Les maladies à Prions sont des maladies neurodégénératives fatales, touchant l'homme et l'animal. Même si le risque de transmission de la maladie de la vache folle à l'homme semble maîtrisé, il persiste actuellement un risque de santé publique lié à la transmission iatrogène de cette forme, notamment par transfusion sanguine. Pour contrôler cette transmission, il est donc essentiel de mieux comprendre les mécanismes moléculaires et cellulaires de réplication et de dissémination des Prions. Ces mécanismes de réplication se produisent à des échelles de temps et de taille difficilement accessibles expérimentalement, et ont ainsi fait l'objet de nombreuses modélisations théoriques utiles pour aider à la compréhension des mécanismes. L'objectif de cette thèse est de compléter ces modèles mathématiques, afin d'étudier plus spécifiquement les conséquences dynamiques sur la réplication des Prions, des propriétés de réplication taille-dépendante d'une part, et de l'hétérogénéité des cellules impliquées dans la réplication d'autre part. Dans un premier temps, nous avons généralisé un modèle de polymérisation nucléée pour prendre en compte un taux d'élongation des fibrilles dépendant de leur taille. Nous avons principalement déduit de cette étude que la distribution en taille des agrégats semble une donnée expérimentale très informative sur les mécanismes élémentaires de réplication, au contraire du profil cinétique d'accumulation de la PrPres peu sensibles aux propriétés de réplication taille-dépendantes. Dans un second temps, après une caractérisation expérimentale de l'hétérogénéité cellulaire de réplication, nous avons intégré le mécanisme de réplication intracellulaire à un modèle multicellulaire par automate cellulaire continu stochastique. De manière appliquée, cette étude nous a permis d'identifier des étapes du processus de culture cellulaire critiques pour l'établissement d'une infection chronique, et nous a permis de proposer plusieurs protocoles pour augmenter la sensibilité des cultures cellulaires aux infections à Prions. / Prion diseases are neurodegenerative, fatal and transmissible diseases, with no effective treatment. The risk of transmission of bovine spongiform encephalopathy to humans is now under control ; however the risk of human-to-human transmission of variant Creutzfeldt-Jakob disease via medical treatments (notably through blood transfusion) remains. Thus, understanding cellular and molecular mechanisms responsible for Prion replication and dissemination is critical to efficiently control Prion transmission. The mechanisms of Prion replication are poorly characterised and occur at time and size scale achieved experimentally with difficulty. Thus, mathematical models can help us understand prion multiplication by testing which mechanisms best fit to experimental data. Therefore the objectives of our study are to complete existing mathematical model in order to investigate the size-dependent replicative properties of prion aggregates and the cellular heterogeneity. Firstly, we have extended a previous study of the nucleated polymerization model to take into account size dependent replicative properties of prion aggregates. This is achieved by a choice of coefficients in the model that are not constant. Our results suggest that the size distribution of prion aggregates could be one of the most informative experimental data to study elementary replication mechanisms and to investigate strain phenomenon. Secondly, we have modelled the multicellular dynamics of prion replication by integrating intracellular replication (by nucleated polymerization) into a continuous and stochastic cellular automaton. The model formulation is based on an experimental characterisation of cellular heterogeneity. From an applicative point of view, this theoretical study has allowed us to propose several protocols to increase cell culture sensitivity to prion infection.

