.Pour ce faire, nous avons préparé et utilisé du 89Zr‐trastuzumab dans le but de suivresa capacité de liaison au récepteur HER2 ainsi que son accumulation dans des cellulescancéreuses mammaires. Ensuite, nous avons formulé l’hypothèse que des agentsmucolytiques, tels que la N‐Acétylcystéine (NAC), en démêlant les réseaux formés par lesmucines, permettent l’amélioration de la captation du radiotraceur in vitro et in vivo. Eneffet, l’addition du NAC a occasionné une accumulation significative de 89Zr‐trastuzumab,sans altération ni changement de l’affinité de liaison au récepteur. Ceci semble égalementproduire une meilleure sensibilité des imageries PET dans le modèle animal choisi.Dans une seconde étape, nous avons évalué, dans un modèle murin de cancer du seinrésistant au trastuzumab et surexprimant la MUC4, si cette captation accrue se traduit parun bénéfice thérapeutique en utilisant le NAC combiné au trastuzumab. Nous avons obtenuun effet inhibiteur qui réduit de moitié la croissance tumorale, comparable à celui observépour la tumeur mammaire sensible au trastuzumab (implantée dans le même animal).En conclusion, notre étude démontre l’efficacité de l’utilisation de traceurs PETsurtout à visée théranostique, comme c’est le cas du 89Zr‐trastuzumab, pour étudier etévaluer la résistance aux médicaments ciblés apparentés au radiotraceur lui‐même. Ellepropose l’utilisation du NAC pour améliorer l’accessibilité du récepteur pour le radiotraceurainsi que pour le médicament « froid » ouvrant, de ce fait, une perspective vers uneutilisation clinique chez un sous‐type de patientes atteintes d’un cancer du sein. / Doctorat en Sciences biomédicales et pharmaceutiques (Pharmacie) / info:eu-repo/semantics/nonPublished

La mucine MUC4 est un acteur important de la cancérogenèse pancréatique. Elle favorise la progression tumorale et son expression est associée à un mauvais pronostic. Il a également été montré l’implication de la mucine MUC4 dans la résistance aux chimiothérapies. L’ensemble de ces données souligne l’intérêt de la mucine MUC4 comme cible thérapeutique. De plus, sa néoexpression dès les stades précoces de la cancérogenèse pancréatique lui confère un rôle potentiel de marqueur précoce de la carcinogenèse. Les mécanismes moléculaires responsables de l’induction précoce de l’expression de MUC4 sont toutefois encore peu connus.L’étude de la régulation de l’expression de la mucine MUC4 contribuerait donc mieux à comprendre son rôle dans la cancérogenèse. Ainsi, il a été montré que le gène MUC4 est régulé in vitro par des mécanismes transcriptionnels et par des mécanismes épigénétiques de méthylation de l’ADN et des modifications post-traductionnelles des histones. En revanche, la régulation post-transcriptionelle de l’expression de MUC4 notamment par les miARN est peu connue. Nos travaux ont pour but d’identifier les miARN dérégulés dans le cancer du pancréas et/ou ciblant potentiellement MUC4, de déterminer le(s) miARN inhibant l’expression de la protéine oncogénique MUC4 et l’impact de l’administration de ce(s) miARN dans la cancérogenèse pancréatique, et d’identifier les miARN impliqués dans la chimiorésistance médiée par MUC4 dans le cancer du pancréas.Dans un premier temps, nous avons dressé le profil d’expression des miARN dans des lignées cellulaires pancréatiques humaines normales et cancéreuses par puces miARN. Nous avons pu mettre en évidence une signature d’expression de miARN qui a permis de valider nos modèles cellulaires. Puis, à l’aide des bases de données TargetScan, Microcosm et MiRanda, nous avons identifié les miARN ciblant potentiellement MUC4. L’analyse par PCR quantitative a permis de montrer que seuls le miR-145 et miR-219-1-3p étaient sous-exprimés dans l’ensemble des lignées cancéreuses étudiées. Finalement, uniquement miR-219-1-3p est capable d’inhiber l’expression protéique de MUC4 ; c’est pourquoi nous nous sommes intéressés à son rôle dans le cancer du pancréas.Nous avons observé une perte d’expression du miR-219-1-3p dans des tissus de patients atteints d’adénocarcinome pancréatique. Par deux approches complémentaires de surexpression (transitoire ou stable) ou d’inhibition de miR-219-1-3p, nous avons montré qu’il était capable de réprimer l’expression de MUC4 au niveau protéique en se fixant directement sur son 3’-UTR. Nous avons observé une inhibition de la migration et de la prolifération cellulaires associées à une