Malolactic fermentation (MLF), or malolactic fermentation is a process which converts Malic acid to lactic acid. Made with lactic fermentation bacteria. There are different kinds of lactic acid bacteria -- positive (Oenococcus oeni) and negative (Lactobacillus, Pediococcus). Malolactic fermentation on wine by reducing acidity, improves the stability of microbial and sensory properties of wine. Malolactic fermentation we can perform before the alcoholic fermentation, during alcoholic fermentation and alcoholic fermentation. It always depends on the situation and the type of wine. The aim of the practical part of the thesis was to track the progress of malolactic fermentation in white, pink and red wine. Malolactic fermentation was observed for two strains of bacteria -- commercial tribe and citrátnegative tribe.

Oenococcus oeni est la principale de bactérie lactique du vin. L’espèce comprend de nombreuses souches plus ou moins bien adaptées au vin et qui forment différents groupes génétiques. Récemment, deux groupes de souches ont été identifiés dans les vins rouges (VR) et vins blancs (VB) de Bourgogne. Il est probable que les bactéries se sont adaptées à l’un ou l’autre de ces vins en raison de leurs différences physico-chimiques et de composition. Néanmoins, d’autres souches peuvent s’y développer. Ce sont par exemple des levains commerciaux, qui ont une bonne tolérance aux stress du vin. L’objectif de cette étude était d’analyser l’adaptation des souches d’O. oeni au vin et en particulier aux polyphénols. Dans un premier chapitre, des souches des groupes VR et VB ont été étudiées. Leurs phénotypes ont été comparés dans des moûts et des vins à différents pH et en présence de polyphénols. Les résultats ont permis de mieux comprendre leur adaptation au vin blanc ou rouge. Dans les deuxième et troisième chapitres, la tolérance à l’acidité et aux polyphénols de souches commerciales a été étudiée. Leur résistance au vin et leurs capacités fermentaires ont été analysées, les cellules ont été observées en microscopie électronique et les mécanismes de résistance à l’acidité et aux polyphénols ont été recherché par protéomique quantitative. Un protocole de purification des protéines spécifique pour les essais en présence de polyphénols a été mis au point. Les résultats montrent des voies métaboliques et enzymes qui contribuent à l’adaptation des souches au vin. Ils permettent aussi l’exploration de nouvelles pistes pour la sélection des souches industrielles. / Oenococcus oeni is the main lactic acid bacteria species in wine. The species comprises many strains, which are more or less well adapted to wine and form different genetic groups. Recently, two groups of strains have been identified from Burgundy’s red (VR) and white (VB) wines. It is likely that the bacteria have adapted to one or the other of these wines because of their different physico-chemical properties and compositions. Nevertheless, other strains can also develop in these wines. They are for example commercial starters, which are well resistant to wine stressors. The objective of this study was to analyze the adaptation of O . oeni strains to wine and particularly to phenolic compounds. In the first chapter, strains of groups VR and VB were studied. Their phenotypes were compared in grape musts and in wines at different pHs and in the presence of phenolic compounds. The results provide insights on their adaptation to red or white wine. In the second and third chapters, the tolerance to acidity and phenolic compounds of commercial strains has been studied. Their survival in wine and their fermentative capacities were analyzed, the cells were observed by electron microscopy and the mechanisms of resistance to acidity and phenolic compounds were investigated by quantitative proteomics. A specific protein purification protocol has been developed for trials performed in the presence of polyphenols. The results show metabolic pathways and enzymes that contribute to the adaptation of strains to wine. They also open new tracks for the selection of industrial strains.