Ces travaux de recherche s’inscrivent dans le cadre du développement de nouvelles surfaces biocompatibles capables de contrôler l’adhésion d’agents pathogènes responsables de maladies neurodégénératives telles que les maladies de Creutzfeld Jacob, Alzheimer, Parkinson et Lewis. Deux axes de recherche ont été privilégiés. Notre approche se focalise en amont des dosages sur l’amélioration des procédures de stockage des prélèvements biologiques réalisés dans des tubes de type Eppendorf. Ces tubes en polypropylène induisent une perte du matériel génétique de plus de 70% accentuant la faible concentration en agent pathogène pour la détection immunoenzymatique. Dans le but de réduire les phénomènes indésirables d’adhésion des agents pathogènes à la surface des supports de stockage, deux voies de traitement ont été envisagées dans ce travail de thèse. La première consiste à modifier la surface du tube Eppendorf en une étape par décharge plasma fluoré, la seconde à créer de nouvelles surfaces hydrophiles en deux étapes couplant la technique des plasmas froids au greffage de polymères, les agents pathogènes pouvant être hydrophiles ou hydrophobes. Avec cette dernière technique, une voie originale a été abordée de part l’utilisation de solutions de greffage complexes composées à la fois de polymères et de molécules tensioactives. Les surfaces ainsi obtenues présentent une nano-structuration. Toutes les étapes de modification de la surface interne des tubes de stockage ont été caractérisées. Ces surfaces sont alors décrites selon leur caractère hydrophile ou hydrophobe grâce à la détermination des énergies de surface polaire et apolaire, selon leur charge de surface obtenue par mesure du potentiel d’écoulement, selon leur composition chimique déterminée par spectroscopie à photoélectrons X (XPS) et enfin selon leur topographie et leur rugosité relevées par microscopie à force atomique (AFM). Les interactions entre les groupements fonctionnels ainsi obtenus à la surface des tubes de stockage après les divers traitements et les protéines antigéniques considérées ont été interprétées en se référant aux différents modèles de l’adhésion pour des gammes de pH proches des protocoles biologiques usuels. Afin de s’assurer que ces nouvelles surfaces permettent bien une diminution de l’adhésion des agents infectieux sur la paroi interne des tubes de polypropylène, des analyses immunoenzymatiques ont été réalisées au sein des centres hospitaliers participant au projet STREP NEUROSCREEN n° LSHB-CT 2006-03 7719 (CRPP de Liège et CHU de Lyon). Ces analyses ont permis de montrer que la modification des surfaces entraîne une diminution de l’absorption des agents pathogènes jusqu'à 100% permettant ainsi une meilleure détection. / The research work presented in this thesis considers the development of newµbiocompatible surfaces that are able to control the adhesion of specific proteins responsible for the development of neurodegenerative diseases such as Creutzfeldt–Jakob, Alzheimer, Parkinson and Lewis body disease. Our approach was focused on problems prior to the detection step, which were never considered before, particularly on the improvement of Eppendorf tubes that are used for the storage of body fluids like cerebrospinal fluid and blood. Namely these tubes made of polypropylene induce the depletion of biological material, in some cases even over 70%, resulting in a low concentration of these proteins for the further immunoenzymatic detection. With the purpose to reduce the adhesion of specific proteins on the surface of supports, two courses of treatments were anticipated. The first one consists of surface modification by highly reactive fluorine plasma treatment and the second one incorporates development of new hydrophilic surfaces by coupling two techniques, plasma activation and subsequent grafting of polymer materials. With the latter approach, an original way of surface modification has been attained by using complex solutions of polymers and surfactants that permits controlled configuration of nanostructured surfaces. All steps of surface modifications were well characterized by different physicochemical methods. The surface hydrophilic/hydrophobic character was determined by measurements of polar and apolar surface energy, surface charge by magnitude of zeta potential, surface chemistry was evaluated by x-ray photoelectron spectroscopy (XPS), while the surface roughness and topography were monitored by atomic force microscopy (AFM). The interactions between functional groups of treated supports and proteins were interpreted referring to different models of adhesion established for a range of pH values close to the classical biological protocols. Finally, in order to validate that the new surfaces are able to prevent or decrease the adhesion of neurodegenerative agents on the surfaces of Eppendorf tubes, the immunoenzymatic analyses were carried out in hospital centres of partners that were participating to the project STREP NEUROSREEN n° LSHB-CT-2006-03 7719 (Centre de Recherche sur les Protéines Prion; Liege (ULG), Hospices Civils de Lyon (CHUL) and Lancaster University (L-UNI)). These analyses showed that the treatments led to a decrease of antigen adsorption up to 100%, enabling (allowing) better detection of pathogenic agents.