diminution de l’expression de la cycline D1 et de l’activation des voies de signalisation Akt et Erk. In vivo, la croissance tumorale est fortement ralentie après l’injection intratumorale de miR-219-1-3p. Grâce au modèle murin Pdx1-Cre;LSL-KrasG12D de lésions PanIN, nous avons pu mettre en évidence que la perte d’expression du miR-219-1-3p intervient précocement dès les stades PanIN-1/2 de la cancérogenèse pancréatique et qu’il existait une corrélation inverse entre l’expression de miR-219-1-3p et celle de la mucine Muc4.Par ailleurs, nous avons observé que le traitement des cellules cancéreuses pancréatiques humaines par la gemcitabine induit une forte surexpression du miR-219-1-3p qui laisse penser à un rôle potentiel de ce miARN dans la sensibilité des cellules à la chimiothérapie. Cependant, cette surexpression n’a montré aucun effet sur la survie cellulaire après traitement. Nous avons par la suite mis en évidence un profil d’expression différentiel des miARN entre les cellules invalidées pour MUC4 et les cellules contrôles. [...] / The MUC4 mucin is an important actor of pancreatic tumorigenesis as it contributes to tumor progression and its expression correlates with a poor prognosis. It has also been shown that MUC4 is involved in resistance of cells to chemotherapies. In this context, MUC4 is a potential therapeutic target in pancreatic cancer. MUC4 neoexpression at early stages of carcinogenesis confers to this mucin a potential interest as an early marker. Molecular mechanisms responsible for MUC4 induction of expression are not well defined. Thus, studying MUC4 gene expression regulation would contribute to better understand its role in tumorigenesis. MUC4 gene is regulated at the transcriptional level and epigenetically by DNA methylation and histone modifications mechanisms. However, MUC4 post-transcriptional regulation notably by miRNA is largely unknown. Our work aimed at (i) identifying miRNA dysregulated in pancreatic cancer and/or potentially targeting MUC4, (ii) determining miRNA(s) inhibiting MUC4 expression and its (their) impact on pancreatic carcinogenesis and finally (iii) identifying miRNAs involved in chemoresistance mediated by MUC4 in pancreatic cancer.First, using miRNA microarrays we established the miRNA expression profile of normal and cancerous pancreatic cell lines. We showed a cancer-specific miRNA signature which allows us to validate our cellular models. Then, performing in silico studies with TargetScan, Microcosm and MiRanda databases led us to identify miRNA potentially targeting MUC4. Analysis by qRT-PCR showed that miR-145 and miR-219-1-3p were downregulated in human pancreatic cancer cell lines. Finally, only miR-219-1-3p inhibited MUC4 expression thus we focused on its role in pancreatic cancer.We observed a loss of miR-219-1-3p expression in pancreatic cancer tissues. Complementary approaches overexpressing (transiently or stably) and inhibiting miR-219-1-3p expression, led us to show that miR-219-1-3p represses MUC4 protein expression by interacting directly with its 3’-UTR. We observed a decrease of cell migration and cell proliferation which was associated with an inhibition of cyclin D1 expression and an inhibition of Akt and Erk activation. Tumor growth in scid mice was strongly slowed down following miR-219-1-3p intratumoral injection. In the Pdx1-Cre;LSL-KrasG12D mouse model of PanIN, loss of miR-219-1-3p expression was an early event as soon as PanIN1/2 and miR-219-1-3p expression was conversely correlated to Muc4 expression.While the strong induction of miR-219-1-3p following gemcitabine treatment of pancreatic cancer cells suggests a potential role of this miRNA in sensitivity of cells,miR-219-1-3p has no effect on survival rate of cells treated with gemcitabine. We then established the miRNA expression profile of MUC4 knocked-down (MUC4-KD) cells and control cells (Mock) and showed a dysregulation of miRNA expression in MUC4-KD compared to Mock cells.To conclude, our results indicate that miR-219-1-3p, downregulated in pancreatic cancer, negatively regulates MUC4 expression, alters cancer cell biological properties and has an antimoral effect in vivo. Altogether, these results propose miR-219-1-3p as tumor suppressor in pancreatic cancer. Loss of MUC4 leads to an aberrant miRNA expression profile suggesting a potential role of miRNA as markers of chemoresistance in pancreatic cancer.