Les exopolysaccharides (EPS) produits par les bactéries lactiques ont longtemps été considérés comme des composés indésirables dans le vin. En effet, le β-glucane produit par certaines souches bactériennes est responsable d’une altération qui rend le vin impropre à la consommation. Cependant, les polysaccharides produits par Oenococcus oeni, principale espèce de la fermentation malolactique (FML) qui est une étape essentielle participant à la stabilisation et la qualité du vin, n’ont jamais été associés à un quelconque défaut. Notre premier objectif était d'identifier le matériel génétique impliqué dans la production de polysaccharides, en termes d'évolution phylogénétique et de diversité, parmi une collection de 50 souches d’O. oeni. L'analyse bioinformatique des 50 séquences génomiques a révélé la présence de deux loci organisés en opéron et potentiellement impliqués dans la production d'hétéropolysaccharides, mais aussi la présence de gènes isolés de glycosyltransférases et glycosides hydrolases impliqués dans la synthèse d’homopolysaccharides. L’ensemble des souches analysées présentent au moins une des voies de biosynthèse des EPS, suggérant un rôle essentiel chez O. oeni. Par la suite, une approche biochimique des polysaccharides produits a été mise en place et a permis de confirmer les données génomiques. Une glycosyltransférase membranaire, jouant un rôle clé dans la production d'EPS, a été caractérisée afin de mieux comprendre le mécanisme de la synthèse EPS. Par ailleurs, l’étude physiologique des polysaccharides produits a révélé l’existence de deux phénotypes (forme libérée et capsulaire), chacun jouant un rôle dans la survie et l’adaptation de la bactérie au vin et au procédé de lyophilisation industriel, forme sous laquelle les souches commerciales sont proposées pour induire la FML. / Exopolysaccharides (EPS) of lactic acid bacteria have long ago been undesirable in wine. Indeed, β-glucan produced by certain strains of bacteria provokes wine spoilage and makes the wine commercially defective. However, the polysaccharides produced by Oenococcus oeni which is the main species to drive malolactic fermentation (MLF), an essential step for wine stabilization and quality improvement, are not to be blamed for any spoilage effect. Our first aim was to identify the genetic material implicated in polysaccharides production, in terms of phylogenetic evolution and diversity among the strains of our collection. The bioinformatic analysis of 50 O. oeni genomic sequences revealed the presence of two organized loci potentially implicated in the production of heteropolysaccharides and also the presence of isolated genes of glycosyltransferases and glycoside-hydrolases implicated in the production of homopolysaccharides. The presence of at least one biosynthetic pathways in all the strains tested shows the importance of the polysaccharides genes for Oenococcus oeni. Thereafter, we reached-up a biochemical approach of the produced polysaccharides, confirming the results of the bioinformatics research. Initially we characterized a membrane glycosyltranferase, playing a key role in the EPS production. The results allow us to better understand the mechanism of the EPS synthesis. Furthermore the physiology of the produced polysaccharides showed two possible phenotypes (liberated and capsular form) each one playing his role for the bacterial survival at his natural environment (wine) as well as at industrial level (production of malolactic starters).

Dans le vin, les amines biogènes sont essentiellement d'origine microbienne, et sont produitesnotamment par les bactéries lactiques Oenococcus oeni, principal agent responsable de lafermentation malolactique, possède de nombreuses auxotrophies vis-à-vis des acides aminés.Aucune étude n'a été menée sur la relation entre l’auxotrophie vis-à-vis d’un acide aminé et leniveau de l’amine correspondante. 80 souches de Oenococcus oeni ont été isolées de vinsrouges. Leurs auxotrophies vis-à-vis d’acides aminés précurseurs d’amines biogènes (Arg,Tyr, His et Phe) ainsi que la présence de gènes codant des enzymes impliquées dans lasynthèse des amines ont été étudiées. Aucune relation entre auxotrophie et niveau deproduction d’amines ne peut être établie pour les souches testées. La présence de gènes codantdes enzymes impliquées dans la synthèse d’amines n’est pas non plus corrélée avec laproduction effective d’amines. Nous montrons pour la première fois que Oenococcus oeni estun producteur d’agmatine. Cette production est étroitement liée à la souche bactérienne. Lasouche la plus adaptée au milieu acide est celle qui consomme le plus l’arginine et enproportions équivalentes par les 2 voies : voie de l’arginine déiminase et voie de l’argininedécarboxylase. L’effet d’une addition d’agmatine dans des vins montre une atténuation del’effet boisé du Chardonnay sans doute par formation de base de Schiff ente les composésd’arôme et cette amine / In wine biogenic amines (BA) are mainly of microbial origin, Oenococcus oeni, the mainresponsible for malolactic fermentation, has been identified as a BA producer from nitrogenprecursors. Oenococcus oeni possess numerous amino acid auxotrophies that are precursors ofbiogenic amines. No study has been done so far to look at the relationship betweenauxotrophy for amino acids precursors of BA and the level of BA in the medium. In order todo so, 80 Oenococcus oeni strains were isolated from red wines. The detection of genesencoding the different decarboxylases responsible for BA synthesis has been realised. Inparallel, the auxotrophy for the four amino acids (Arg, Tyr, His, Phe) precursors of BA hascharacterized. Our results demonstrate that there is not direct correlation between auxotrophyand the accumulation of the corresponding BA as well as between the presence ofdecarboxylase gene and the accumulation of the corresponding BA. High levels of agmatineproduced from arginine decarboxylation by Oenococcus oeni is reported for the first time.Agmatine production is strain dependant. the most adapted to acidic environment is the strainwhith use arginine in higher level with same proportion for ADI pathway and argininedecarboxylase. Agmatine addition in wines reduce woody aroma probably by formation ofsciff bases between aromla compounds and amine

