Les bactériophages (ou phages) sont des prédateurs de bactéries et sont redoutés dans les productions agro-alimentaires mettant en œuvre des fermentations. En œnologie, la transformation du jus de raisin en vin fait appel à différents types de fermentation. La fermentation alcoolique est réalisée par des levures, et peut être suivie par une fermentation malolactique (FML), notamment pour les vins rouges, afin d’améliorer la stabilité microbiologique et les qualités organoleptiques du produit. La bactérie lactique OEnococcus oeni (O. oeni) appartient à la famille des Leuconostocaceae et est l’acteur principal de la FML. Des souches d’O. oeni sont utilisées comme levain malolactique, et inoculées dans le vin pour mieux maitriser les fermentations. O. oeni rencontre dans son environnement des phages spécifiques appelés oenophages. Toutefois, bien que la présence de ces oenophages ait été constatée, leur diversité reste à ce jour peu explorée, tout comme leurs implications dans l’élaboration du vin. Une fréquence élevée de la lysogénie a été observée dans l’espèce et parmi les levains commercialisés. Les risques associés a la présence de phages ou à la lysogénie sont des paramètres peu abordés dans la filière. Afin de répondre à ces interrogations, dans un premier axe, la diversité des oenophages a été étudiée en isolant des phages à partir d’une large collecte d’échantillons œnologiques menée dans le sud-ouest de la France. L’analyse d’échantillons de différents types de vin, de différents cépages, collectés à différentes étapes de la vinification nous a permis de mettre en lumière une diversité génomique des oenophages non suspectée. Nous avons initié le développement de nouveaux outils moléculaires pour étudier la dynamique des populations bactériennes et phagiques dans le contexte œnologique. Ainsi, une première approche par Digital Droplet PCR a été utilisée pour détecter et quantifier les populations lysogènes. Dans un deuxième axe, l’interaction phage-hôte en présence de composés phénoliques du vin a été étudiée. Les travaux suggèrent que la croissance d’O. oeni en présence de certains flavonols et acides phénoliques réduit la capacité d’adsorption des phages sur leur hôte. / Bacteriophages are viral predators of bacteria and a major concern in fermentations involved in food processing industry. In winemaking, transformation of grape juice into wine involves different types of fermentations. Alcoholic fermentation is driven by yeasts, and can be followed by malolactic fermentation (MLF), especially for red wines, which can improve microbial stability and sensorial quality of wine. The lactic acid bacterium OEnococcus oeni (O. oeni), member of Leuconostocacae family, is generally responsible for the MLF process. Strains of O. oeni are also used as starters to master MLF. O. oeni encounters specific phages called oenophages. Even though the presence of oenophages has been observed, their diversity remains poorly investigated, just like their implications in winemaking. However, high frequency of lysogeny has been observed among O. oeni strains and starters. Risks linked with the presence of phages and lysogeny are questioned in the sector. In the first part of this thesis, oenophages diversity has been studied with the isolation of a large number of phages during the collection of a broad range of oenological samples in South West France. Analysis of samples coming from different wine types and varieties, collected at different steps of winemaking enabled us to highlight an underestimated genomic diversity. We also initiated the development of new molecular tools to study population dynamics among phages and hosts in the winemaking context. Thus, a first approach by Digital Droplet PCR has been used to detect and quantify lysogenic strains. In the second part, phage-host interactions in the presence of wine phenolic compound were investigated. Our results suggest that growth of O.oeni cells in the presence of particular flavonols and phenolic acids reduces adsorption capacities of phages on their host.

Thesis (PhD)--University of Stellenbosch, 2011. / ENGLISH ABSTRACT: During winemaking, a number of biochemical changes occur as a result of the metabolic activity of wine lactic acid bacteria (LAB) associated with malolactic fermentation (MLF). The latter process, which occurs mostly after alcoholic fermentation by wine yeasts, involves the conversion of L-malate to L-lactate and CO2, thus resulting to wine acidity reduction, microbiological stabilization and alterations of wine organoleptic quality. Although Oenococcus oeni is predominantly the most preferred species suitable for carrying out MLF in wine owing to its desirable oenological properties, Lactobacillus plantarum has also been considered as a potential candidate for MLF induction. Other species in the genera of Lactobacillus and Pediococcus are often associated with wine spoilage. These microorganisms induce wine spoilage by producing off-flavours derived from their metabolic activity. It is therefore of paramount importance to understand the mechanism by which wine microbiota cause spoilage. The purpose of this study was to investigate the presence of genes encoding enzymes of oenological relevance in wine-associated LAB strains. In order to achieve this, different sets of specific primers were designed and employed for a wide-scale genetic screening of wine LAB isolates for the presence of genes encoding enzymes involved in various metabolic pathways, such as citrate metabolism, amino acid metabolism, hydrolysis of glycosides, degradation of phenolic acids as well as proteolysis and peptidolysis. PCR detection results showed that the majority of the tested strains possessed most of the genes tested for. It was also noted that, among the O. oeni strains tested for the presence of the pad gene encoding a phenolic acid decarboxylase, only two strains possessed this gene. None of the O. oeni strains has previously been shown to possess the pad gene, and this study was the first to report on the presence of this gene in O. oeni strains. In an attempt to genetically characterize this putative gene, DNA fragments from the two positive O. oeni strains were sequenced. The newly determined sequences were compared to other closely related species. Surprisingly, no match was found when these sequences were compared to the published genomes of three O. oeni strains (PSU-1, ATCC BAA-1163 and