Die Optimierung der Diagnostik und Therapie von Magenkarzinomen stellt bei der schlechten Prognose der häufig schon im fortgeschrittenen Stadium diagnostizierten Befunde weiterhin eine große Herausforderung dar. Im Rahmen dieser Arbeit konnte insbesondere mit Verbesserung der Endosonographischen Diagnostik ein präziseres Tumorstadium präoperativ nachgewiesen werden. Nach Analyse unserer diagnostischen Untersuchungen ist eine Differenzierung zwischen uT2 und uT3 Kategorie einfacher durchführbar. Dennoch zeigte sich häufiger als initial diagnostiziert postoperativ ein positiver Nodalstatus und eine fortgeschrittenere T-Kategorie, deshalb sollte 1. die D2- Lymphadenektomie obligat durchgeführt und 2. das Konzept der multimodalen Therapie stringenter verfolgt werden. Die 7. TNM-Klassifikation hatte nicht allein einen Einfluss auf das operative Vorgehen. Dennoch kann sie bei der Entscheidung zur lokalen oder radikalen Therapie (z.B. bei T1a oder T1b) behilflich sein. Weiterhin wurde in verschiedenen Studien dargestellt, dass die Anzahl der Lymphknotenmetastasen, präziser nach der 7. TNM-Klassifikation eingeteilt, und die Infiltrationstiefe durchaus einen Einfluss auf die Prognose der 5JÜR haben. Hier besteht ein Potential zur präoperativen Optimierung z.B. durch neoadjuvante Chemotherapie, so dass sie, wie wir heute wissen auch nachfolgend praktiziert, einen Einfluss auf die Entscheidungsfindung der individuellen Therapiestrategie und damit der Prognose hatte. Mit dieser Studie konnten keine signifikante Prognoseverbesserung zwischen den einzelnen Stadien im Vergleich der 6. und 7. TNM Klassifikation nachgewiesen werden. Kliniken mit einer hohen Fall- und Operationszahl sind assoziiert mit einer besseren Prognose bezüglich des postoperativen Outcomes, dennoch kann das Evangelische Diakonissenkrankenhaus Leipzig mit einer Gesamt-5JÜR der operierten Patienten von 41% in Berücksichtigung der Zusammensetzung Patientengutes und der niedrigen Fallzahl durchaus dem internationalen Vergleich Stand halten. Ob mit der zunehmenden Tendenz zur Zentrenbildung und der weiteren Optimierung der präoperativen Diagnostik sowie der multimodalen Therapie die Langzeitüberlebensraten weiter verbessert werden können, werden zukünftige Studien zeigen.:Abkürzungsverzeichnis 1 1. Einleitung 2 1.1. Epidemiologische Fakten des Magenkarzinoms 2 1.2. Risikofaktoren und Pathogenese 3 1.3. Risikogruppen 4 1.4. Symptome 4 1.5. Diagnostik des Magenkarzinoms 4 1.6. Histologie und Prognosefaktoren 5 1.7. TNM-Klassifikation 6 1.8. Therapieansatz 7 2. Ziele der Arbeit 8 3. Material und Methoden 9 3.1. Material 9 3.2. Methoden 12 3.3. Auswertung und Statistik 12 4. Ergebnisse 13 4.1. Patientenzusammensetzung 13 4.1.1. Altersverteilung und Demographie 13 4.1.2. Einweisungsdiagnose 14 4.1.3. Operationsindikationen 15 4.1.4. Risikofaktoren 15 4.1.5. ASA-Klassifikation 16 4.2. Diagnostik 17 4.2.1. Gastroskopie 18 4.2.2 Nachweis von Helicobacter pylori 18 4.2.3. Endosonographie/ Sonographie 19 4.2.4. Computertomographie 22 4.2.5. Präoperative Histologie 23 4.3. Operative Therapie – Vergleich der Resektionsverfahren 24 4.3.1.Vergleich der Resektionsverfahren in Bezug auf die Tumor-Lokalisation 25 4.3.2. Vergleich der Resektionsverfahren in Bezug auf den histologischen Typ 26 4.3.3. Vergleich der Resektionsverfahren in Bezug auf UICC-Stadien 27 4.3.4. Vergleich der Resektionsverfahren in Bezug auf die pT-Kategorie 28 4.3.5. Vergleich der Resektionsverfahren in Bezug auf die pN-Kategorie 29 4.4. TNM Klassifikation Vergleich 6. und 7. Auflage 30 4.4.1. pT-Kategorie 31 4.4.2. pN-Kategorie 32 4.5. Postoperatives Grading 34 4.6. UICC-Stadien 34 4.7. Histologische Klassifikation 36 4.8. Postoperative 30-Tage-Letalität 37 4.9. Überlebenszeiten 38 5. Diskussion 42 6. Zusammenfassung 56 7. Literatur 57 8. Anlagen 64