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L’oncogène K-ras est une petite GTPase de la super famille RAS, fréquemment impliquée dans les cancers, en particulier celui du pancréas, l’un des plus mortels dans les pays occidentaux. Les mutations de l’oncogène K-ras sont considérées comme l’un des événements initiateurs de la cancérogenèse pancréatique et son activité oncogénique est un élément indispensable à la progression tumorale. Cependant, le ciblage thérapeutique de K-ras reste inefficace, à ce jour. Se focaliser sur les cibles précoces de son activité oncogénique semble ainsi être une stratégie alternative intéressante. La mucine membranaire MUC4 est une glycoprotéine de haut poids moléculaire fréquemment dérégulée dans les cancers. Dans le cancer du pancréas, MUC4 est néo-exprimée dès les stades prénéoplasiques et est impliquée dans les propriétés biologiques permettant la progression tumorale et la chimiorésistance. La régulation de MUC4 par K-ras dans la cancérogenèse pancréatique reste à décrypter. En utilisant le modèle murin de cancérogenèse pancréatique Pdx1-Cre; LStopL-K-rasG12D, nous avons mis en évidence que la néo-expression précoce de la mucine Muc4, dans les lésions pancréatiques prénéoplasiques intraépithéliales (PanINs) formées suite à la présence du K-ras muté, est corrélée avec l’activation des voies de signalisation ERK, JNK and NF-κB. In vitro, la transfection de mutants constitutivement activés de K-rasG12V dans les cellules tumorales humaines induit une augmentation de l’expression de MUC4. Cette activation intervient au niveau transcriptionel par le recrutement des facteurs de transcription AP-1 et NF-κB via les voies MAPK, JNK and NF-κB et au niveau post-transcriptionel par un mécanisme impliquant la RalB GTPase. Ensemble, ces résultats démontre que MUC4 est une cible transcriptionelle et post-transcriptionelle de l’activité oncogénique de K-ras dans le cancer du pancréas. Ces résultats ouvrent de nouvelles pistes pour développer des stratégies ciblant les étapes précoces de ce cancer. / K-ras oncogene is a small GTPase of the RAS superfamily, highly implicated in cancer, mainly in pancreatic cancer, one of the most deadly cancers in occidental countries. K-ras mutations are considered as an initiating event of pancreatic carcinogenesis and K-ras oncogenic activities are necessary components of cancer progression. However, K-ras clinical targeting remains ineffective until now. Focus on early downstream K-ras signalling may thus appear as an interesting strategy target in this cancer. The membrane-bound mucin MUC4 is a high molecular weight glycoprotein frequently deregulated in cancer. In pancreatic cancer, MUC4 is neo-expressed in the preneoplastic stages and thereafter is involved in cancer cell properties leading to cancer progression and chemoresistance. MUC4 regulation by K-ras in pancreatic carcinogenesis remains unknown. Using the Pdx1-Cre; LStopL-K-rasG12D mouse model of pancreatic carcinogenesis, we show that the in vivo early neo-expression of the mucin Muc4 in pancreatic intraepithelial neoplastic lesions (PanINs) induced by mutated K-ras is correlated with the activation of ERK, JNK and NF-ΚB signalling pathways. In vitro, transfection of constitutively activated K-rasG12V in human pancreatic cancer cells led to the transcriptional upregulation of MUC4. This activation was shown to be mediated at the transcriptional level by AP-1 and NF-ΚB transcription factors via MAPK, JNK and NF-ΚB pathways and at the post-transcriptional level by a mechanism involving the RalB GTPase. Altogether, these results identifies MUC4 as a transcriptional and post-transcriptional target of K-ras in pancreatic cancer. This opens avenues in developing new approaches to target the early steps of this deadly cancer.