AWRI B429). This reinforced a speculation that the pad gene in these two strains might have been acquired via the horizontal gene transfer. In addition, it remains to be further determined if the presence of this gene translates to volatile phenol production in wine. In this study, a novel strain isolated from South African grape and wine samples was also identified and characterized. The identification of this strain was performed through the 16S rDNA sequence analysis, which indicated that this strain belongs to Lactobacillus florum (99.9% sequence identity). A novel PCR assay using a species-specific primer for the rapid detection and identification of Lb. florum strains was also established. For further characterization, this strain was also investigated for the presence of genes encoding enzymes of oenological relevance. PCR detection results indicated that the Lb. florum strain also possess some of the genes tested for. In addition to genetic screening of wine LAB isolates for the presence of different genes, this study was also aimed at evaluating the regulation of the mleA gene encoding malate decarboxylase in three oenological strains of O. oeni. The regulation of this gene was tested in a synthetic wine medium under various conditions of pH and ethanol. From the expression analysis, it was observed that the mleA gene expression was negatively affected by high ethanol content in the medium. On the other hand, low pH of the medium seemed to favour the expression of this gene as the mleA gene expression was more pronounced at pH 3.2 than at pH 3.8. The findings from this study have shed more light on the distribution of a wide array of enzyme-encoding genes in LAB strains associated with winemaking. However, it remains unknown if the enzymes encoded by these genes are functional under oenological conditions, given that wine is such a hostile environment encompassing a multitude of unfavourable conditions for the enzymes to work on. Evaluating the expression of these genes will also help give more insights on the regulation of the genes under winemaking conditions. / AFRIKAANSE OPSOMMING: Gedurende wynmaak, sal 'n aantal biochemiese veranderinge plaasvind as gevolg van die metaboliese aktiwiteit van wyn melksuurbakterieë (MSB) wat betrokke is by appelmelksuurgisting (AMG). Die laasgenoemde proses, wat meestal na alkoholiese fermentasie deur wyngiste plaasvind, behels die omskepping van L-malaat na L-laktaat en CO2, om sodoende die wyn se suur te verminder, mikrobiologiese stabiliteit en verandering van wyn organoleptiese kwaliteit. Alhoewel Oenococcus oeni hoofsaaklik die mees gewenste spesies is wat geskik is vir die uitvoering van AMG in wyn weens sy geskikte wynkundige eienskappe, Lactobacillus plantarum word ook beskou as 'n potensiële kandidaat vir AMG induksie. Ander spesies in die genera Lactobacillus en Pediococcus word dikwels geassosieer met wynbederf. Hierdie mikro-organismes veroorsaak wynbederf deur die produksie van wangeure as gevolg van hul metaboliese aktiwiteite. Dit is dus van kardinale belang dat die meganisme van die wynbederf verstaan word. Die doel van hierdie studie was om die teenwoordigheid van koderend ensieme gene van wynkundige belang in wynverwante MSB stamme te ondersoek. Ten einde dit te bereik, was verskillende stelle van spesifieke peilers ontwerp en toegepas vir 'n groot skaal se genetiese toetsing van wyn MSB isolate vir die teenwoordigheid van ensiemkoderende gene betrokke by verskeie metaboliese paaie, soos sitraat metabolisme, aminosuur metabolisme, hidrolise van glikosiede, agteruitgang van fenoliese sure sowel as proteolise en peptidolise. PKR opsporings resultate het getoon dat die meerderheid van die stamme getoets, die meeste van die gene getoets voor besit. Dit is ook opgemerk dat, onder die O. oeni stamme getoets vir die teenwoordigheid van die pad geen, slegs twee stamme hierdie geen besit. Geen O. oeni stamme het voorheen gewys dat hul die pad geen besit, en hierdie studie was die eerste bewys oor die teenwoordigheid van hierdie geen in O. oeni stamme. In 'n poging om die geen geneties te karakteriseer, is DNA-fragmente van die twee positiewe O. oeni stamme se sekwens volgorde bepaal. Die DNA volgorde is vergelyk met ander nouverwante spesies. Verrassend, was geen passende DNA volgorde gevind met die gepubliseerde genome van drie O. oeni stamme (PSU-1, ATCC BAA-1163 en AWRI B429) nie. Dit versterk die spekulasie dat die pad geen in hierdie twee stamme via die horisontale geen-oordrag verkry is. Verder moet dit nog bepaal word of die teenwoordigheid van hierdie geen lei na vlugtige fenol produksie in wyn. In hierdie studie, is ongeïdentifiseerde stam geïsoleerd van Suid-Afrikaanse druiwe en wyn monsters ook geïdentifiseer en karakteriseer. Die identifisering van hierdie stam is uitgevoer deur middel van die 16S rDNA volgorde analise, wat aangedui het dat hierdie stam behoort aan Lactobacillus florum (99.9% volgorde identiteit). PKR toetse met behulp van die spesie-spesifieke peiler vir die vinnige opsporing en identifikasie van Lb. florum stamme is ook ontwikkel. Vir verdere karakterisering, was hierdie stam ook ondersoek vir die teenwoordigheid van koderende ensiem gene van wynkundige belang. PKR opsporings resultate het aangedui dat die Lb. florum stam ook oor 'n paar van die gene getoets voor besit. Bykomend tot genetiese toetsing van wyn MSB isolate vir die teenwoordigheid van verskillende gene, het die studie ook die evaluering van die regulering van die mleA geen, kodering malaatdekarboksilase in drie wyn stamme van O. oeni. Die regulering van hierdie geen was getoets in die sintetiese wynmedium onder verskillende pH en etanol kondisies. Van die uitdrukkingsresultate, is daar waargeneem dat die mleA geenuitdrukking is negatief geraak deur hoë etanol-inhoud in die medium. Aan die ander kant, in die lae pH medium was die uitdrukking van hierdie geen bevoordeel by pH 3.2 as by pH 3.8. Die bevindinge van hierdie studie het meer lig gewerp op die verspreiding van die wye verskeidenheid van ensiem-koderende gene in MSB stamme wat verband hou met wynmaak. Dit bly egter steeds onbekend of die ensieme gekodeer deur hierdie gene funksioneel is onder wynkondisies, gegewe dat wyn so 'n vyandige omgewing is menigte ongunstige toestande vir die werking van ensieme. Evaluering van die uitdrukking van hierdie gene sal ook help om meer insigte gee oor die regulering van die gene onder wynmaak toestande.