Background: Gastric cancer is often diagnosed in the metastatic stage, and only 10% of patients survive for as long as 2 years. Current chemotherapy regimens show significant treatment-related toxicities. It is crucial to identify the patients that will benefit most from certain chemotherapy regimens in order to avoid unnecessary side effects. Patients and Methods: 2 patients with advanced gastric cancer repeatedly received 5-FU/cisplatin combination chemotherapy. Genomic DNA was extracted from tumor tissue and mononuclear blood cells. Genotype analysis of genes of metabolizing and DNA repair enzymes was carried out using a PCR-RFLP technique. Direct sequencing was used to identify mutations of the gene dihydropyrimidine dehydrogenase (DPD). Results: Prolonged survival of 51 and 29 months, respectively were observed in our 2 patients. Both patients were positive for genotypes of thymidylate synthase - the target enzyme of 5-FU - that are associated with improved drug response. DPD variants connected with increased toxicity were not observed. However, both patients also showed genotypes in cisplatin metabolizing enzymes which enhance the effect of the drug. Conclusion: Genotype analysis in drug metabolizing enzymes of 5-FU and cisplatin provide a possible explanation for extraordinary therapy effects observed in 2 patients with advanced gastric cancer. / Hintergrund: Das Magenkarzinom wird häufig im fortgeschrittenen Stadium diagnostiziert, und nur etwa 10% der Patienten überleben 2 Jahre. Aktuelle Chemotherapien zeigen eine hohe therapiebedingte Toxizität. Es ist daher von großer Bedeutung, diejenigen Patienten zu identifizieren, die von einer bestimmten Therapie profitieren, um anderen Patienten die Nebenwirkungen einer solchen Therapie zu ersparen. Patienten und Methoden: 2 Patienten mit fortgeschrittenem Magenkarzinom erhielten wiederholt eine Kombinationschemotherapie aus 5-FU/Cisplatin. Genomische DNS wurde aus Tumorgewebe und Leukozyten isoliert. Genotypanalysen von Genen, die am Metabolismus der Substanzen und am DNS-Reparaturprozess beteiligt sind, wurden mithilfe einer PCRRFLP-Methode durchgeführt. Das Gen der Dihydropyrimidindehydrogenase (DPD) wurde direkt sequenziert. Ergebnisse: Beide Patienten zeigten ein deutlich verlängertes Überleben von 51 bzw. 29 Monaten. Genotypen des 5-FU-Zielenzyms Thymidylatsynthase, die mit einem verbesserten Ansprechen assoziiert sind, konnten in beiden Patienten nachgewiesen werden. DPD-Varianten, die mit einer erhöhten Toxizität verbunden sind, wurden nicht beobachtet. Zusätzlich konnten bei beiden Patienten Genotypen in Cisplatin metabolisierenden Genen gefunden werden, die eine prolongierte Wirkung der Substanz bedingen. Schlussfolgerungen: Durch Genotypanalysen in Genen des 5-FU- und Cisplatin-Metabolismus konnte ein spezifisches pharmakogenetisches Profil identifiziert werden, das möglicherweise die Ursache eines außergewöhnlich guten Therapieeffektes in 2 Patienten mit fortgeschrittenem Magenkarzinom ist. / Dieser Beitrag ist mit Zustimmung des Rechteinhabers aufgrund einer (DFG-geförderten) Allianz- bzw. Nationallizenz frei zugänglich.

In der vorliegenden Promotionsarbeit wurden mit dem Ziel der Ermittlung von Patienten- und Karzinommerkmalen Daten zu 1209 Magenkarzinomfällen der Jahre 2008 bis 2012 aus dem RKKR Leipzig ausgewertet. Außerdem wurde die Vollständigkeit der Datenerhebung erfasst und untersucht. Mithilfe des Statistikprogramms SPSS wurde die Häufigkeit der Variablen ermittelt. Durch die Kaplan-Meier-Schätzung und den Log-Rank-Test wurden Überlebenszeit, 5- Jahresüberleben und das rezidivfreie Überleben sowie der Einfluss einzelner Variablen auf das Überleben berechnet. Im untersuchten Zeitraum erkrankten weitaus mehr Männer als Frauen an Magenkrebs. Die Mehrheit der Patienten erkrankte im Alter von 70 bis 79 Jahren. Am häufigsten wurde eine operative Therapie durchgeführt. Die Mehrzahl der Magenkarzinomfälle war im Corpus und Antrum lokalisiert. Es handelte sich überwiegend um Adenokarzinome. Die meisten Fälle wurden klinisch als Kategorie T4, N1 und M0 und pathologisch als Kategorie T3, N0 und M0 klassifiziert. Das 5-Jahresüberleben der Patienten dieser Analyse betrug 14,4% und die me- diane Überlebenszeit 13,0 Monate. Signifikanten Einfluss auf das Überleben zeigten die Va- riablen Therapieart, Lokalisation, klinisches bzw. pathologisches Stadium, initiale multimoda- le Therapie und R-Klassifikation. Die Vollständigkeit der Datenerhebung war nicht gegeben. Im Durchschnitt fehlten 44,7% der Daten. Lediglich die 4 Variablen Alter, Geschlecht, Lokalisation und Histologie des Magen- karzinoms wurden in allen 1209 Fällen dokumentiert. Wegen der großen Bedeutung für die Wissenschaft und Therapie in der Onkologie ist anzu- nehmen, dass sich klinische Krebsregister in Zukunft weiter etablieren werden und in diesen die Zahl der Daten in Richtung Vollständigkeit zunehmen wird. Trotz sinkender Inzidenz des Magenkarzinoms haben betroffene Patienten weiterhin eine ungünstige Prognose.