Les protéoformes désignent toutes les formes sous lesquelles une protéine peut être présente. Cela inclut les formes portant des modifications post-traductionnelles, les isoformes et les formes résultant d’épissages alternatifs. Ces modifications peuvent influer sur la fonction d’une protéine, d’où l’intérêt de développer des méthodes sensibles, spécifiques et robustes de quantification de protéoformes pour une meilleure compréhension de mécanismes pathologiques ou la recherche de biomarqueurs. L’objectif de ce travail a été d’exploiter les avantages de la spectrométrie de masse à haute résolution pour la caractérisation et la quantification de protéoformes de protéines associées à des maladies neurodégénératives. Nous nous sommes principalement intéressés à deux protéines, la C9ORF72 et l’alpha-synucléine. Dans un premier temps, une méthode de quantification des deux isoformes de la C9ORF72 a été développée et appliquée à une cohorte de 43 cerveaux humains comprenant des cas de démences fronto-temporale (DFT) avec ou sans mutation C9ORF72. Les résultats obtenus montrent pour la première fois par spectrométrie de masse une diminution d’environ 50% de l’isoforme longue de la C9ORF72 en présence de la mutation. Dans une seconde étape, nous avons élargi l’analyse à la quantification multiplexe de 49 protéines cérébrales potentiellement impliquées dans les DFT. En parallèle, nous nous sommes intéressés aux formes tronquées de l’alpha-synucléine. Leur quantification a été réalisée par une approche top-down dans des tissus cérébraux et une approche par bottom-up dans le liquide céphalorachidien (LCR). Enfin, l’analyse a été étendue à la quantification multiplexe de l’alpha-synucléine et de la protéine tau du LCR. / Proteoforms describe the complexity of protein forms. This includes forms with post-translational modifications, isoforms and forms resulting from alternative splicing. These modifications can influence the function of a protein, hence the interest in developing sensitive, specific and robust methods for the quantification of proteoforms for a better understanding of pathological mechanisms or biomarkers discovery. The objective of this work was to take advantage of high-resolution mass spectrometry for the characterization and quantification of proteoforms associated with neurodegenerative diseases. We mainly focused on two proteins, C9ORF72 and alpha-synuclein. First, a method for quantifying the two C9ORF72 isoforms was developed and applied to a cohort of 43 human brains including cases of frontotemporal dementia (FTD) with or without C9ORF72 mutation. The results obtained show for the first time by mass spectrometry a decrease of about 50% of the long isoform of C9ORF72 in the presence of the mutation. Then, we extended the analysis to the multiplex quantification of 49 brain proteins potentially involved in FTD. In parallel, we focused on the truncated forms of alpha-synuclein. Their quantification was performed by a top-down approach in brain tissue and a bottom-up approach in cerebrospinal fluid (CSF). Finally, the analysis was extended to the multiplex quantification of alpha-synuclein and tau protein in CSF.

Les gliomes sont les tumeurs cérébrales de l’adulte les plus fréquentes, dont l’étiologie reste encore largement inconnue. Plusieurs études épidémiologiques ont montré l’existence d’une corrélation entre maladies neurodégénératives et cancers cérébraux. Nous avons émis l’hypothèse qu’il existait des dénominateurs moléculaires communs entre ces pathologies. Je me suis particulièrement intéressé au rôle de la parkine (PK), une ubiquitine ligase responsable des formes génétiques de la maladie de Parkinson (MP). En effet, plusieurs arguments soutiennent l'implication de la PK dans les gliomes.Des études ont montré que la PK présente une expression altérée dans les cas de cancers du sein et de la prostate. La PK possède également une fonction de facteur de transcription. Elle est capable de se fixer à l’ADN de p53 et inhibe sa transcription. p53 est un suppresseur de tumeur fréquemment inactivé (50% des cancers). Une étude a mis en évidence l'existence de mutations somatiques de la PK spécifiques des cancers cérébraux. Mon projet s'est articulé autour de trois axes. 1- PK et Maladie d’Alzheimer. Elle active la transcription de la préséniline 1 et d’inhiber celle de la préséniline 2. 2- PK et MP. La PK par l’intermédiaire de p53 régule XBP-1, un facteur de transcription notamment activé par le stress du réticulum, qui à son tour régule l’expression de DJ-1. 3- PK et gliomes. Nous avons observé une diminution d’expression de la PK corrélé à l’augmentation d’expression de p53 dans des biopsies de gliomes. Nous avons alors montré que p53 est capable d’activer la synthèse de la PK, effet aboli par des mutations de p53 dans les gliomes. / Gliomas are the most common form of brain tumor, the etiology of which remains unknown. Several epidemiological studies have shown the existence of a correlation between neurodegenerative diseases and brain tumor. We hypothesis that these two pathology share common molecular denominators. Here I study the role of parkin (PK) an ubiquitin ligase responsible of early onset Parkinson diseases. Several arguments support the involvement of PK in glioma. Studies have shown that PK expression is alterated in many types of cancers. PK is also a transcription factor which can bind to p53 DNA and inhibits its transcription. P53 is a tumor suppressor often find inactivate in cancers (50%). There is evidence of specific somatic mutations found in glioma. My work was organize according to three axes 1- PK and Alzheimer disease: PK activates préséniline 1 expression and inhibits préséniline 2. 2- PK through XBP-1 regulates p53, a transcription factor activated by reticulum stress, which in turn regulates the expression of DJ-1. 3- PK and Glioma: There is a decrease in parkin expression that can be correlated to p53 expression increase in glioma biopsies. I show that p53 is able to activate PK synthesis, a mechanism abolish by p53 mutations in tumors.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal. / Les récepteurs du glutamate sont impliqués dans les maladies neurodégénératives telles que le dommage cérébral caractéristique des maladies de Huntington, Alzheimer et Parkinson, en plus d'être associés à l'ischémie, aux traumatismes crâniens, à l'encéphalopathie liée au SIDA et à l'épilepsie. Ils sont donc importants dans les mécanismes du système nerveux central et son bon fonctionnement. Parmi les récepteurs du glutamate, on retrouve le récepteur kaïnate. Ce mémoire présente une nouvelle approche synthétique des kaïnoïdes et la synthèse de trois nouveaux analogues des kaïnoïdes à partir de la trans-4-hydroxyproline. Les étapes comprennent la protection du carbonyle et de l'amine, l'oxydation de l'alcool, l'alkylation régiospécifique de la cétone en position 3, la formation d'un énol triflique, le couplage à un acide arylboronique et enfin la déprotection pour obtenir les acides (2S)-A-arylkaïniques. Les trois kaïnoïdes générés varient par le groupement aryle qui est soit le phényle, le 2-méthoxyphényle ou le 2-naphtyle.