Oenococcus oeni est l’agent principalement responsable de la fermentation malolactique durant la vinification. Son adaptation au milieu vin est une étape clé dans la réussite de la FML, et donc dans la qualité des vins finis. Cependant, au sein de l’espèce, il existe une variabilité phénotypique importante, et de nombreuses souches ne sont ainsi pas aptes à réaliser la FML. La sélection des meilleures souches œnologiques passe ainsi par l’analyse de la diversité d’O. oeni. Cette étude a été abordée dans cette thèse, selon trois grands axes de recherche. Premièrement, la diversité génétique a été étudiée par des approches MLST, REA-PFGE et présence de marqueurs, et a montré une structuration de l’espèce en deux groupes phylogénétiques et plusieurs sous-groupes, reliés à des souches d’origine géographique précise. Ensuite, l’étude de la diversité phénotypique a montré la grande variabilité d’adaptation au vin des souches étudiées et un meilleur comportement de celles du groupe phylogénétique A durant la vinification. Enfin, une étude transcriptomique a mis en lumière certains mécanismes moléculaires éventuellement impliqués dans la réponse au stress vin chez O. oeni. / Oenococcus oeni is the main agent responsible for the malolactic fermentation, during the wine making process. Its adaptation to wine environment is a key step for the success of the MLF, and then for wines quality. However, there is a high phenotypic variability among the species and several strains are unable to perform MLF. The selection of the best enological strains implies starting by analyzing the diversity of O. oeni. This study has been divided in three main themes of research. Firstly, the genetic diversity has been analyzed using several approaches, MLST, REA-PFGE and presence of genetic markers. That study proved the structuration of the species in two phylogenetic groups and several subgroups, related to geographical areas. Secondly, the study of the phenotypic diversity showed that all the studied strains present a high variability and the best behavior in wine making conditions is found in those from the phylogenetic group A. Finally, a transcriptional analysis has revealed some molecular mechanisms possibly implicated in stress response in O. oeni

Oenococcus oeni est la principale espèce de bactérie lactique d’intérêt oenologique, elle réalise la plupart des fermentations malolactiques. Les souches d’O. oeni ont souvent été étudiées dans le but de sélectionner des levains malolactiques. Ces souches possèdent des caractéristiques génétiques, et phénotypiques variées. Néanmoins, l’utilisation de différentes méthodes de typage n’a pas permis à ce jour d’obtenir une image exhaustive de la diversité oenologique de cette espèce. L’intérêt grandissant des viticulteurs pour mieux maitriser les FML spontanées nécessite de mieux connaitre cette diversité.La population de souches indigènes d’O. oeni présentes dans les FML de différentes régions a été étudiée, pour tenter d’obtenir une image plus complète de la diversité de cette espèce et savoir s’il serait pertinent de sélectionner des souches de régions ou d’exploitations. L’analyse d’un très grand nombre de vins a mis en évidence la présence de souches spécifiques aux régions, appellations, produits et exploitations étudiées. Un génotypage à l’aide de SNP a permis de les classer dans les groupes génétiques déjà connu et a confirmé l’existence de groupes spécifiques à un type de produit. Certaines de ces groupes rassemblent des souches présentant des comportements phénotypiques et des capacités fermentaires similaires. En complément de l’analyse de diversité, des essais ont été menés pour proposer des protocoles de production de souches et d’utilisation de lies pour améliorer la réalisation des FML spontanées. L’ensemble de ces travaux soulignent la grande diversité génétique de l’espèce O. oeni, l’étude des souches spécifiques de type de vin pourrait aider à comprendre son adaptation à cet environnement. / Oenococcus oeni is the main species of lactic acid bacteria of oenological interest, it performs most of malolactic fermentation. O. oeni strains have often been studied to select malolactic starters. These strains have various genetic and phenotypic characteristics. However, the use of different typing methods failed so far to obtain a complete picture of the enological diversity of this species. The growing interest of winegrowers to better control the spontaneous requires a better knowledge of this diversity.The population of indigenous O. oeni strains present during MLF in different regions has been studied in an attempt to obtain a more complete picture of the diversity of the species and to know whether it would be appropriate to select strains of regions or wineries. The analysis of a large number of wines showed the presence of strains specific to wineproducing areas, different kind of wines, and wineries. SNP Genotyping allowed us to classify these strains in the already known genetic groups and confirmed the existence of specific groups to a specific kind of product. Some of these strains belonging to the same specific genetic groups showed similar behavior and technological properties. In addition to the diversity analysis, trials of production of strains and use of lees to ameliorate the MLF have been done to improve the achievement of spontaneous MLF. Taken together, these studies emphasize the high genetic diversity of the species O. oeni, the study of specific strains of type of wine could help understand the adaptation of this species to this environment.