Background: Gastric cancer is often diagnosed in the metastatic stage, and only 10% of patients survive for as long as 2 years. Current chemotherapy regimens show significant treatment-related toxicities. It is crucial to identify the patients that will benefit most from certain chemotherapy regimens in order to avoid unnecessary side effects. Patients and Methods: 2 patients with advanced gastric cancer repeatedly received 5-FU/cisplatin combination chemotherapy. Genomic DNA was extracted from tumor tissue and mononuclear blood cells. Genotype analysis of genes of metabolizing and DNA repair enzymes was carried out using a PCR-RFLP technique. Direct sequencing was used to identify mutations of the gene dihydropyrimidine dehydrogenase (DPD). Results: Prolonged survival of 51 and 29 months, respectively were observed in our 2 patients. Both patients were positive for genotypes of thymidylate synthase - the target enzyme of 5-FU - that are associated with improved drug response. DPD variants connected with increased toxicity were not observed. However, both patients also showed genotypes in cisplatin metabolizing enzymes which enhance the effect of the drug. Conclusion: Genotype analysis in drug metabolizing enzymes of 5-FU and cisplatin provide a possible explanation for extraordinary therapy effects observed in 2 patients with advanced gastric cancer. / Hintergrund: Das Magenkarzinom wird häufig im fortgeschrittenen Stadium diagnostiziert, und nur etwa 10% der Patienten überleben 2 Jahre. Aktuelle Chemotherapien zeigen eine hohe therapiebedingte Toxizität. Es ist daher von großer Bedeutung, diejenigen Patienten zu identifizieren, die von einer bestimmten Therapie profitieren, um anderen Patienten die Nebenwirkungen einer solchen Therapie zu ersparen. Patienten und Methoden: 2 Patienten mit fortgeschrittenem Magenkarzinom erhielten wiederholt eine Kombinationschemotherapie aus 5-FU/Cisplatin. Genomische DNS wurde aus Tumorgewebe und Leukozyten isoliert. Genotypanalysen von Genen, die am Metabolismus der Substanzen und am DNS-Reparaturprozess beteiligt sind, wurden mithilfe einer PCRRFLP-Methode durchgeführt. Das Gen der Dihydropyrimidindehydrogenase (DPD) wurde direkt sequenziert. Ergebnisse: Beide Patienten zeigten ein deutlich verlängertes Überleben von 51 bzw. 29 Monaten. Genotypen des 5-FU-Zielenzyms Thymidylatsynthase, die mit einem verbesserten Ansprechen assoziiert sind, konnten in beiden Patienten nachgewiesen werden. DPD-Varianten, die mit einer erhöhten Toxizität verbunden sind, wurden nicht beobachtet. Zusätzlich konnten bei beiden Patienten Genotypen in Cisplatin metabolisierenden Genen gefunden werden, die eine prolongierte Wirkung der Substanz bedingen. Schlussfolgerungen: Durch Genotypanalysen in Genen des 5-FU- und Cisplatin-Metabolismus konnte ein spezifisches pharmakogenetisches Profil identifiziert werden, das möglicherweise die Ursache eines außergewöhnlich guten Therapieeffektes in 2 Patienten mit fortgeschrittenem Magenkarzinom ist. / Dieser Beitrag ist mit Zustimmung des Rechteinhabers aufgrund einer (DFG-geförderten) Allianz- bzw. Nationallizenz frei zugänglich.