Ce manuscrit détaille la stratégie utilisée par nos laboratoires pour identifier de nouvelles molécules neuroprotectrices pour le traitement curatif de la maladie de Parkinson (MP). La MP est une maladie neurodégénérative caractérisée par des symptômes moteurs invalidants qui résultent de la dégénérescence des neurones dopaminergiques (DA) des noyaux gris centraux. Précédemment, nos laboratoires ont synthétisé et identifié au cours d’un criblage 3 molécules chefs de file qui possèdent un effet neurotrophique sur les neurones DA embryonnaires. Des études préliminaires d’ADMEtox nous ont permis de sélectionner la molécule SF41, un dérivé 6-aminoquinoxaline, pour une première évaluation de l’effet neuroprotecteur in vivo de nos molécules. En effet, cette molécule est bien tolérée chez l’animal et, administrée par voie orale, elle est capable de traverser la BHE. SF41 a montré un faible effet protecteur vis-à-vis des fibres DA dans un modèle animal de la MP. Dans le but d’augmenter l’activité neurotrophique de cette molécule, une 50ène de dérivés de seconde génération ont été synthètisés et criblés in vitro dans un modèle de mort spontanée des neurones DA. Ce criblage nous a permis d’identifier 5 molécules lead plus puisssantes et efficaces que SF41. Ces molécules, qui possédent les mêmes propriétés physico-chimiques que SF41, pourraient également atteindre le système nerveux central et ainsi conduire à un effet neuroprotecteur marqué dans un modèle animal de la MP. De plus, ces molécules possèdent un profil pharmacologique intéressant car elles sont capables d’empêcher la mise en place de mécanismes qui peuvent potentiellement contribuer à la mort des neurones DA dans la MP (stress oxydant, stress médié par les astrocytes, dyshoméostasie calcique, stress médié par la diminution en facteur trophique…). Une étude préliminaire avec la molécule PAQ, l’une de ces 5 molécules, a permis d’obtenir un effet neuroprotecteur dans un modèle in vivo de la MP qui semble supérieur à celui de la molécule SF41. Ces résultats encourageants nous donnent bon espoir d’obtenir la preuve de concept de l’activité neuroprotectrice de nos dérivés 6-aminoquinoxaline. / This manuscript describes the strategy used by our laboratories to identify new neuroprotective molecules for the therapy of Parkinson disease (PD). PD is a neurodegenerative disease characterized by disabling motor symptoms resulting from the degeneration of dopaminergic (DA) neurons of the basal ganglia. Previously, our laboratories have synthesized and identified in a screening 3 lead compound which exhibited a neurotrophic effect on embryonic midbrain DA neurons. Preliminary ADMEtox studies allowed us to select the molecule SF41, a 6-aminoquinoxaline derivative, for a first in vivo evaluation of the neuroprotective effect of our molecules in an animal model of PD. Indeed, SF41 is well tolerated in animals and is able of crossing the BBB after oral treatment. SF41 showed a weak protective effect on DA fibers in an animal model of PD.In order to increase the neurotrophic activity of this molecule, around fifty second generation derivatives were synthesized and screened in vitro in a model of spontaneous death of DA neurons. This screening allowed us to identify five lead compounds more powerful and effective than SF41. These molecules, which possess the same physico-chemical properties that SF41, could also reach the central nervous system and lead to a marked neuroprotective effect in an animal model of PD. In addition, these molecules have an interesting pharmacological profile because they are able to prevent the establishment of mechanisms that can potentially contribute to the death of DA neurons in PD (oxidative stress, stress mediated by astrocytes, calcium dyshomeostasis, stress mediated by trophic factor deprivation...).A preliminary study with the molecule PAQ, one of these five molecules, yielded a neuroprotective effect in animal model of PD that seems higher than with SF41. These encouraging results give us hope to achieve proof of concept of the neuroprotective activity of our 6-aminoquinoxaline derivatives.