Thesis (MscAgric (Viticulture and Oenology))--University of Stellenbosch, 2009. / ENGLISH ABSTRACT: Tannins and colour components in red wine are important quality parameters. These factors can be manipulated in the vineyard by grape growing techniques or in the cellar by different winemaking practices. Grape seeds make a significant contribution to tannin concentration in wine when compared to those from the skins and pulp. Tannins contribute to the ageing potential, organoleptic properties and stabilisation of red wine colour. The colour of a red wine is also influenced by malolactic fermentation, the biological process that transforms malic acid into lactic acid which normally leads to an increase in pH. The subsequent change in pH alters the anthocyanin equilibrium, the primary colour components in red wine. Oxygen contributes to the polymerisation of anthocyanins over time to form more stable pigments that are less sensitive to pH fluctuations and sulphur dioxide bleaching. Limited research has been done on the use of oxygen after alcoholic fermentation and the impact it has on the phenolic composition of red wines. Similarly, only a few studies have examined the impact of either the addition or removal of seeds to the phenolic composition of a red wine in combination with oxygen addition. Additionally, little published data seems to exist on the effect of different pHs on red wine’s phenolic and colour development after oxygen addition. In our results we have shown that it is possible to stabilise wine colour by adding supplementary seeds before alcoholic fermentation. This led to an increase in colour intensity in certain cases. Some red wines produced without seeds had significantly lower colour intensities. This clearly suggests that catechins and proanthocyanidins are extracted from seeds and contribute to wine colour as they combine with other pigments to stabilise wine colour. Spectrophotometric and HPLC analyses have shown that the total phenolic content increased with seed concentration. However, we have observed that a wine may possibly become saturated with phenols when supplementary seeds are added. Anthocyanin concentrations often decreased when oxygen was added, while polymeric phenols and polymeric pigments sometimes increased. When applying different oxygen dosages to a red wine on commercial scale with microoxygenation, it was found that monomeric anthocyanins decreased as more oxygen was added and this decrease in anthocyanins led to the formation of stable polymeric pigments. This was reflected in the significant increase in colour intensity for the wines receiving oxygen. Small differences were detected in the total phenol and tannin concentration for the control and oxygenated wines. However, some of these phenolic and colour differences disappeared during subsequent ageing of the wine. When making wines of different initial pHs, we observed that the colour density decreased as the pH increased. The application of oxygen reduced the decrease in colour during MLF, especially at a lower pH. The addition of oxygen did not result in significantly different polymeric pigment concentrations in the various pH treatments, although the results could have been different if the wines were aged. However, pH differences in the range between 3.4 and 4.0 did not significantly influence the phenol composition of the wines under our conditions. This study led to a better understanding on the effect of oxygen additions under different conditions on red wine's phenolic and colour composition. / AFRIKAANSE OPSOMMING: Tanniene en kleur komponente teenwoordig in rooiwyn is belangrike kwaliteit parameters. Hierdie faktore wat wynkwaliteit beïnvloed kan gemanipuleer word in die wingerd deur verskeie verbouingstegnieke toe te pas en in die kelder deur die toepassing van verskillende wynbereidingsmetodes. Die bydrae van sade tot die finale tannienkonsentrasie in rooiwyn is groot in vergelyking met dié van die pulp en doppe. Tanniene dra by tot die verouderingspotensiaal, organoleptiese eienskappe en die stabilisasie van die wynkleur. Die kleur van ‘n rooi wyn word ook beïnvloed deur appelmelksuurgisting (AMG), die biologiese proses wat appelsuur omskakel na melksuur en ‘n gevolglike toename in die pH van die wyn veroorsaak. Hierdie verandering in die pH van die wyn beïnvloed die antosianien ewewig, die primêre kleur komponente teenwoordig in rooiwyn. Suurstof dra by tot die polimerisasie van antosianiene oor tyd om meer stabiele kleur pigmente te vorm met ‘n hoër kleurintensiteit wat minder sensitief is teenoor pH veranderinge en die bleikingseffek van swaweldioksied. Beperkte navorsing is gedoen op die gebruik van suurstof na alkoholiese gisting en die impak daarvan op die fenoliese samestelling van ‘n rooiwyn. Slegs ‘n paar studies het die invloed van die verwydering of byvoeging van sade in kombinasie met suurstoftoediening op ‘n rooiwyn se fenoliese samestelling ondersoek. Dit wil voorkom of beperkte gepubliseerde data beskikbaar is oor die effek wat verskillende pH’s het op rooi wyn se fenoliese en kleurontwikkeling na suurstof byvoeging. Ons resultate het aangedui dat dit wel moontlik is om in sekere gevalle die kleur van ‘n rooiwyn te stabiliseer deur addisionele sade by te voeg voor alkoholiese fermentasie. Hierdie byvoeging het ‘n toename in kleurintensiteit tot gevolg gehad. Sekere wyne wat gemaak is sonder sade het ‘n kenmerkend laer kleur intensiteit gehad. Hierdie bevinding is ‘n duidelike bewys dat katesjiene en prosianidiene geëkstraheer word vanuit die sade en bydra tot wynkleur deurdat hulle met ander pigmente verbind om die kleur sodoende te stabiliseer. Spektrofotometriese en hoë druk vloeistof chromatografie (HDVC) analises het gewys dat die totale fenoliese konsentrasie neem toe met ‘n toename in saad konsentrasie. Daar is egter waargeneem dat ‘n wyn moontlik versadig kan raak met fenole wanneer addisionele sade bygevoeg word. Antosianien konsentrasies het meestal afgeneem wanneer suurstof bygevoeg is, maar polimeriese fenole en polimeriese pigmente het partykeer toegeneem. Met die toediening van verskillende suurstof dosisse tot ‘n rooiwyn op kommersiële skaal het ons bevind dat monomeriese antosianiene afneem wanneer meer suurstof bygevoeg word. Hierdie afname in antosianiene het egter gelei tot die vorming van stabiele polimeriese pigmente. Dié bevinding was gereflekteer in die toename in kleurintensiteit van wyne wat met suurstof behandel is. Klein verskille was waargeneem vir die totale fenol en tannien konsentrasies tussen die kontrole en wyne behandel met suurstof. Sekere van hierdie fenoliese kleur verskille het egter afgeneem tydens die daaropvolgende veroudering van die wyne. Wyne wat gemaak is met verskillende aanvanklike pH’s se kleurintensiteit neem af soos die pH toeneem. Die toediening van suurstof het die kleurverlies tydens AMG verminder, veral by ‘n laer pH. Die toediening van suurstof het nie verskillende polimeriese pigment konsentrasies by verskillende pH’s veroorsaak nie, maar ‘n verskil kon moontlik waargeneem word indien die wyne verouder was. pH verskille tussen 3.4 en 4.0 het egter nie die fenoliese samestelling van die wyne onder ons omstandighede beduidend beïnvloed nie. Hierdie studie het gelei tot meer kennis oor die effek van suurstoftoedienings onder verskillende kondisies op rooiwyn se fenoliese en kleursamestelling.