Background Despite advances in the understanding of the disease and new treatment strategies, stage IV GC remains a relevant health issue worldwide. So far, treatment in stage IV GC has been limited to platinum-based chemotherapy. Furthermore, in the case of HER2 expression, the HER2-directed monoclonal antibody trastuzumab is an approved targeted drug for first line treatment. According to the pivotal randomized-controlled phase III registration study, trastuzumab is improving overall survival from 11.1 to 13.8 months. Unfortunately not all patients respond and almost all initial responders eventually develop resistance and experience tumor progression. The prospective multicenter VARIANZ study aimed to identify resistance biomarkers for HER2-targeted treatment in advanced gastric and esophagogastric junction cancer. More than 500 patients receiving medical treatment for stage IV GC were recruited in 35 German sites and followed for up to 48 months. HER2 status was assessed centrally by immunohistochemistry (IHC) and chromogenic-in-situ-hybridization (ISH). Within the study a HER2 test deviation rate (22.3%) between central and local test was associated with negative impact on patient survival. Patients who received trastuzumab with centrally confirmed HER2+ status (central HER2+/local HER2+) lived significantly longer compared to patients who received trastuzumab for local HER2+ but central HER2 stage IV GC (20.5 months vs. 10.9 months, 95% CI [8.2, 14.4], p<0.001) [1]. In the present analysis, we investigated methodological and biological variables that may promote deviating HER2 test results. Methods We analyzed HER2 testing procedures and participation in quality assurance programs of 105 participating local pathology laboratories. Furthermore, tumor localization, histological subtypes and tested tumor material (for local and central test) were compared between patients with centrally confirmed (central HER2+/local HER2+, n=68) and unconfirmed HER2 status (central HER2-/local HER2+, n=68). Results Central confirmation of the local HER2 IHC scores were seen for the majority of locally HER2- IHC 0/1 (172/178; 96.6%), but less frequently for locally IHC3+ (57/124; 46.0%) cases. Neither use of specific IHC methods nor participation in round robin tests varied between cohorts with confirmed (central HER2+/local HER2+, n=68) or deviating (central HER2-/local HER2+, n=68) HER2 test results. We found seven IHC antibodies (HercepTest, 4B5, SP3, CB11, UMAB36, A0485, EP3) in routine use in Germany, with HercepTest and 4B5 being the most commonly used. 46 (43.8%) local pathology laboratories participated in quality assurance programs for HER2 testing in GC. The distribution of the tested tumor material (primary tumor biopsy, surgical specimen, or biopsy from metastasis), related to both local and central HER2 testing, was comparable between the cohorts studied. Regarding tumor characteristics, deviating test results were more frequently found in GC vs. EGJC (69.1% vs. 39.7%; p=0.001). Within the Laurén histological classification deviating status (central HER2-/local HER2+) was more often found in diffuse type GC (23.5% vs. 5.9% for confirmed HER2+, p=0.004). Conclusion and Interpretation VARIANZ study has shown that GC patients with deviating HER2 test results had poor trastuzumab benefit [1], so we dedicated this work to the important question of the underlying causes of HER2 test deviations in GC. Our analysis demonstrates that neither the antibody platform used for IHC nor participation in round robin tests of local pathology institutes correlated with the deviation rate for HER2 test results. In contrast, we found that tumor characteristics such as primary tumor location and histological phenotype had an impact on test deviations: more HER2 test deviations were seen in distal GC compared to EGJC as well as in the diffuse versus intestinal subtype according to Laurén’s classification. One main limitation of our study is the so far barely used IHC HER2-antibody CB11 for central testing. However, in our study its highly specific properties [2–4] enabled it to identify patients who benefited from trastuzumab. In contrast to breast cancer HER2 is very heterogeneously expressed in GC [5, 6]. Due to this different expression, the HER2 testing scheme was adapted for GC [7]. Nevertheless, the success of HER2-targeted therapy in GC lags significantly behind breast cancer therapy [5]. HER2 heterogeneity is a known issue in GC, even in early stages [8]. Although much has been published [6, 9–11] , there is no generally agreed definition for HER2 heterogeneity or diagnostic procedure to identify HER2 heterogeneity. There are different approaches, for example using the relative number of HER2+ stained tumor cells [10, 12] or the deviation in HER2 status in a set of primary biopsies [13]. HER2 heterogeneity has already been associated with limited trastuzumab benefit and decreased overall survival in trastuzumab treated patients [1, 13, 14]. We conclude that the central confirmation of the HER2 status is a correlate of lower HER2 heterogeneity and may serve as an indicator for better treatment efficacy of trastuzumab. Further we assume that for distal GC location and for the diffuse subtype where HER2 positivity in general is less common [2, 15–18] weak HER2 expression and intratumoral heterogeneity account for more deviating test results. In our view, HER2 diagnostic scheme for GC should be adapted. Adaption of HER2 thresholds to identify patients benefiting from trastuzumab treatment has been already postulated [1, 17]. Our data suggests that only patients with low HER2 heterogeneity may benefit from trastuzumab treatment. For the selection of patients with low HER2 heterogeneity, the above tumor characteristics, such as tumor localization and histological subtype, should be reported. EGJC and the intestinal subtype are positive indicators of the presence of low HER2 heterogeneity. The use of highly specific IHC antibodies should be preferred. Furthermore, a positive result in IHC should always be confirmed by the examination of a paired specimen and the percentage of positive stained tumor cells should be reported. This might improve survival outcomes with targeted treatment, prevent overtreatment and associated side effects and costs and may enable successful studies of other promising HER2 targeting drugs.