De plus en plus de preuves montrent que le transport axonal rapide (FAT) joue un rôle crucial au cours des maladies neurodégénératives (NDs). La maladie de Huntington est une maladie neurodégénérative causée par une expansion anormale de polyglutamines dans la partie Nterminale de la protéine huntingtine (HTT) : une grande protéine d’échafaudage impliquée dans la régulation du transport. La présence de HTT mutante comme l’absence de la HTT induisent des défauts de transport chez les mammifères. Chez la Drosophile, la HTT mutante reproduit le phénotype observée chez les mammifères, cependant la fonction conservée de la HTT chez la Drosophile melanogaster (DmHTT) n’est pas encore clairement établie. Ici nous mettons en évidence que DmHTT s’associe aux vésicules, aux microtubules et intéragit avec la proteine dynéine. Dans les neurones corticaux de rat, DmHTT remplace partiellement la HTT de mammifère dans le transport axonal rapide, et les drosophiles invalidées pour la HTT montrent des défauts de transport axonal in vivo. Ces résultats suggèrent que la fonction de la HTT est conservée dans le modèle Drosophile.Le FAT est un processus qui requiert un apport constant d’énergie. Les mitochondries sont les principales sources de production d’ATP de la cellule. Cependant nous avons démontré que le FAT ne dépend non pas de cette source d’énergie là, contrairement à ce que l’on pensait, mais de l’ATP glycolytique produit par les vésicules. La dérégulation de GAPDH ou de PK, les deux enzymes glycolytiques productrices d’ATP, ralentit le transport vésiculaire. Néanmoins, l’invalidation de GAPDH n’affecte pas le transport mitochondrial. En outre, toutes les enzymes glycolytiques sont associées à des vésicules dynamiques et sont capables de produire leur propre ATP. Enfin nous montrons que l’ATP produit est suffisant pour assurer leur propre transport, prouvant l’autonomie énergétique des vésicules pour le transport. / Growing evidence support the idea that impairments in Fast Axonal Transport (FAT) play a crucial role in Neurodegenerative Diseases (NDs). Huntington’s Disease is neurodegenerative disorder caused by an abnormal polyglutamine expansion in the N-Terminal part of huntingtin (HTT), a large scaffold protein implicated in transport regulation. Both the presence of the mutated HTT as the loss of HTT leads to transport defects in mammals. In the fruit fly overexpression of the mutant HTT recapitulates the phenotype observed in mammals. However, it is still unclear whether HTT’s function is conserved in D. melanogaster. Here, we show that D. melanogaster HTT (DmHTT) associates with vesicles, microtubules, and interacts with dynein. In rat cortical neurons, DmHTT partially replaces mammalian HTT in fast axonal transport, and DmHTT KO flies show axonal transport defects in vivo. These results suggest that HTT function in transport is conserved in D. melanogaster.FAT is a process that requires a constant supply of energy. Mitochondria are the main producers of ATP in the cell. However, we have demonstrated that FAT does not depend on this source of energy, as previously thought, but it depends on glycolytic ATP produced on vesicles. Perturbing GAPDH or PK, the two ATP generating glycolytic enzymes, slows down vesicular transport. However, knocking down GAPDH does not affect mitochondrial transport. Furthermore, all of the glycolytic enzymes are associated with dynamic vesicles, and are capable of producing their own ATP. Finally, we show that this ATP production is sufficient to sustain their own transport, demonstrating the energetical autonomy of vesicles for transport.