Thesis (MScAgric (Viticulture and Oenology))--University of Stellenbosch, 2010. / ENGLISH ABSTRACT: The quality of wine is influenced and determined by various factors, one of which includes the process of malolactic fermentation (MLF). MLF plays an integral role in the flavour and sensory profile of most red wines as well as some white wines like Chardonnay. This process is conducted by lactic acid bacteria (LAB), specifically of the genera Oenococcus, Lactobacillus, Pediococcus and Leuconostoc. Of these, Oenococcus oeni is best adapted to survive in the harsh wine environment. MLF is defined as the conversion of L-malic acid to L-lactic acid and carbon dioxide. The conversion of the dicarboxylic malic acid to the monocarboxylic lactic acid results in a decrease in acidity and an increase in pH, to give a softer mouthfeel and more favourable flavour profile. A further reason for conducting MLF in wine includes the improvement of microbial stability due to the removal of malic acid as a possible substrate for microorganisms. Recently, research focus has shifted to the ability of MLF and LAB to alter the aroma profile of wine via the production and/or modification of certain aroma compounds. In order for wine LAB to conduct MLF, they need to be able to survive the harsh and challenging wine environment. Conditions in South African wines are particularly challenging due to the long, hot ripening seasons resulting in high sugar concentrations which give high ethanol concentrations. Some LAB also struggle to adapt to an environment with high pH and low malic acid concentrations. These factors, combined with the use of sulphur dioxide, cause LAB to struggle in conducting and completing successful MLF. Many of the commercial starter cultures that are currently available contain LAB that have not been isolated from South African wine and are therefore not optimal for use under these challenging wine conditions. Oenococcus oeni is also the single LAB culture present in all commercially available starter cultures. The overriding goal of this study was to create a MLF starter culture containing a mixture of LAB cultures, namely O. oeni and Lactobacillus plantarum, which can successfully convert malic acid to lactic acid, ensure microbial stability, but also make a positive contribution to the wine aroma profile. Lactobacillus plantarum has previously been considered for possible use in a commercial starter culture. The LAB isolates used in this study were selected from the Institute for Wine Biotechnology culture collection as well as isolated from spontaneous MLF. The first objective was to characterise these LAB strains for important traits and for possible use as a MLF starter culture. A total of 23 strains were identified as O. oeni and 19 strains as Lb. plantarum. The identified strains were screened in a synthetic wine medium for their ability to convert malic acid to lactic acid. Based on the LAB strain performance in the synthetic wine medium, seven strains of both O. oeni and Lb. plantarum were selected. These 14 strains were screened for the presence of genes encoding for enzymes responsible for biogenic amine production and were found to contain none of the genes associated with the formation of histamine, tyramine or putrescine. The LAB strains were genetically screened for enzymes associated with aroma modification by LAB during MLF. The enzymes of interest that were screened for included β-glucosidase, esterase, protease and phenolic acid decarboxylase (PAD). The Lb. plantarum strains were found to possess more diverse enzymatic profiles related to aroma than O. oeni. The biggest differences were observed for the presence of β-glucosidase and PAD. The second objective was to perform small-scale fermentations with the individual LAB isolates. The individual isolates were evaluated in Pinotage and based on these results; three strains of each O. oeni and Lb. plantarum were selected for evaluation in mixed culture fermentations. The mixed cultures were evaluated in Pinotage, Shiraz and Cabernet Sauvignon in the 2008 vintage. As a third objective, the wines were also analytically and sensorially evaluated to investigate the changes in the aroma profile that could be attributed to the presence of the mixed LAB isolates. Based on the fermentation data as well as data pertaining to the aroma modification, three mixed cultures were selected for evaluation in the 2009 vintage in Pinotage, Cabernet Sauvignon and Chardonnay. The mixed cultures were able to successfully complete MLF in fermentation periods comparable to that of a commercial culture used as control. The different LAB cultures had distinct and diverse effects on the wine aroma profile. The O. oeni strain played a larger role in the ester concentration present after MLF, while the Lb. plantarum strain had a larger effect on the higher alcohol and volatile fatty acid concentration upon completion of MLF. The results generated by this novel study clearly indicate the potential of a mixed LAB starter culture for conducting MLF. The mixed cultures successfully completed MLF and made a positive contribution to the wine aroma profile. / AFRIKAANSE OPSOMMING: Die kwaliteit van wyn word beïnvloed en bepaal deur verskeie