Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

La maladie du greffon contre l’hôte (GVHD) reste la complication majeure de l’allogreffe de cellules soucheshématopoïétiques (allo-CSH). La GVHD résulte de l’activation de la réponse immunitaire et de la reconnaissanced’alloantigènes par les lymphocytes T (LT) du donneur, entrainant ainsi des lésions tissulaires principalement auniveau de la peau, des intestins et du foie. L’interleukine-22 (IL-22) est une cytokine sécrétée par les LT Th1,Th17 et les cellules de l’immunité innée (ILC). Compte tenu des propriétés de l’IL-22 dans les tissus cibles de laGVHD, nous avons évalué sa contribution dans la physiopathologie de la maladie à l’aide de modèlesexpérimentaux murins. Il apparaît que les souris qui reçoivent des lymphocytes T invalidés pour l’IL-22développent une maladie moins sévère, et leur mortalité est diminuée. L’IL-22 issue du greffon participe donc à lasévérité de la GVHD en favorisant l’inflammation systémique, mais aussi locale au niveau des organes cibles. Deplus, dans les intestins, l’IL-22 agit en synergie avec les interférons de type I pour amplifier l’inflammation de typeTh1 au cours de la GVHD. Chez l’homme, la GVHD est associée à une modification du microbiote intestinal.Nous avons montré que l’absence d’IL-22 semble favoriser la colonisation de lactobacilles au détriment declostridiums, ce qui pourrait également participer à la diminution de la GVHD intestinale. Enfin, nous avonsmontré que l’effet anti-tumoral est préservé malgré l’absence d’IL-22. Ces résultats permettent donc d’envisagerde nouvelles perspectives thérapeutiques dans le traitement de la GVHD. / Graft-versus-host disease (GVHD) is still the major complication after allogeneic stem cell transplantation. GVHDresults from the activation of the immune response and the recognition by donor T cells of alloantigens leading totissue injury, especially in skin, gut and liver. Interleukin-22 (IL-22) is a cytokine secreted by CD4+ T cells Th1 andTh17 but also by innate lymphoid cells (ILC). Given that IL-22 functions in the GVHD target tissues, weinvestigated its contribution in GVHD physiopathology using mouse experimental models. We showed that IL-22deficiency in donor cells reduced the severity of GVHD by limiting systemic and local inflammation. Moreover, inthe large intestine, IL-22 acts in synergy with type I interferon to increase Th1-like inflammation. In humans,GVHD severity is associated with microbiotal modification in the intestine. We demonstrated that IL-22 deficiencyin donor cells seems to favor lactobacillus colonization instead of clostridium. These changes of microbiotacomposition may reduce the severity of intestinal GVHD. Finally, we showed that the antitumor effect is preservedeven in absence of IL-22 donor cells. Overall, our data support the design of new clinical approaches aiming totarget IL-22 pathways in GVHD patients.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

La maladie du greffon contre l’hôte (GVHD) reste la complication majeure de l’allogreffe de cellules soucheshématopoïétiques (allo-CSH). La GVHD résulte de l’activation de la réponse immunitaire et de la reconnaissanced’alloantigènes par les lymphocytes T (LT) du donneur, entrainant ainsi des lésions tissulaires principalement auniveau de la peau, des intestins et du foie. L’interleukine-22 (IL-22) est une cytokine sécrétée par les LT Th1,Th17 et les cellules de l’immunité innée (ILC). Compte tenu des propriétés de l’IL-22 dans les tissus cibles de laGVHD, nous avons évalué sa contribution dans la physiopathologie de la maladie à l’aide de modèlesexpérimentaux murins. Il apparaît que les souris qui reçoivent des lymphocytes T invalidés pour l’IL-22développent une maladie moins sévère, et leur mortalité est diminuée. L’IL-22 issue du greffon participe donc à lasévérité de la GVHD en favorisant l’inflammation systémique, mais aussi locale au niveau des organes cibles. Deplus, dans les intestins, l’IL-22 agit en synergie avec les interférons de type I pour amplifier l’inflammation de typeTh1 au cours de la GVHD. Chez l’homme, la GVHD est associée à une modification du microbiote intestinal.Nous avons montré que l’absence d’IL-22 semble favoriser la colonisation de lactobacilles au détriment declostridiums, ce qui pourrait également participer à la diminution de la GVHD intestinale. Enfin, nous avonsmontré que l’effet anti-tumoral est préservé malgré l’absence d’IL-22. Ces résultats permettent donc d’envisagerde nouvelles perspectives thérapeutiques dans le traitement de la GVHD. / Graft-versus-host disease (GVHD) is still the major complication after allogeneic stem cell transplantation. GVHDresults from the activation of the immune response and the recognition