Caractérisé par le déclin progressif et irréversible des fonctions biologiques vitales, le vieillissement est un processus biologique complexe qui s’accompagne souvent par l’apparition de maladies neurodégénératives. D’ici 2050, plus de 1.5 milliards de personnes dans le monde seront définies comme vieillissantes. L'amélioration de la qualité de vie des personnes âgées constitue donc un enjeu majeur pour notre société. Encore mal connue, la dégradation progressive du métallome est associée au vieillissement et à l’apparition de maladies neurodégénératives et en est probablement l’une des causes. L’objectif de cette étude est de mieux caractériser l'évolution du métallome chez deux modèles animaux au cours du temps i.e. la souris et le vers ainsi que chez l’humain atteint de sclérose latérale amyotrophique (SLA). Pour ce faire, nous avons analysé une vingtaine d'éléments traces et majeurs ainsi que les compositions isotopiques du cuivre (δ65Cu) et du zinc (δ66Zn) d’organes de souris, de différentes souches de nématodes, et de liquides céphalo-rachidiens (LCRs) humains. L’analyse des organes de souris montre que d’importants dérèglements chimiques et isotopiques se développent dans l’organisme avec l’âge, chaque organe ayant sa propre signature élémentaire et isotopique. On observe par exemple une hausse de la concentration en Cu dans le cerveau associée à une diminution de δ65Cu dans le foie au cours du vieillissement. Grâce à l’analyse métabolomique et à l’utilisation de mélanges isotopiques, nous montrons que ces variations pourraient s’expliquer par des dysfonctionnements physiologiques et métaboliques majeurs comme des dérèglements de flux hépatique et/ou la dégradation de la barrière hémato-encéphalique avec l’âge. Cela suggère que l’analyse temporelle du métallome pourrait être un marqueur de l’âge biologique. L’analyse de nématodes a révélée qu’un animal génétiquement modifié pour vivre plus longtemps se distinguait des autres nématodes à plus courte durée de vie par une baisse de sa concentration et de sa composition isotopique en Cu dès son plus jeune âge. Le suivi temporel de ces biomarqueurs devrait permettre de détecter un vieillissement précoce. Finalement, l’analyse de LCRs de patients atteints de SLA, une maladie neurodégénérative sévère pour laquelle il n’existe aucun biomarqueur ni traitement, montre qu’une personne atteinte de SLA se distingue de sujets sains et de patients touchés par la maladie d’Alzheimer par des compositions isotopiques en Cu plus positives. Cette spécificité, laissant entrevoir de nouvelles perspectives concernant l’identification de biomarqueurs spécifiques de la SLA, pourrait s'expliquer par la formation d’agrégats protéiques toxiques dans le cerveau. / Characterized by the progressive and irreversible decline of vital biological functions, ageing is a complex biological process that often comes with neurodegenerative disorders. In 2050, more than 1.5 billion elderly are expected in the world. Improve the quality of life of these ageing people is therefore a major challenge for our society. Still poorly known, the progressive degradation of the metallome is asscociated with ageing and neurodegenerative diseases development and is probably one of their causes. The objective of this study is to better characterize the metallome evolution in two animal models over time i.e. the mouse and the worm as well as in human affected by amyotrophic lateral sclerosis (ALS). To do this, we analyzed twenty trace and major elements as well as the isotopic compositions of copper (δ65Cu) and zinc (δ66Zn) of mouse organs, different strains of nematodes, and human cerebrospinal fluid (CSFs).The analysis of mouse organs shows that important chemical and isotopic changes develop in the body over time, each organ having its own elemental and isotopic signature. For example, we observe an increase of the Cu concentration in the brain associated with a decrease of the δ65Cu in the liver over time. Based on the analysis of metabolomic parameters and the use of isotopic mixings, we show that these variations may be explained by major physiological and metabolic dysfunctions, such as the deregulation of hepatic fluxes and/or the degradation of the blood-brain barrier with age. This suggests that the temporal analysis of the metallome could be used as a potential marker of the biological age.The analysis of nematodes revealed that long-lived animals differ from short-lived nematodes by an early-age decrease in their Cu isotopic composition and Cu concentration. The temporal monitoring of these biomarkers could therefore be used to detect premature ageing conditions.Finally, the analysis of CSFs of patients with amyotrophic lateral sclerosis (ALS), a severe neurodegenerative disease for which there is currently no reliable biomarker or treatment, shows that ALS patients have a higher δ65Cu compared to healthy subjects and Alzheimer’s disease patients. This feature, offering new perspectives to identify ALS-specific biomarkers, may be explained by the formation of toxic protein aggregates in the brain.

Les encéphalopathies spongiformes transmissibles sont des maladies neurodégénératives caractérisées par une vacuolisation intense et une perte neuronale associées à l’accumulation d’une protéine prion pathologique : la PrPSc. A cause de la longue période d’incubation silencieuse de ces maladies, les individus souffrant d’une maladie à prions peuvent exposer des patients qui recevraient leur sang ou un de leurs organes à un risque de contamination iatrogène. De plus, lorsque le diagnostic survient, les dommages cérébraux sont souvent massifs, et l’issue toujours fatale. A ce jour, aucun traitement n’est disponible, et l’ensemble des stratégies testées a échoué.L’alternative développée par le laboratoire est celle de la thérapie cellulaire couplée à la thérapie génique, en utilisant des cellules souches embryonnaires (ES) délivrant des molécules anti-prions. Concernant le choix des molécules anti-prions, nous avons choisi les mutants PrP-DN. Notre hypothèse repose sur des études montrant qu’une lysine au codon 219 de la PrP chez l’Homme ou une arginine au codon 171 de la PrP ovine, protègent du développement d’une ESST. L’étude de ces mutants, en cellules infectées ou dans des souris transgéniques, a permis de montrer que les PrP mutées n’étaient pas converties en PrPSc et qu’elles exerçaient un effet protecteur dit « dominant négatif » sur la conversion de la PrPC