faktore en wynbereidings prosesse, wat die proses van appelmelksuurgisting (AMG) insluit. AMG speel ’n integrale rol in die sensoriese profiel van meeste rooiwyne, sowel as sommige witwyne soos Chardonnay. AMG word gedefinieër as die omskakeling van L-appelsuur na L-melksuur en koolstofdioksied. Hierdie omskakeling kan toegeskryf word aan die teenwoordigheid van melksuurbakterieë (MSB), spesifiek spesies van die genera Oenococcus, Lactobacillus, Pediococcus en Leuconostoc. Vanuit hierdie wyn MSB, is Oenococcus oeni die spesies wat die beste aanpas en oorleef onder stresvolle wyn kondisies. Die omskakeling van appelsuur, ’n dikarboksielsuur, na melksuur, ’n monokarboksielsuur, lei tot ‘n vermindering in suurheid en ’n verhoging in pH. Hierdie vermindering in suurheid gee ’n sagter en meer geronde mondgevoel aan die wyn en dra by tot ‘n meer aangename geurprofiel. ’n Verdere rede vir AMG in wyn is om mikrobiese stabiliteit te verseker deurdat appelsuur verwyder word as ’n moontlike koolstof substraat vir mikroörganismes. Onlangs het navorsing begin fokus op AMG en die vermoë van MSB om die aroma profiel van wyn te beïnvloed deur die produksie/modifisering van sekere aroma komponente. Vir MSB om AMG te kan deurvoer, moet hulle kan oorleef in die stresvolle wynomgewing. Wyntoestande in Suid-Afrika is veral uitdagend vir die oorlewing van mikroörganismes as gevolg van lang, warm somers wat lei tot ’n matriks met ’n hoë suikerkonsentrasie en wyn met ’n hoë etanolkonsentrasie. ‘n Omgewing met ‘n hoë pH en lae appelsuur konsentrasie, kan ook bydrae tot stresvolle kondisies vir MSB. Hierdie parameters, tesame met die gebruik van swaweldioksied, maak dit moeilik vir MSB om AMG te inisieer en te voltooi. Sommige van die kommersiële aanvangskulture wat tans beskikbaar is, bevat nie MSB wat onder Suid-Afrikaanse wyntoestande geïsoleer is nie en daarom is dit nie altyd optimaal vir gebruik nie. Oenococcus oeni is ook die enkele MSB kultuur wat in alle kommersiële kulture gebruik word. Die hoofdoelwit van hierdie studie was om ’n potensiële kommersiële aanvangskultuur te ontwikkel wat ‘n mengsel van MSB bevat. Hierdie aanvangskultuur moet AMG suksesvol kan voltooi, mikrobiologiese stabiliteit bevorder en steeds die wynaroma positief kan beïnvloed. Bakterierasse van O. oeni en Lb. plantarum is geselekteer vir gebruik in hierdie studie. Lactobacillus plantarum het reeds in vorige studies potensiaal getoon as ‘n moontlike aanvangskultuur. Die MSB isolate vir hierdie studie is geselekteer uit die Instituut vir Wynbiotegnologie se kultuurversameling en geïsoleer uit spontane AMG fermentasies. Die eerste doelwit was om hierdie MSB isolate te karakteriseer vir belangrike eienskappe en die moontlike gebruik as ’n kommersiële AMG aanvangskultuur. ‘n Totaal van 23 O. oeni en 19 Lb. plantarum isolate is geïdentifiseer. Hierdie isolate is in ’n sintetiese wynmedium geëvalueer vir hul vermoë om appelsuur na melksuur om te skakel. Op grond van hul reaksie in die sintetiese wynmedium, is sewe isolate van elk van die O. oeni en Lb. plantarum geselekteer. Hierdie 14 isolate is ondersoek vir die teenwoordigheid van die gene wat kodeer vir biogeenamien produksie en daar is gevind dat geen van die isolate enige van die biogeenamien gene wat ondersoek is, naamlik histamien, tiramien en putresien besit nie. Die MSB isolate is geneties ondersoek vir die teenwoordigheid van dié gene wat kodeer vir ensieme wat die aromaprofiel tydens AMG beïnvloed. Dié ensieme sluit β-glukosidase, esterase, protease, fenoliese suurdekarboksilase en sitraatliase in. Daar is gevind dat die Lb. plantarum isolate meer diverse ensiemprofiele as O. oeni besit. Die grootste verskille in die ensiemprofiele kan toegeskryf word aan die teenwoordigheid van β-glukosidase en fenoliese suurdekarboksilase. Die tweede doelwit was om kleinskaalse AMG fermentasies met die individuele MSB isolate uit te voer. Die individuele isolate is in Pinotage geëvalueer. Volgens hierdie resultate is drie isolate van elk van die O. oeni en Lb. plantarum geselekteer om in gemengde kulture getoets te word. Die gemengde kulture is in Pinotage, Shiraz en Cabernet Sauvignon in 2008 geëvalueer. As ’n derde doelwit is hierdie wyne ook analities en sensories geëvalueer om die veranderinge in die aromaprofiele as gevolg van die teenwoordigheid van die MSB te ondersoek. Op grond van die fermentasiedata, sowel as die data oor die aromaveranderinge, is drie gemengde kulture geselekteer vir evaluering in Pinotage, Cabernet Sauvignon en Chardonnay in 2009. Die gemengde kulture kon AMG suksesvol voltooi met fermentasietempo’s wat vergelykbaar was met dié van ‘n kommersiële AMG kultuur wat as kontrole gebruik is. Die verskillende MSB kulture het spesifieke en uiteenlopende uitwerkings op die wynaroma gehad. Die O. oeni isolaat in die gemengde kultuur blyk ‘n belangriker rol te speel in die esterkonsentrasie na AMG, terwyl die Lb. plantarum isolaat ’n groter effek het op die hoër alkohol en vlugtige vetsuurinhoud na AMG. Die resultate wat deur hierdie unieke studie gegenereer is, gee ’n aanduiding van die potensiaal van ’n gemengde MSB aanvangskultuur vir AMG. Die gemengde kulture kon AMG suksesvol voltooi en ‘n positiewe bydrae tot die aromaprofiel van die wyn lewer.