by donor T cells of alloantigens leading totissue injury, especially in skin, gut and liver. Interleukin-22 (IL-22) is a cytokine secreted by CD4+ T cells Th1 andTh17 but also by innate lymphoid cells (ILC). Given that IL-22 functions in the GVHD target tissues, weinvestigated its contribution in GVHD physiopathology using mouse experimental models. We showed that IL-22deficiency in donor cells reduced the severity of GVHD by limiting systemic and local inflammation. Moreover, inthe large intestine, IL-22 acts in synergy with type I interferon to increase Th1-like inflammation. In humans,GVHD severity is associated with microbiotal modification in the intestine. We demonstrated that IL-22 deficiencyin donor cells seems to favor lactobacillus colonization instead of clostridium. These changes of microbiotacomposition may reduce the severity of intestinal GVHD. Finally, we showed that the antitumor effect is preservedeven in absence of IL-22 donor cells. Overall, our data support the design of new clinical approaches aiming totarget IL-22 pathways in GVHD patients.

Introduction L’allogreffe de cellules souches hématopoïétiques est un traitement avec un potentiel curatif chez une minorité de patients ayant un diagnostic myélome multiple. Malheureusement, ce traitement est associé à un taux élevé de complications, incluant une probabilité élevée de rechute et/ou de GVH chronique limitant. L’objectif principal de cette étude est de déterminer si un entretien au bortezomib (BTZ) post-allogreffe permet de diminuer l’incidence et la sévérité de la maladie du greffon contre l’hôte (GVH) chronique. Les objectifs secondaires étaient d’évaluer la prise d’immunosuppresseur, de déterminer l’atteinte d’organe et la survie (OS et PFS) chez les patients ayant reçu ou pas du BTZ en entretien. Méthodes Dans cette étude rétrospective, nous avons comparé 46 patients ayant reçu du BTZ en entretien post-allogreffe à 61 patients n’ayant pas reçu d’entretien. Nous avons étudié l’impact du BTZ sur l’incidence et la sévérité de la GVH chronique en utilisant les critères du NIH de 2014. Résultats À 2 ans, l’incidence globale (61.2% vs 83.6%, p=0.001) et modérée/sévère (44.5% vs 77.0%, p=0.001) de GVH chronique était significativement inférieure chez les patients ayant reçu du BTZ en entretien. Les atteintes buccale (43% vs 67%, p=0.018) et ophtalmique (9% vs 41%, p=0.001) étaient diminuées de manière significative lors du diagnostic initial de la GVH chronique chez ces patients ayant reçu un entretien post-allogreffe. Une diminution de l’usage des immunosuppresseurs, dont les corticostéroïdes systémiques (45.1% vs 76.4%, p<0.001), du mycophenolate mofetil (15.5% vs 28.2%, p=0.031) et du tacrolimus (34.5% vs 70.6%, p<0.001) a été observée chez les patients ayant reçu le BTZ. La probabilité d’être vivant et sans immunosuppresseur à 3 ans post-allogreffe était de 77% chez les patients de la cohorte BTZ et 56% dans la cohorte contrôle (p=0.046). Conclusion En conclusion, un entretien avec du BTZ post-allogreffe permet de diminuer l’incidence et la sévérité de la GVH chronique. Ceci devrait donc être considéré comme une option valide chez les patients avec un myélome multiple traités avec une allogreffe. / Background Allogeneic hematopoietic cell transplant (HCT) has curative potential in myeloma but remains hampered by high rates of relapse and chronic GVHD. The primary endpoint of this study was to determine if BTZ maintenance decreases the incidence and severity of chronic GVHD using NIH criteria. The secondary endpoints were to determine the immunosuppression burden, organ involvement and survival (OS, PFS) in patients receiving or not BTZ. Study Design In this retrospective study, we compared the outcome of 46 myeloma patients who received BTZ after upfront tandem auto-allo HCT to 61 patients without maintenance. We explored the impact of bortezomib (BTZ) maintenance on incidence and severity of chronic GVHD using the 2014 NIH criteria. Results At 2 years, incidences of overall (61.2% vs 83.6%, p=0.001) and moderate/severe chronic GVHD (44.5% vs 77.0%, p=0.001) were significantly lower in BTZ recipients who had less mouth (43% vs 67%, p=0.018) and eyes (9% vs 41%, p=0.001) involvement at initial diagnosis. We report a lower use of systemic steroids (45.1% vs 76.4%, p<0.001), mycophenolate mofetil (15.5% vs 28.2%, p=0.031) and tacrolimus (34.5% vs 70.6%, p<0.001) in BTZ recipients. Probability of being alive and off systemic immunosuppressants at 3 years was 77% in BTZ recipients and 56% in controls (p=0.046). Conclusion In summary, BTZ maintenance improved incidence and severity of chronic GVHD and should be considered as a valid option in myeloma patients receiving upfront tandem auto-allo HCT.