sauvage en PrPSc.Un des projets du laboratoire avait donc pour objectif d’utiliser les cellules souches exprimant les mutants PrP-DN pour développer une stratégie de thérapie génique et cellulaire des maladies à prions : l’hypothèse étant que les cellules greffées pourraient non seulement réparer le tissu lésé mais que ce dernier serait également protégé de l’infection par les prions.Une première approche de thérapie génique et cellulaire avait été initiée au laboratoire et montrait des résultats plutôt encourageants. En effet, la greffe de cellules souches neurales murines exprimant des PrP-DN et produites à partir de cellules souches embryonnaires murines, conduisait, pour une partie des souris, à un allongement du temps d’incubation de la maladie, ainsi qu’à une diminution de l’astrogliose et de la vacuolisation.Dans ce contexte, le premier objectif de ma thèse a été de valider l’approche thérapeutique en montrant que les cellules greffées délivraient des mutants PrP-DN capables d’inhiber la réplication du prion. Nous avons opté pour un modèle de culture organotypique infectée par des prions murins. En plus de répondre aux exigences éthiques de la directive 2010/63/UE, ce modèle offre l’avantage de pouvoir réaliser plus d’essais, des cinétiques d’accumulation de PrPSc et de visualiser le devenir des cellules greffées. Enfin, opter pour cette stratégie permettait de transposer dans un modèle humanisé des travaux précédemment réalisés et ayant montré des résultats encourageants. Pour cela, il a été nécessaire de mettre en place un modèle prion ex vivo de culture organotypique de tranches de cerveau, dans lequel il était possible de réaliser des greffes et permettant d’évaluer l’effet inhibiteur des mutant-PrP-DN sur la réplication du prion. Par ailleurs, notre groupe fait partie, avec d’autres groupes travaillant avec des cellules souches mésenchymateuses, de l’équipe « Biologie des cellules souches et médecine régénératrice », il nous est apparu pertinent d’évaluer l’effet des MSC sur la pathologie prions dans des modèles prions en culture organotypique et en particulier d’évaluer l’impact de greffes de MSC concomitantes aux greffes de NSC-PrP-DN. En effet, ces cellules sont décrites comme pouvant induire un microenvironnement neuroprotecteur en limitant la prolifération des cellules de la microglie et des astrocytes, et peuvent favoriser la différenciation des NSC. Enfin notre dernier objectif visait à transposer les outils murins vers des outils « humains » en produisant des NSC humaines issues d’ES et exprimant une PrP humaine portant les mutations DN. / Transmissible spongiform encephalopathies are neurodegenerative diseases characterized by a strong vacuolization, a neuronal lost and deposits of prion pathologic protein: PrPSc. This PrPSc accumulation is the result of the conformational conversion of the host encoded endogenous PrPC protein. Although the incidence of these diseases in humans remains low (about one to two cases per million inhabitants per year), these diseases remain a public health problem. Indeed, because of their long and silent incubation period, patients with prion disease may expose people through blood transfusion or organ transplantation with a risk of iatrogenic contamination. In addition, when the diagnosis occurs, brain damage is often massive, and the outcome is always fatal and rapidly occurs. Until now, there is no treatment that could be proposed to patients.The alternative developed by our laboratory for several years, is a strategy of cell therapy coupled with gene therapy. The general objective is to use pluripotent embryonic stem cells (ESC) and graft them as a “medicine” not only to orchestrate a functional recovery of the damaged zones and protect the grafted cells from prion propagation but also to deliver anti-prion molecules.For the anti-prion molecules, we have chosen dominant negative PrP mutants (PrP-DN). Our choice is based on studies showing that a lysine at codon 219 of the human PrP or an arginine at codon 171 of the ovine PrP protect against the development of a TSE. Study of these mutants in infected cells or in transgenic mice showed that the mutated PrPC were not converted into PrPSc. Moreover, they exibit a so-called "dominant negative" protective effect on the conformational conversion of their wild-type PrPC counterparts. A first approach of gene and cell therapy was initiated in the laboratory and has shown encouraging results. Indeed, the graft of murine neural stem cells (NSC) derived from murine embryonic stem cells and expressing anti-prion molecules, has allowed, for some of the mice, to an increase the incubation time of the diseaseas well as to a decrease of astrogliosis and vacuolization.In this context, the first objective of my thesis was to validate the therapeutic approach by showing that the grafted cells were able to inhibit prion replication trough the dominant negative effect of the PrP-DN. To address this point, we have chosen to use an organotypic culture model infected with murine prions (22L strain). In addition to fill the ethical requirements under the European Directive 2010/63 and the 3Rs, organotypic culture models offer the advantage to perform and repeat experiments, kinetic tests, and PrPres analysis. This model also allows to visualize the fate of the grafted cells. Finally, by choosing this strategy, it will be possible to transpose into a humanized model the work previously performed on mouse organotypic cultures.To achieve this task, it was necessary to establish an ex vivo prion model of organotypic culture brain slices, in which it was possible to perform grafts and to evaluate the inhibitory effect of PrP-DN mutants on the prion replication.In addition, as our group is included in the team "Stem cell biology and regenerative medicine" (led by Pr Jorgensen) in which several stem cells are studied (liver stem cells and mesenchymal stem cells (MSC)) and because MSC have been shown to provide protective effects when grafted in the brain of mice with neurological diseases, it was therefore relevant to evaluate the effect of MSC on prion pathology in our prion models and in particular to evaluate the impact of concomitant MSC grafts on NSC-PrP-DN.In a last step, our goal was to transpose the mouse tools (NSC from ES and expressing the PrP-DN mutants) to "human" tools by producing human NSCs derived from human ESC and expressing human PrP-DN, and to characterized the resulted cells.