L’objectif de cette thèse est d’étudier le rôle de la fermentation malolactique (FML) sur l’arôme fruité des vins rouges. Les bactéries lactiques (BL) modifient la composition du vin mais il n’existe pas de consensus concernant spécifiquement cette famille aromatique. Contrairement aux idées empiriques sur la FML, ce travail a démontré l’absence à court terme d’un " masque lactique ", cependant l’apparition d’une telle interaction olfactive pourrait être plus tardive. Par contre, il est montré l’existence d’un masque proche de la note de réduction, de type fumé/grillé, dont la caractérisation n’a pas été effectuée dans cette étude.Le suivi des principaux marqueurs fruités du vin (70 molécules) a été rendu possible par le développement des méthodes d’analyse chromatographique en phase gazeuse couplée à la microextraction sur phase solide (esters, C13-norisoprénoïdes, lactones, thiols). En particulier, une " base de données esters " (32 composés) a rendu plus robuste l’ensemble des variations constatées au cours du développement des BL. En effet, les modifications des teneurs en esters sont démontrées comme un processus majeur de la balance de la note fruitée au cours de la FML. Cette fermentation permet à court terme, aussi bien la synthèse que l’hydrolyse des esters grâce aux activités estérases et, à plus long terme, la formation tardive d'esters éthyliques d'acides branchés issus du catabolisme de certains acides aminés. La spécificité des estérases vis-à-vis de la nature et de la longueur de la chaîne carbonée des esters est mise en évidence, ainsi que l'importance de la disponibilité des substrats, liée en partie à l'activité des levures.L’étude de l’influence des souches de BL et de la co-inoculation levures/bactéries a permis de confirmer le rôle clé des interactions entre les microorganismes, ainsi que l’importance de la composition de la matrice vin. / The aim of this thesis is to study the role of malolactic fermentation (MLF) on the fruity aroma of red wines. Lactic acid bacteria (LAB) modify wine composition but there is no consensus concerning this aromatic group specifically. In opposition to empirical ideas on MLF, this work has demonstrated the absence, in short-term, of a “lactic-mask” although this kind of olfactory interaction may still occur in a later stage of wine development. Nevertheless, the existence of a smoked/toasted reduction-like mask note was proved. Its characterization has not been done in this work. The survey of the main fruity markers of wine (70 compounds) was made possible by the development of several gas chromatography coupled with solid-phase microextraction analytical methods (esters, C13-norisoprenoids, lactones, thiols). In particular, the creation of an “ester database” (32 compounds) has improved the detection of variations during LAB development in terms of analysis robustness. In fact, changes on esters contents are proved to be responsible for a major part of fruity notes evolution during MLF. Initially, this fermentation allows both synthesis and hydrolysis of esters as a consequence of esterase activity. Moreover, it promotes late-production of ethylic esters through the catabolism of certain aminoacids. Esterases specificity towards nature and size of the esters carbon chain is pointed out along with substrates availability, partially related to yeast activity.The study of the influence of both LAB strains and yeast/bacteria co-inoculation has confirmed microorganisms interactions and wine matrix composition to be of the great importance.

La Fermentation Malo-Lactique (FML) réalisée par OEnococcus oeni est une étape importante de la vinification qui doit être maîtrisée. Bien que les vinificateurs aient à leur disposition des souches OE. oeni selectionnees la FML n’est pas toujours réussie. Les conditions physico-chimiques (pH, éthanol, température), la composition du vin et les facteurs biologiques influencent l’activite de cette bacterie ; parmi ces dernières les interactions entre micro-organismes sont primordiales. Souvent, après la fermentation alcoolique par la levure, des souches indigenes d’OE. oeni sont naturellement présentes dans le vin. Des interactions négatives peuvent alors se produire entre les souches autochtones et les souches sélectionnées apportées. Des connaissances sur ces interactions sont donc necessaires. L’objectif de ce travail etait d’etudier les interactions pendant la FML entre 5 souches d’OEnococcus oeni issues de différentes niches écologiques. Pour cela, des expériences ont été effectuées dans du milieu MRS modifié et dans des conditions proches à celles du vin (20 °C ; pH 3,5 et 10 % d’ethanol). Nous avons tout d’abord caracterise le comportement des souches en cultures pures à la fois dans les conditions de micro-aerobie et d’anaerobiose. Une grande variabilité a été retrouvée entre les souches dans les 2 conditions : trois des 5 souches sont favorisées en conditions d’anaerobiose tandis que les deux autres se sont mieux développées en conditions de micro-aérobie. La présence de 4 g.L-1 d’acide L-malique dans le milieu permet de produire, pour toutes les souches, une biomasse environ 2 fois plus élevée que celle obtenue dans le milieu sans acide L-malique. La totalite de l’acide malique est consommee par les 5 souches mais avec des vitesses différentes. Pour une souche donnée la vitesse spécifique de consommation d’acide L-malique (ν) et la vitesse specifique de croissance (μ) presentent des profils similaires au cours de la FML. Elles ont été reliées par un modèle mathématique qui a permis de quantifier ce lien pour chaque souche. Les interactions lors des cultures mixtes des 10 couples formés par les 5 souches ont ensuite été étudiées dans un Bio-Réacteur à Membrane (BRM) en anaérobiose. Trois catégories ont été mises en évidence: interactions à effets négatifs réciproques sur la croissance des 2 souches en culture mixte ; interactions à effet négatif sur la croissance de la souche la plus rapide en culture pure et à effet positif sur la croissance de la souche la plus lente en culture pure et interactions à effets positifs sur la souche la plus rapide en culture pure. La comparaison des cultures pures et mixtes a révélé que l’activite specifique de croissance des souches est affectee en culture mixte, ce qui provoque le prolongement de la phase de la latence dans le cas de l’inhibition et son raccourcissement dans le cas de la stimulation. La modelisation de la consommation d’acide L-malique a révélé pour certains couples une activation de la consommation de cet acide bien que la croissance soit fortement inhibée. Ces interactions, qui affectent le déroulement de la FML, ne peuvent etre dues qu’a l’effet de metabolite(s) extracellulaire(s) excretee(s) dans le milieu de fermentation. Ces métabolites restent à identifier. / In winemaking, the control of malolactic fermentation (MLF) by OEnococcus oeni is an essential step for this process. Although winemakers have the availability for selected OE.oeni strains, the MLF is not always successful. The physical-chemical conditions (pH, ethanol, and temperature), the composition of wine, and biological factors, all together influence the activity of this bacterium; regarding biological factors, the interactions between microorganisms are