Monozyten gehören zu den Zellen des angeborenen Immunsystems und sind maßgeblich an der Phagozytose von Pathogenen, an Entzündungsreaktionen, an der Wundheilung und bei der Rekrutierung von weiteren Immunzellen beteiligt. Neuere Forschungen zeigten jedoch, dass Monozyten ebenfalls eine entscheidende Rolle bei Tumorerkrankungen einnehmen. So konnte bei verschiedenen Tumorentitäten beobachtet werden, dass Monozyten pro- und antitumorale Funktionen aufweisen. Sie sind außerdem in der Lage, in tumorassoziierte Makrophagen zu differenzieren, welche zum Tumorgewebe migrieren und den Ausgang der Erkrankung maßgeblich beeinflussen. Tumorassoziierte Makrophagen weisen Eigenschaften der Typ-2 Makrophagen auf und üben eine tumorfördernde Funktion aus, bei der Immunsuppression, 106 Zusammenfassung Angiogenese und Metastasierung begünstigt wird. Magenkarzinome enthalten nicht nur hohe Mengen an tumorassoziierten Makrophagen, sondern beeinflussen außerdem Immunzellen im peripheren Blut über parakrine Faktoren, wie z.B. Extrazelluläre Vesikel (EVs). Sie beeinflussen sowohl physiologische als auch pathologische Prozesse, einschließlich der Karzinogenese. Tumore sekretieren EVs in ihre Umgebung und beeinflussen die Zusammensetzung des Tumormikromilieus. Auch im Blut zirkulieren Tumor-EVs und üben einen funktionsmodulierenden Effekt auf periphere mononukleäre Blutzellen aus. In vielen Fällen wurden immunsupprimierende Eigenschaften von Tumor-EVs nachgewiesen. Besonders bei der Beseitigung von Tumorzellen ist ein intaktes Immunsystem erforderlich. Inwiefern Magenkarzinom-EVs die immunologische Aktivität von Monozyten beeinflussen, ist Schwerpunkt der vorliegenden Arbeit. Hierbei sollten insbesondere Magenkarzinom spezifische EVs charakterisiert und ihr Einfluss auf die Zytokin-Produktion von aktivierten Monozyten untersucht werden. Um Magenkarzinom-spezifische EVs zu produzieren, erfolgte die Etablierung der Zellkultur der menschlichen Magenkarzinomzelllinie MKN45 und einer Kontrollzelllinie GES-1. Da depletiertes Medium kaum exogene EVs enthielt und eine uneingeschränkte Proliferation von MKN45 zuließ, bewährte es sich als geeignetes Medium für die Gewinnung von EVs. Untersuchungen mittels „Nanoparticle Tracking Analysis“ zeigten, dass die isolierten EVs eine charakteristische Größe zwischen 100 nm – 400 nm im Durchmesser aufwiesen (Modalwert GES-1: 207 nm; Modalwert MKN45: 169 nm). Die EV spezifischen Tetraspanine CD9, CD63 und CD81 ließen sich mittels durchflusszytometrischer Untersuchungen des Oberflächenproteinprofils nachweisen. Elektronenmikroskopische Aufnahmen bestätigten eine charakteristische EV-Struktur. Nach erfolgreicher Produktion von Magenkarzinom-spezifischen EVs erfolgte die Ko-Inkubation mit primären Monozyten, welche von gesunden Spendern mittels Ficoll-Dichtegradientenzentrifugation und Gegenstromelutriation gewonnen wurden. Untersuchungen der Genexpression mittels RT qPCR zeigten, dass die Inkubation mit MKN45-EVs in LPS-aktivierten Monozyten zu einer Abnahme der relativen mRNA-Expression der pro-inflammatorischen Zytokine IL-8 und TNF-α, sowie zu einer Zunahme von INF- führt. In Folgeexperimenten konnte nach der Inkubation mit MKN45 eine konzentrationsabhängige Inhibierung der TNF- Produktion auf Genexpressions- und Proteinebene, sowie ein konzentrationsabhängiger Anstieg der IFN- mRNA beobachtet werden. Analog zeigte die Inkubation mit GES-1 EVs eine ähnliche konzentrationsabhängige Inhibierung der TNF--Produktion, jedoch auch eine Hemmung der Genexpression von IFN-Beta. Magenkarzinom- und Kontroll-EVs beeinflussen somit die LPS 107 Zusammenfassung abhängige Induktion von TNF-α und IFN-β. Im Anschluss daran wurde die Untersuchung des zugrunde liegenden Mechanismus durchgeführt. NF-κB ist als Transkriptionsfaktor Toll-like Rezeptor-4(TLR4)-abhängiger Signalwege von großer Bedeutung für die LPS-induzierte Zytokinproduktion. Nach einer Inkubation mit EVs wurde die Phophorylierung von NF-κB in primären Monozyten mittels Western-Blot-Methodik analysiert. Zwar führte die Inkubation mit MKN45 EVs und