The membrane mucin Muc4 is a heterodimer, bi-functional glycoprotein complex that is normally expressed in epithelial tissue. Functional studies on the extracellular mucin subunit of Muc4 have shown that it acts to promote anti-adhesion properties by sterically interfering with cell-cell and cell-matrix interactions and that the extent of this effect is directly associated with the number of tandem repeats on this subunit. Functional studies on the transmembrane subunit of Muc4 have shown that this subunit participates in intracellular signaling through interaction with the receptor tyrosine kinase ErbB2. This role of Muc4 was shown to be mediated by stabilizing the heregulin ligand-induced ErbB2-ErbB3 heterodimer through interference with the internalization process of these receptors, thus potentiating the PI3K, a survival-signaling pathway that is mediated by this heterodimer. However, Muc4 was also shown to potentiate ErbB2 phosphorylation in the absence of heregulin by an unknown mechanism. The aim of this work was to examine the role of Muc4 in intracellular signaling by evaluating the ligand-independent Muc4-ErbB2 interaction. Biochemical analyses of A375 human melanoma cells expressing Muc4 under different cell treatments, and probed with phospho-specific antibodies, were used to understand the mechanism. An antibody microarray screen was used to decipher the intracellular activated signaling pathways. The results of the mechanistic analysis indicated that Muc4 potentiates ErbB2 signaling significantly by interacting with ErbB2 and ErbB3 and by stabilizing the kinase active ErbB2 receptor, thus increasing its phosphorylation signal half-life and resulting in sustained ErbB2 signaling. The signaling pathway analysis suggests that through Muc4 direct interaction with ErbB2, signaling pathways that promote loss of cell polarity are activated. Loss of cell-cell adhesion is mediated by interference with the cadherin-catenin complex stability, and loss of cell-matrix adhesion is mediated by facilitating focal adhesion turnover. Together, these results suggest that Muc4 is a potent oncogenic factor, and further enhance our understanding of the role that Muc4 plays in ligand-independent intracellular signaling.

Les mucines sont les molécules structurales de base du gel de mucus qui assure la protection et la lubrification de la muqueuse gastro-intestinale. Notre but était de déterminer l'effet de la leptine sur la sécrétion et l'expression des mucines gastro-intestinales. Cette étude a été réalisée in vivo chez le rat et in vitro à l'aide des lignées cellulaires de rat DHE et humaine HT29-MTX. Nous avons trouvé que ces 2 lignées expriment les récepteurs (Ob-R) de la leptine. La perfusion luminale de la leptine dans le côlon de rat ainsi que la stimulation des cellules DHE par la leptine a entraîné une augmentation de la sécrétion de mucines et du niveau des ARNm codant pour rMuc2, rMuc3 et rMuc4. Cet effet de la leptine était dose dépendant. Testée dans les HT29-MTX, la leptine a provoqué une augmentation de la sécrétion de mucines ainsi qu'une augmentation des transcrits de MUC2, MUC4 et MUC5AC via la voie de la PKC, la PI3K et les MAPK. Ces résultats montrent que la leptine pourrait jouer un rôle essentiel dans la protection de la muqueuse colique.