essential. Often, after alcoholic fermentation by yeast, indigenous strains of OE.oeni are naturally present in wine, negative interactions can then occur between the indigenous strains and selected strains; therefore, knowledge on these interactions is needed. The goal of the present work was to study the interactions during MLF between five strains of OE.oeni from different origins. Experiments were performed in the modified MRS medium to be in nearly conditions to those of wine (20 °C, pH 3.5, and 10% ethanol). The characterization of the behavior of strains in pure cultures was done under both, micro-aerobic and anaerobic conditions; a large variability was found between the strains in the two conditions: three out of five strains were favored under anaerobic conditions while the two others were better developed in micro-aerobic conditions. The presence of 4 g.L-1 of L-malic acid in the culture medium increased the biomass produced, about two-fold higher than that obtained in medium without L-malic acid. All of the L-malic acid is consumed by the five strains but at different specific rates. A mathematical model allowed to quantifying the relationship between the specific consumption rate of L-malic acid (ν) and the specific growth rate two specific rates for each strain; for a given strain, both rates have similar profiles during the MLF. Interactions in mixed cultures of 10 couples formed by the five strains were then examined in a Membrane Bioreactor (BRM) under anaerobic conditions. Three different interaction types were identified: 1) negative reciprocal interactions of the both strains in mixture culture, 2) interaction that affect negatively the favored strain in pure culture and positively the slowest one, and 3) interaction with positive effect on the fastest strain in pure culture. Comparison of pure and mixed culture showed that the specific activity of strains was affected in mixture culture causing the extension of the lag phase in the case of inhibition and its shortcut in the case of stimulation. Modeling of the consumption of the L-malic acid revealed activation of the consumption of this acid for some couples however, growth is strongly affected. The interactions affecting the course of the MLF are due solely to the effect of excreted extracellular metabolite(s); these metabolites remain to be identified

Oenococcus oeni est la principale bactérie lactique retrouvée dans les fermentations malolactiques (FML) spontanées du vin. Pendant la FML, l’acide malique est converti en acide lactique, modulant l’acidité du vin et améliorant son goût. L’activité métabolique d’O. oeni produit aussi des changements dans la composition du vin, modifiant son profil aromatique. Des études précédentes ont suggéré que l’espèce est divisée en deux principaux groupes génétiques, désignés A et B. Nous avons examiné les souches d’O. oeni sous des approches de génomique comparative à l’aide d’outils bioinformatiques développés sur place, dévoilant l’existence de nouveaux de groupes et sous-groupes de souches. En outre, nos résultats suggèrent que certains groupes contiennent des souches qui sont adaptées à des produits spécifiques tels que le vin rouge, vin blanc, champagne et cidre. Ce phénomène est visible à différents niveaux des génomes des souches : l’identité de séquence, les signatures génomiques, et les caractéristiques génomiques spécifiques de groupes telles que la présence/absence de gènes et les mutations uniques. Afin de comprendre l’impact des caractéristiques génomiques dans l’adaptation de l’espèce à différents produits, nous avons sélectionné une collection de souches isolées de la même région, mais appartenant à deux groupes génétiques différents et adaptées soit au vin rouge, soit au vin blanc. Une analyse de données génomiques et métabolomiques intégrées révèle que les caractéristiques génomiques des souches de chaque groupe ont un impact sur l’adaptation des bactéries à leurs niches respectives et sur la composition de la fraction volatile du vin. / Oenococcus oeni is the main lactic acid bacteria found in spontaneous malolactic fermentation (MLF) of wine. During MLF, malic acid is converted into lactic acid, modulating wine’s acidity and improving its taste. The metabolic activity of O. oeni also produces changes in the composition of wine, modifying its aromatic profile. Previous studies have suggested that the species is divided in two major phylogenetic groups, namely A and B. We have examined O. oeni under comparative genomics approaches by the aid of bioinformatics tools developed in-place, unveiling the existence of more phylogenetic groups of O. oeni than previously thought. Moreover, our results suggest that certain groups are domesticated to specific products such as red wine, white wine, champagne and cider. This phenomenon is visible at different levels of the strains’ genomes: sequence identity, genomic signatures, and group-specific features such as presence/absence of genes and unique mutations. With the aim of understanding the impact of group-specific genomic features on the species adaptation to different products, we have selected a set of strains isolated from the same region, but belonging to two different genetic groups and adapted either to red wine, either to white wine. An integrated analysis of genomic and metabolomic data reveals that the genomic features of each genetic group have an impact on the strains adaptation to their respective niches, affecting the composition of the volatile fraction of wine.

La production de la majorité des vins rouges et de certains types de vins blancs et de vins pétillants requiert deux étapes fermentaires successives. La première est la fermentation alcoolique (FA) réalisée principalement par Saccharomyces cerevisiae. A la fin de la FA, les vins sont soumis à la fermentation malolactique (FML) réalisée principalement par Oenococcus oeni. Cependant, la FML est souvent difficile à déclencher et accomplir à cause de l’activité antibactérienne individuelle ou synergique de différents paramètres physicochimiques du vin et de métabolites levuriens inhibiteurs. Dans ce contexte, l’étude des interactions qui peuvent avoir lieu entre les souches de levures et de bactéries est importante pour le choix adéquat des souches et de la stratégie d’inoculation. Dans le présent travail, S. cerevisiae souche D a fortement inhibé O. oeni souche X pendant les fermentations séquentielles réalisées dans des milieux synthétiques jus de raisin (MSJ) alors que la souche levurienne A s’est révélée stimulatrice. Des traitements protéasiques et thermiques des MSJ fermentés par la souche D ont démontré la nature protéique des métabolites levuriens inhibiteurs. Le fractionnement par ultrafiltration de ces mêmes milieux a montré qu’une fraction peptidique extracellulaire de 5-10 kDa était responsable de l’inhibition de la FML. Elle a été graduellement relarguée au cours de la FA et a atteint sa concentration maximale à un stade avancé de la phase stationnaire. L’inhibition de la FML a été maintenue dans les jus de raisin commerciaux et les moûts naturels (CabernetSauvignon et Syrah) présentant des teneurs faibles et élevées en composés phénoliques. Ces derniers n’ont pas pu donc modifier l’activité biologique des peptides inhibiteurs. La fraction 5-10 kDa a été testée in vitro sur un extrait cellulaire contenant l’enzyme malolactique dans une gamme de pH comprise entre 3,5 et 6,7. Les résultats ont montré qu’elle a pu directement inhiber l’activité de l’enzyme malolactique avec une cinétique d’inhibition croissante corrélée à l’avancement de la fermentation alcoolique. La fraction 5-10 kDa du précipité au sulfate d’ammonium (60-80 %) a ensuite été analysée par chromatographie échangeuse d’ions. Les éluats récupérés avec 0,5 M NaCl par chromatographie anionique et cationique ont renfermé des peptides inhibiteurs et ont été migrés sur SDSPAGE. Les bandes d’intérêt ont ensuite été coupées et séquencées par LC1D-nanoESI-LTQ-Orbitrap. Les résultats ont montré 12 peptides qui ont probablement travaillé en synergie. 