LPS zu einer erhöhten Phosphorylierung von NF-κB die sich jedoch durch Zugabe von EVs nicht änderte. Die Inkubation mit Tumor-EVs allein hatte keinen Effekt. Somit spiegelte sich die durch die EVs beobachtete Hemmung der LPS-induzierten TNF-a Produktion nicht in den Western-Blot Analysen wider. Es folgten Untersuchungen die den Einfluss sezernierter EVs auf primäre Monozyten, nach Behandlung der GES-1 und MKN45 mit Nikotinamid (NAM) analysierten. NAM ist eine Substanz, die viele zelluläre Prozesse, wie z.b. Energiemetabolismus, Lipidstoffwechsel und DNA-Reperaturmechanismen, maßgeblich beeinflusst und in der Tumortherapie Einsatz findet. Ein Effekt auf die Funktion der EVs auf die TNF-α und IFN-β-Produktion wurde jedoch in der vorliegenden Arbeit ausgeschlossen. Ein weiteres Hauptaugenmerk lag in der Analyse des zellulären Immunstatus der Monozyten von Magenkarzinompatienten. Es wurden Oberflächenproteine der Monozyten aus Vollblutproben von 30 Magenkarzinompatienten (♀ = 22, ♂ = 8, Ø-Alter = 65 Jahre) und 24 altersentsprechenden gesunden Spendern durchflusszytometrisch untersucht. Auffällig war, dass Monozyten von Magenkarzinompatienten eine erhöhte Expression des Oberflächenproteins Carboxypeptidase M (CPM) aufweisen, eine Metallo-Carboxypeptidase, die mit der Makrophagendifferenzierung assoziiert ist. Weiterhin exprimieren Monozyten von Magenkarzinompatienten in höherem Anteil CD33, ein entscheidender Regulator der inflammatorischen Funktion von Monozyten. Im letzten Teil der Arbeit wurde die Rolle des Zytokins TGF- bei der Immunmodulation durch Magenkarzinome diskutiert. Mithilfe des Online-Tools GEPIA2 wurden computergestützte Analysen durchgeführt, die zeigten, dass die Genexpression von TGFB1 bei Magenadenokarzinomen und Ösophaguskarzinomen im Vergleich zu gesundem Gewebe erhöht ist und dass eine gesteigerte Genexpression von TGFB1 bei Patienten mit Magen- oder Ösophaguskarzinom mit einer verminderten Überlebensrate korreliert. Abschließend wurde überprüft, ob das in der vorliegenden Studie verwendete Zellkulturmodell mit den computergestützten Analysen übereinstimmt. Im Vergleich zu GES-1 weisen MKN45 eine doppelt so hohe relative Genexpression von TGFB1 auf. Dieser Befund stimmt mit den oben beschriebenen in silico generierten Ergebnissen überein. Zusammenfassend gelang die 108 Zusammenfassung Entwicklung eines erfolgreichen Protokolls für zur Isolation von EVs aus menschlichen Magenkarzinomzelllinien in hoher Reinheit und Effizienz. Die vorliegende Studie demonstrierte einen immunmodulierenden Effekt der EVs aus GES-1 und MKN45 Zelllinien auf periphere Monozyten. Weiterhin unterlagen periphere Monozyten von Magenkarzinompatienten einer Änderung der Expression der Oberflächenproteine CPM und CD33. Diese Arbeit liefert Hinweise, dass magenkarzinomspezifische EVs antiinflammatorische Effekte auf periphere Monozyten ausüben können. Hierbei spielt möglicherweise ein TGF- abhängiger Mechanismus eine übergeordnete Rolle. Weitere Studien sind notwendig, um die intravesikulären Charakteristika der magenkarzinomassoziierten EVs und deren Interaktion mit Immunzellen zu untersuchen. Das Verständnis der Rolle von EVs bei tumorassoziierten Prozessen könnte perspektivisch zu deren Einsatz im Rahmen zielgerichteter Immunmodulation oder Diagnostik führen.:Inhaltsverzeichnis Abkürzungsverzeichnis V 1 Einleitung 1 1.1 Das Immunsystem 1 1.1.1 Die Rolle des Immunsystems und ihre Komponenten 1 1.1.2 Monozyten 3 1.1.3 Die Rolle von Monozyten im Tumorgeschehen 6 1.2 Magenadenokarzinome 7 1.2.1 Beschreibung und Klassifizierung 7 1.2.2 Die Wechselwirkung zwischen Magenadenokarzinom und Immunsystem 7 1.3 Extrazelluläre Vesikel 10 1.3.1 Biogenese und Klassifikation . 10 1.3.2 Isolierung und Charakterisierung 11 1.3.3 Die Immunonkologische Rolle von EVs15 1.4 Nikotinamid 16 1.4.1 Die physiologische Rolle von Nikotinamid 16 1.4.2 Der Einfluss von Nikotinamid auf Immun- und Tumorzellen 17 2 Zielstellung 19 3 Material und Methoden 21 3.1 Menschliche Zelllinien 21 3.2 Geräte und Material 21 3.2.1 Geräte 21 3.2.2 Verbrauchsmaterialien 22 3.3 Software und Web-Tools 23 3.3.1 Software23 3.3.2 Web-Tools . 