CD2 is a transmembrane molecule and a “non-canonical” member of the signaling lymphocyte activation molecule (SLAM) family of receptors that is expressed on T cells and NK cells. Its ligands, mouse CD48 and human CD58, are widely expressed on hematopoietic cells including antigen-presenting cells (APCs) and T cells. Previous studies indicated that CD2 promotes T-cell receptor (TCR) signaling when it is engaged by its ligands displayed on APCs. However, the supporting experimental data were rather controversial, and there is no general agreement about the role of CD2 in T cell activation. To study the function of CD2 and its ligands in T cells, we examined T cell functions in newly generated mouse strains lacking CD2 or CD48 in the C57BL/6 background. Compared to wild-type (WT) mice, T cells from CD2-deficient (“knock-out”; KO) mice had severe activation defects. Surprisingly, expression of CD48 on T cells, not on APCs, was also necessary for optimal T cell responses. We found evidence of CD2 interacted with CD48 in cis on T cells and observed their co-localization by confocal microscopy and fluorescence resonance energy transfer (FRET). The only exception was CD2-dependent cytotoxicity, which required CD48 both on T cells and on APCs. Mechanistic studies using mass spectrometry and structure-function analyses revealed that the cis interactions between CD2 and CD48 on T cells boosted TCR signaling, an effect that correlated with the capacity of CD2 to recruit the kinase Lck. Similarly, our further study revealed that the cis interactions between CD2 and CD58 on human T cells were also necessary for maximal TCR signaling and T cell activation. Taken together, our studies provide clear evidence that cis interactions between CD2 and its ligands on T cells are important in TCR signaling and T cell activation. Modulation of these cis interactions can be a promising approach to suppress or enhance T cell activation in a therapeutic setting. / CD2 est une molécule transmembranaire et un membre “ non-canonique ” de la famille de la famille SLAM (« signaling lymphocyte activation molecule ») exprimée à la surface des lymphocytes T et des cellules NK (« natural killer »). Les ligands de CD2, CD48 chez la souris et CD58 chez l’humain, sont exprimés de manière ubiquitaire sur les cellules hématopoïétiques, y compris sur les cellules présentatrices d’antigène (CPA) et lymphocytes T. Des études antérieures ont indiqué que CD2 est impliqué dans la signalisation des récepteurs TCR (« T-cell receptor ») en réponse à son engagement par CD48 sur le CPA; cependant, les données expérimentales qui supportent ce modèle sont plutôt contradictoires et aucun accord n’a été trouvé sur les rôle de CD2 dans l’activation de lymphocytes T. Pour étudier la fonction de CD2 et ses ligands, nous avons examiné les fonctions des lymphocytes T chez des souches de souris dépourvues de CD2 ou CD48 nouvellement générées à partir du “fond génétique” C57BL/6. Par rapport aux souris de type sauvage (WT; « wild-type »), les lymphocytes T de souris CD2-déficientes (« knock-out »; KO) présentent des sévères défauts d’activation. Il est intéressant de noter que l’expression de CD48 sur les lymphocytes T, mais non sur les CPA, était aussi nécessaire pour les réponses des lymphocytes T. Nous avons également démontré que CD2 interagit en cis avec CD48 sur les cellules T et avons observé leur co-localisation par microscopie confocale et FRET (« fluorescence resonance energy transfer) ». La seule exception était la cytotoxicité CD2- dépendante, qui nécessitait l’expression de CD48 à la fois sur les lymphocytes T et sur les CPA. L’étude des mécanismes par la spectrométrie de masse et les analyses structurefonction ont démontré que les interactions en cis entre CD2 et CD48 permettent de stimuler la signalisation du TCR, ce qui corrèle avec la capacité de CD2 à recruter la kinase Lck. De manière similaire, notre étude plus approfondie a démontré que les interactions en cis entre CD2 et CD58 sur les lymphocytes T humains sont nécessaires pour la signalisation maximale du TCR et l’activation cellulaire T. L’ensemble de nos études ont mis en évidence que les interactions en cis entre CD2 et ses ligands sur les lymphocytes T jouent un rôle important dans la signalisation du TCR et l’activation de ces cellules. La modulation de ces interaction en cis pourrait être une approche potentielle pour augmenter ou interférer avec l’activation des lymphocytes T dans un contexte thérapeutique.