2 fragments de GAPDH de 0,9 et 1,373 kDa ayant un pI de 9,074 et un fragment de Wtm2p de 2,42 kDa ayant un pI de 3,35 sont impliqués dans l’inhibition de la FML. / The production of most red wines and certain white and sparkling wine styles requires two consecutive fermentation steps. The first one is the alcoholic fermentation (AF) and is carried out mainly by Saccharomyces cerevisiae. At the end of the AF, the wines undergo malolactic fermentation (MLF) carried out mainly by Oenococcus oeni. However, the MLF is often difficult to trigger and accomplish because of the individual or synergistic antibacterial activity of several physical chemical wine parameters and yeast inhibitory metabolites. In this context, the study of the interactions that may occur between specific strains of yeasts and bacteria is important for choosing the adequate strain combination and inoculation strategy. In the present work, S. cerevisiae strain D strongly inhibited O. oeni strain X during sequential fermentations performed in synthetic grape juice (SGJ) media whereas S. cerevisiae strain A stimulated it. Protease and heat treatments of the SGJ media fermented by strain D showed the protein nature of the yeast inhibitory metabolites. Fractionation by ultrafiltration of the same media revealed that an extracellular peptidic fraction of 5-10 kDa was responsible for the inhibition. It was gradually released during AF and reached its highest concentration at late stages of the stationary phase. The MLF inhibition was maintained in natural grape juices and grape musts (Cabernet-Sauvignon and Syrah) presenting low and high phenolic contents. Therefore, the activity of the inhibitory peptides was not affected by grape phenolic compounds. The 5-10 kDa fraction was tested in vitro on cell-free bacterial cytosolic extracts containing the malolactic enzyme in a pH range between 3.5 and 6.7. Results showed that it was able to directly inhibit the malolactic enzyme activity with an increasing inhibitory kinetic correlated to the AF time at which it was collected. The 5-10 kDa peptidic fraction of the 60-80 % ammonium sulfate precipitate was submitted to analyses by both anionic and cationic exchange chromatography (AEXC and CEXC). Eluates recuperated with 0.5 M NaCl from both AEXC and CEXC contained inhibitory peptides and were further migrated by SDS-PAGE. The bands of interest were excised and sequenced by LC1D-nanoESI-LTQ-Orbitrap. Results gave 12 different peptidic fractions that may have worked synergistically. 2 GAPDH fragments of 0.9 and 1.373 kDa having a pI of 9.074 and a Wtm2p fragment of 2.42 kDa having a pI of 3.35 were involved in the MLF inhibition.

La fermentation malolactique permet une désacidification et une amélioration de la qualité du vin. Elle est réalisée par des bactéries lactiques principalement de l’espèce Oenococcus oeni : cette espèce est privilégiée pour son efficacité et ses intérêts organoleptiques. La capacité de O. oeni à résister au stress du vin et à garder son activité fermentaire est un sujet d’intérêt majeur. Les prélèvements des fûts de chêne ont montré que O. oeni adhère au bois et est capable de persister plusieurs mois dans le vin. Or, dans la majorité des habitats naturels, les microorganismes se développent attachés à un support, au sein d’un écosystème structuré appelé biofilm. Sous cette forme de vie, les cellules bénéficient d’une résistance accrue au stress. Ces deux propriétés que sont l’adhésion à une surface ainsi que la résistance au stress ont donc été étudiées pour O. oeni. Des observations par microscopie électronique à balayage ont ainsi permis de mettre en évidence la formation de biofilms par O. oeni. Puis, nous avons évalué la capacité de résistance au stress du vin de O. oeni sous forme de biofilm. L’intérêt pour le biofilm est croissant dans les industries agroalimentaires et biotechnologiques, en raison de la conservation de son activité métabolique en milieu stressant. C’est pourquoi la fermentation malolactique avec un biofilm de O. oeni a été suivie dans le vin. Enfin, l’influence du biofilm de O. oeni sur les transferts de composés aromatiques entre le bois et le vin a été étudiée. Cette étude est la première caractérisation du biofilm de O. oeni, de sa résistance au stress du vin et de son potentiel fermentaire / Malolactic fermentation improves wine quality, mainly by decreasing acidity. It is carried out by lactic acid bacteria, mainly Oenococcus oeni. This species is favored for its efficiency and its organoleptic outcome. O. oeni ability to withstand wine stress and to keep its fermentation activity is a subject of major interest.Samples of oak showed that O. oeni adheres to wood and is able to persist for several months in wine. However, in the majority of natural habitats, microorganisms grow attached to a surface, within a structured ecosystem called biofilm. In this form of life, cells benefit from an increased stress resistance.These two properties, adherence to a surface and stress resistance, were studied for O. oeni. Observations by scanning electron microscopy have highlighted biofilm formation by O. oeni. Then, we evaluated the wine stress resilience of O. oeni biofilm. Biofilm is a growing interest in food and biotechnology industries, due to the conservation of its metabolic activity in stressful environment. Therefore, malolactic fermentation with an O. oeni biofilm was monitored in wine. Finally, the influence of O. oeni biofilm on transfers of aromatic compounds between wood and wine was studied.This study is the first characterization of O. oeni biofilm, its wine stress resistance and its fermentation potential.

The aim of this Master Degree Thesis was to monitor the total number of lactic acid bacteria occurring in grape must during wine production. The study was performed on the red wine grape variety Cabernet Moravia from organic vineyard and on the white wine grape variety Sauvignon from both organic and integrated vineyards. The isolation of pure cultures of lactic acid bacteria from mixed cultures and subsequently their identification by genus and species-specific PCR was also subject of the thesis. The experimental results show that the number of viable cells of lactic acid bacteria is influenced not only by the wine grape variety, whether it is a variety of red or white wine grape, but also by the way of wine growing. The method of wine growing also had an impact on the species representation of lactic acid bacteria in each variety.