Les lysosomes sont importants pour la survie et la fonction des cellules du système nerveux central et en particulier des neurones. Le mécanisme de la reformation des lysosomes est crucial pour maintenir une quantité adéquate de lysosomes fonctionnels dans les cellules. La spatacsine, qui joue un rôle dans le ce mécanisme est impliquée dans la paraplégie spastique de type SPG11 ; une maladie caractérisée par des troubles moteurs et cognitifs sévères. L’utilisation de modèles cellulaires de cette pathologie permet d’étudier les mécanismes physiopathologiques à l’origine d’altérations de la reformation des lysosomes. J’ai montré que la perte de fonction de la spatacsine est responsable de l’accumulation de lipides dans les lysosomes. Ces accumulations sont constituées de gangliosides et de cholestérol et sont présentes dans les autolysosomes perturbant leur recyclage en lysosomes, notamment en empêchant le recrutement de protéines impliquées dans le mécanisme. Les accumulations de gangliosides rendent les neurones à l’exposition au glutamate ce qui suggère que ces altérations pourraient avoir un rôle dans la neurodégénérescence. J’ai aussi montré que l’absence de spatacsine provoque une dérégulation de l’import de Ca2+ extracellulaire par le « store-operated calcium entry » ce qui conduit à altération de l’homéostasie calcique. L’inhibition de l’import de calcium par le SOCE permet de réduire les accumulations de lipides et de rétablir partiellement le recyclage des lysosomes. Ainsi, l’absence de spatacsine induit une altération de l’homéostasie calcique qui participe à l’accumulation de lipides dans le système lysosomal ce qui est délétère pour la survie des neurones. / Lysosomal dysfunctions are involved in a large number of neurodegenerative diseases highlightingthe crucial function of lysosomes in neuron survival and function. The mechanism of lysosomereformation from autolysosomes allow cells to maintain the ool of functional lysosomes.Disruptions of this rocess are involved in athologies affecting the central nervous system. Inparticular, spatacsin that lays a role in lysosome recycling is implicated in hereditary spasticparaplegia type SPG11, a severe disease characterized by motors and cognitive alterations. Thispathology is caused by loss of function mutations in SPG11, encoding spatacsin. The study ofSPG11 cellular models gives the opportunity to decipher the hysiopathological mechanismsunderlying lysosomal reformation disruptions.During my thesis, I showed that loss of spatacsin function induces lipid accumulation in lysosomesand articularly in autolysosomes both in fibroblasts and neurons from Spg11-/- mice. Gangliosidesand cholesterol are among lipids that accumulate in autolysosomes impairing lysosomal membranerecycling by disrupting the recruitment of keys roteins. Neurons with ganglioside accumulationsare more sensitive to glutamate induced neuronal death, suggesting that these accumulations areinvolved in neurodegeneration. These results could be of great importance since accumulations ofgangliosides in lysosomes arise in many diseases.I also showed that loss of spatacsin disrupts extracellular calcium import by the store-operatedcalcium entry (SOCE) leading to an increase in cytosolic calcium levels. Lysosomal calcium contentis also increased in Spg11-/- cells and calcium release from lysosome by TRPML1 is reduced.Inhibiting SOCE and stimulating lysosomal calcium release by TRPML1 reduced lipidsaccumulations in lysosomes and artially restored lysosome reformation.Our data suggest that absence of spatacsin is responsible for a disruption of calcium homeostasisthat contributes to lipid accumulation in autolysosomes, disturbing reformation of lysosomes fromautolysosomes. Inhibiting gangliosides synthesis could be used as a therapeutic strategy. However,understanding how loss of function of spatacsin alters these cellular athways will allow thedevelopment of targeted therapeutic approaches.