La photochimiothérapie extracorporelle (PCE) est une immunothérapie autologue, basée sur la réinjection de cellules photochimiquement modifiées. La PCE a démontré son efficacité dans le traitement des formes avancées du CTCL, dans la GvHD ainsi que dans d’autres pathologies médiées par la présence de lymphocytes T pathogènes (rejets de greffes d’organes, pathologies auto-immunes), sans provoquer d’immunossupression généralisée. Bien qu’utilisée depuis de nombreuses années, les mécanismes d’action de la PCE restent peu connus. L’objectif de ma thèse était de les étudier et de mettre en place un modèle chez la souris pour permettre une optimisation des protocoles cliniques. Deux hypothèses ont été testées pour expliquer l’efficacité de la PCE : la mort « tolérogène » où l’effet obtenu serait lié à la génération de lymphocytes T régulateurs et la mort « immunogène » où l’effet pourrait s’expliquer par la génération de lymphocytes T cytotoxiques.L’utilisation de cellules mononucléées humaines obtenues chez des donneurs sains nous a permis de générer des lymphocytes T alloréactifs activés et de montrer que les lymphocytes T traités PUVA émettaient une partie des molécules dites de danger (DAMPs), décrites comme immunogènes, telles que la Calréticuline ou encore le HMGB1. Ces cellules sont phagocytées par les macrophages et les moDCs, mais ne sont pas capables d’induire leur maturation, ce qui n’engendre donc pas de stimulation du système immunitaire.L’utilisation d’un modèle murin de polyarthrite rhumatoïde (CIA) nous a permis de montrer l’efficacité de la PCE dans le traitement de cette pathologie. De plus, nos résultats montrent que l’efficacité du traitement repose sur la présence de lymphocytes T issus de souris « arthritique » dans l’échantillon traité.En conclusion, les mécanismes d’action de la PCE ne semblent pas être associés au concept de mort immunogène. Le modèle de polyarthrite rhumatoïde induite par le collagène chez la souris permettra de poursuivre l’étude des mécanismes d’action et d’optimisation de la PCE. / Extracorporeal photopheresis (ECP) is an autologous immunotherapy based on the reinfusion of photochemical modified mononuclear cells. ECP efficacy is demonstrated in treatment of CTCL, in GvHD and in others T-cell mediated diseases (organ transplant rejection and auto-immune diseases). ECP does not generate generalized immunosuppression. Although it has been used for years, mechanisms of action of ECP are not totally understood. The objective of my thesis was to study these mechanisms of action and set up a murine model to allow an optimization of the clinical protocols. Two hypotheses have been tested to explain the effectiveness of ECP: “Tolerogenic” cell death where the effect would be related to the generation of regulatory T lymphocytes and "immunogenic" death where the effect could be explained by the generation of cytotoxic T lymphocytes.The use of human mononuclear cells obtained from healthy donors enabled us to generate activated alloreactive T cells and to show that the PUVA-treated T-cells emitted a part of the danger molecules (DAMPs), described as immunogenic, such as Calreticulin or HMGB1. These cells are phagocytosed by macrophages and moDCs but do not induce their maturation, which does not therefore generate any stimulation of the immune system.The use of a murine model of rheumatoid arthritis (CIA) allowed us to show the effectiveness of PCE in the treatment of this pathology. Moreover, our results show that the effectiveness of the treatment is based on the presence of T lymphocytes derived from "arthritic" mice in the treated sample.In conclusion, the mechanisms of action of PCE do not seem to be associated with the concept of immunogenic death. The model of collagen-induced rheumatoid arthritis in mice will allow further study of the mechanisms of action and optimization of PCE.