23 3.4 Chemikalien, Kits und Nährmedien 23 3.4.1 Chemikalien23 3.4.2 Kits 24 Inhaltsverzeichnis II 3.4.3 Puffer und Lösungen25 3.5 Biologische Materialien . 29 3.5.1 Oligonukleotide 29 3.5.2 Antikörper 30 3.5.3 Protein Größenmarker 31 4 Methoden 32 4.1 Zellkultur 32 4.1.1 Ficoll-Dichtegradientenzentrifugation 32 4.1.2 Gegenstromelutriation 32 4.1.3 Kultur, Stimulation und Ernte von Monozyten 33 4.2 Isolation extrazellulärer Vesikel 34 4.2.1 Herstellung von partikeldepletiertem Zellkulturmedium 34 4.2.2 Entfernung von Zelltrümmern aus Zellkulturüberständen 34 4.2.3 Sequenzielle Ultrazentrifugation zur Pelletierung von EVs34 4.3 Charakterisierung extrazellulärer Vesikel 35 4.3.1 „Nanoparticle Tracking Analysis“ (NTA) 35 4.3.2 Transmissionselektronenmikroskopische Untersuchungen der Struktur von extrazellulären Vesikeln 35 4.3.3 Beadbasierte Charakterisierung von Oberflächenproteinen von extrazellulären Vesikeln 36 4.4 Molekulare Analyse von Zellen mittels RT-qPCR 36 4.4.1 RNA-Isolation36 4.4.2 DNA-Verdau 37 4.4.3 cDNA-Synthese (Reverse Transkription) 37 4.4.4 QRT-PCR (quantitative real-time polymerase chain reaction) 38 4.5 Molekularbiologische Methoden 39 4.5.1 SDS-PAGE und Westernblot 40 4.5.2 TNF-α-Bestimmung im Zellkulturüberstand mittels ELISA 41 4.5.3 Durchflusszytometrische INF-β-Bestimmung im Zellkulturüberstand42 4.5.4 Durchflusszytometrische Analyse von Oberflächenproteinen von Monozyten aus Vollblut 42 4.5.5 Durchflusszytometrische Analyse von Viabilität, Apoptose und Nekrose 44 Inhaltsverzeichnis III 4.6 Gatingstrategie 45 4.7 Statistik 47 5 Ergebnisse 48 5.1 Isolation von extrazellulären Vesikeln aus Magenkarzinomzelllinien48 5.1.1 Beschreibung der Zelllinien GES-1 und MKN45 48 5.1.2 Herstellung von partikelfreien Zellkulturmedium. 49 5.1.3 Zellproliferation und Viabilität von MKN45 in partikelfreien Zellkulturmedium .. 52 5.1.4 Gewinnung und Quantifizierung von Partikeln der Zelllinien MKN45 und GES-1 55 5.2 Charakterisierung der isolierten Partikel 58 5.2.1 Analyse von Oberflächenproteinen der isolierten Partikel58 5.2.2 Elektronenmikroskopische Untersuchungen der isolierten Partikel 60 5.3 Einfluss von extrazellulären Vesikeln der Magenkarzinomzelllinien auf die Zytokinproduktion und Signaltransduktion von aktivierten Monozyten 62 5.3.1 Analyse der Zytokinantwort von stimulierten Monozyten auf extrazelluläre Vesikel der Magenkarzinomzelllinien 62 5.3.2 Der konzentrationsabhängige Effekt von extrazellulären Vesikeln auf die Produktion von TNF-α und IFN-β 63 5.3.3 Untersuchungen des zeitabhängigen Effekts von extrazellulären Vesikeln auf die Produktion von TNF-α und IFN-β 67 5.3.4 Einfluss von extrazellulären Vesikeln auf die Phosphorylierung von Schlüsselproteinen des TLR4 Signalweges 73 5.4 Einfluss von Nikotinamid auf den Effekt von extrazellulären Vesikeln auf die Zytokinproduktion 76 5.4.1 Untersuchungen des Einflusses von Nikotinamid auf die Zellproliferation und Viabilität von MKN4576 5.4.2 Effekt von extrazellulären Vesikeln auf die Produktion von TNF-α und IFN-β aus Nikotinamid behandelten Zelllinien 77 5.5 Analyse und Vergleich der Expression von Oberflächenmarkern auf primären Monozyten von Magenkarzinompatienten und gesunden Spendern 82 Inhaltsverzeichnis IV 5.6 TGFβ im Magenkarzinom 88 6 Diskussion 92 6.1 Isolation und Charakterisierung von EVs 92 6.2 Immunmodulierender Effekt von Magenkarzinom-EVs auf Monozyten 97 6.3 Der Effekt von Nikotinamid auf die Funktion von Magenkarzinom-EVs100 6.4 Expression von CPM und CD33 auf primären Monozyten von Magenkarzinompatienten 102 6.5 TGFβ im Magenkarzinomgeschehen 104 7 Zusammenfassung 106 8 Literaturverzeichnis 110 8.1 Literaturverzeichnis 110 9 Anlagen 127 10 Selbstständigkeitserklärung, Lebenslauf, Publikationen, Danksagung 134 10.1 Erklärung über die eigenständige Abfassung der Arbeit134 10.2 Lebenslauf 135 10.3 Publikation136 10.4 Danksagung 137

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Toll-like Rezeptoren (TLRs) sind essentielle angeborene Rezeptoren, die konservierte Strukturen von Krankheitserregern oder Gefahrsignale, die von beschädigten Zellen freigesetzt werden, erkennen können. Genetische Variationen in TLRs wie Einzel-Nukleotid-Polymorphismus (SNP) können die Funktion von TLRs beeinträchtigen und erste Studien zeigen, dass dies zu einer erhöhten Anfälligkeit gegenüber Virusinfektionen oder einem erhöhten Krebsrisiko führen kann. In dieser Studie haben wir einen Multicolor-Durchflußzytometrie-Test entwickelt, um die TLR-Funktionen in verschiedenen Subpopulationen unseparierter peripherer mononukleärer Blutzellen (PBMCs) simultan analysieren zu können. Wir konnten beobachten, dass das Ausmaß der TLR-Antworten zwischen den Probanden stark variierte, jedoch über einen Zeitraum von einem Monat gut reproduzierbar war. Zunächst untersuchten wir TLR Reaktionen bei Patienten mit rezidivierenden Herpes labilalis (HL). Im Vergleich zu asymptomatischen Personen war eine HL- Anamnese mit einer signifikant verminderten TLR3-IFN-Gamma-Antwort nach Stimulation mit poly(I:C) in NK Zellen assoziiert. Weitere molekulare Untersuchungen zeigten eine mögliche Beteiligung von TLR3 L412F SNP, welcher die oberflächliche TLR3 Expression und die IFN-Gamma-Antworten in NK-Zellen reduzierte. Einige Studien zeigen, dassTLR1 I602S, ein weiterer sehr verbreiteter SNP, in der Lage ist die TNF-Alpah-Antworten von Monozyten gegen den TLR2/1-Agonisten (Pam3Cys) zu verringern. In der hier vorliegenden Arbeit konnten wir zudem nachweisen, dass TLR1 I602S SNP auch die Funktion von NK-Zellen und CD8+ T-Zellen beeinträchtigt. Wir konnten keine Assoziation zwischen TLR2/1-Defizienz und reaktivierendem HL feststellen. Jedoch konnten wir an einer großen Kohorte von über 326 Patienten zeigen, dass der TLR1 SNP sowohl ein Risikofaktor für Magenkarzinomentstehung als auch für die Metastasierung ist. Zusammenfassend weisen unsere Ergebnisse darauf hin, dass genetische Polymorphismen von TLRs die Funktion von NK-Zellen beeinträchtigen und zu einer erhöhten Anfälligkeit für HSV-1 Erkrankung und Magenkarzinom führen können. / Toll-like Receptors (TLRs) are essential innate receptors which recognize conserved structures of pathogens, or danger signals released from damaged cells. Alterations of TLR responses might result in severe viral infections or a higher risk of cancer. Therefore, development of clinical assays to evaluate TLR functions could provide personalized information about susceptibility to these diseases. Since TLRs are differentially expressed on different subsets of human peripheral blood mononuclear cells (PBMCs), a multi-color flow cytometry-based assay was developed to detect TLR responses of individual cell types simultaneously. We observed that the magnitude of TLR responses largely varied between human subjects, but was highly reproducible over one month. To evaluate the potential role of differences in natural killer (NK) cell TLR response we studied the association of NK cell TLR function and TLR single nucleotide polymorphisms (SNPs) with susceptibility to recurrent herpes labialis (HL) and gastric cancer. Using our assay, impaired TLR3 response of NK cells was found in people with recurrent HL. In addition, we have identified enhanced levels of homozygous TLR3 L412F SNP in people with recurrent HL, which results in lower surface expression and reduced NK cell response to poly(I:C). TLR1 I602S, another common SNP, has been reported to decrease TNF-Alpha responses of monocytes toward TLR2/1 agonist, Pam3CSK4 (Pam3Cys), stimulation. In our study, we found that TLR1 I602S homozygosity also contributes to impaired IFN-Gamma responses of NK cells and CD8+T cells. Although we did not observe an association of TLR2/1 deficiency with recurrent HL, association of TLR1 I602S with risk for primary as well as metastatic gastric cancer was found in a cohort of 326 patients. To sum up, our results suggest that genetic polymorphisms of TLRs can impair TLR function of NK cells, which contribute to the increased susceptibility to HSV-1 diseases and gastric cancer.