Les lymphocytes T régulateurs (Treg) jouent un rôle majeur dans la modulation de l’alloréactivité après allogreffe de cellules souches hématopoïétiques et permettent notamment de contrôler la réaction du greffon contre l’hôte (GVH) dans des modèles expérimentaux. Le potentiel thérapeutique des Treg est donc très important dans ce domaine, mais aussi dans l’auto-immunité ou en cancérologie. Cependant, de nombreuses barrières rendent difficile l’élaboration de stratégies thérapeutiques reposant sur le transfert adoptif de Treg chez l’homme et une meilleure compréhension des facteurs et mécanismes contrôlant la prolifération et les capacités suppressives de ces cellules permettrait de les cibler directement et si possible spécifiquement in vivo.Dans ce travail, après avoir élaboré un nouveau système d’évaluation clinique de la GVH chez la souris et démontré sa simplicité, sa reproductibilité et sa performance, nous avons pu montrer que l’action suppressive des Treg dans la GVH dépendait de l’interaction entre le TNFα produit par les lymphocytes T conventionnels (Tconv) du donneur et le récepteur TNFR2 exprimé par les Treg. En effet, en bloquant cette interaction de 3 façons différentes, à savoir par un anticorps monoclonal bloquant anti-TNFR2, ou en utilisant soit des Treg n’exprimant pas TNFR2 soit des Tconv ne produisant pas de TNFα, nous avons à chaque fois montré que l’effet protecteur des Treg était aboli en l’absence du signal TNF. Le récepteur TNFR2 étant exprimé préférentiellement par les Treg par rapport aux Tconv, nos résultats ouvrent la voie au ciblage des Treg in vivo via TNFR2, soit pour activer ce récepteur par un agoniste et donc stimuler les Treg afin de contrôler la GVH, soit à l’inverse pour bloquer l’axe TNFα/TNFR2 par un antagoniste et ainsi inhiber les Treg, ce qui permettrait alors de lever un frein à l’alloréactivité dans les situations où l’on cherche à la stimuler pour renforcer l’effet anti-tumoral, comme par exemple dans le cas des rechutes post-allogreffe. / Regulatory T cells (Tregs) are key players involved in the modulation of alloreactivity after hematopoietic stem cell transplantation. Indeed, Tregs can prevent graft-versus-host disease (GVHD) in experimental models. Therefore, the therapeutic potential of these cells in GVHD is substantial, as it is in other fields like auto-immunity or oncology. However, many obstacles still make the application of cellular therapy strategies based on the adoptive transfer of Tregs in humans quite complicated. A better understanding of factors and mechanisms that control the proliferation and suppressive capacities of Tregs could allow for a direct and specific targeting of these cells in vivo.In this work, after designing a new clinical grading system for murine GVHD and demonstrating its ease of use, reproducibility and performance, we have shown that the suppressive action of Tregs in GVHD depends on the interaction between TNFα produced by donor conventional T cells (Tconvs) and TNFR2 expressed by Tregs. Using 3 different ways to block this interaction, i.e. with an anti-TNFR2 blocking monoclonal antibody, or Tregs that do not express TNFR2 or donor Tconvs that cannot produce TNFα, we were able to show in each situation that blocking TNF signaling resulted in a loss of protection by Tregs. TNFR2 being highly expressed by Tregs as compared with Tconvs, our results pave the way for in vivo targeting of Tregs through TNFR2, either to activate this receptor with an agonist and therefore stimulate Tregs to control GVHD, or to block the TNFα/TNFR2 axis with an antagonist and in this case inhibit Tregs, which could boost alloreactivity, as expected in some particular settings like post-transplant relapse.

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