El objetivo de esta tesis ha sido abordar un estudio global, tanto a nivel transcripcional como funcional, de los genes y proteínas de O. oeni involucrados en su adaptación a las condiciones del vino y al desarrollo de la FML. A partir del estudio transcripcional hemos observado una relación entre el nivel de expresión de ciertos genes y las condiciones particulares del cultivo. También hemos estudiado por primera vez en vino tinto, la expresión de un gen que codifica para la enzima β-glucosidasa. Adicionalmente, hemos encontrado que diversas proteínas se ven afectadas luego del choque con 12% etanol. Éstas están relacionadas con la biosíntesis y estabilidad proteica y a la biosíntesis de la pared celular. Estos resultados contribuyen a una mejor compresión de los mecanismos relacionados con la respuesta fisiológica de O. oeni durante la adaptación a las condiciones del vino y proveen información para la caracterización de cepas. / The objective of this thesis was to perform a comprehensive study, both transcriptional and functional, of O. oeni genes and proteins involved in its adaptation to wine conditions and in the development of the MLF. A transcriptional relationship between the level of expression of certain genes and particular conditions of the culture was observed. We have also studied the first time in red wine, the expression of one gene that encodes the enzyme β-glucosidase. We have also found that several proteins are affected after 12% ethanol shock. These are proteins related to protein biosynthesis and stability and cell envelope biosynthesis. These results contribute to a better understanding of the mechanisms related to the physiological response of O. oeni during adaptation to wine conditions. Also, the link between the behavior of genes and proteins for cell growth under these conditions provides information for the characterization of strains with oenological interest.

Oenococcus oeni joue un rôle essentiel dans l’élaboration du vin. Adaptée aux environnements acides et riches en alcool, elle est la bactérie lactique naturellement sélectionnée pour mener la fermentation malolactique (FML). Elle est ainsi la principale espèce recherchée et utilisée industriellement comme levain malolactique. Toutefois, il existe une grande diversité phénotypique au sein des souches d’O. oeni et notamment une variabilité des propriétés technologiques que sont la résistance à la lyophilisation, la résistance à l’inoculation dans le vin et la capacité à réaliser rapidement la FML. De nombreux gènes impliqués dans l’adaptation au vin ont déjà été identifiés mais, ne se sont pas toujours révélés efficaces pour la sélection de souches œnologiques. Dans ce contexte, cette étude a consisté à identifier des gènes spécifiques des souches d’intérêt technologique à travers l’analyse des plasmides et génomes. Face aux difficultés rencontrées pour purifier les grands plasmides, seul le plasmide pOENI-1 a été étudié. Ce travail a révélé différentes formes plasmidiques regroupées en une famille nommée « pOENI-1 ». Plusieurs gènes accessoires ont été identifiés et deux d’entre eux ont été détectés chez les souches associées aux fermentations malolactiques spontanées. La comparaison des génomes de souches aux propriétés technologiques diverses a également révélé des séquences génétiques qui leur sont spécifiques. L’ensemble de ces travaux a permis d’identifier plusieurs gènes dont la distribution statistique parmi les souches d’O. oeni a été analysée par la construction de courbes ROC. Ces courbes permettent d’évaluer la qualité des gènes en tant que marqueurs génétiques des souches d’intérêt technologique. Il est donc maintenant possible d’orienter la sélection des nouveaux levains malolactiques par l’utilisation des données génétiques et des outils statistiques décrits dans cette étude. / Oenococcus oeni plays an essential role in the production of wine. Adapted to acidic and alcohol rich environments, it is the lactic acid bacterium species that is naturally selected to conduct malolactic fermentation (MLF). It is also the main species that is selected and used industrially as malolactic starter. However, there is a huge phenotypic diversity among strains of O. oeni, which includes a variability of technological properties such as resistance to freeze-drying, resistance to inoculation into the wine and the ability to quickly achieve the MLF. Many genes involved in adaptation to wine have been identified but have not always proven effective in selecting wine strains. In this context, this study aimed to identify genes that are specific strains of technological interest through the analysis of genomes and plasmids. Due to difficulties encountered to purify large plasmids, only the plasmid pOENI-1 was studied. This work has revealed several different but related plasmids that were grouped into a family named "pOENI-1". Several accessory genes have been identified and two of them were detected in O. oeni strains associated with spontaneous MLF. Comparing the genomes of strains showing various technological properties also revealed genetic sequences that are specific of those strains. Altogether, these works have revealed several genes whose statistical distribution among O. oeni strains was analyzed by constructing ROC curves. These curves are used to assess the quality of genes as genetic markers of strains of technological interest. It is now possible to guide the selection of new malolactic starters by the use of genetic data and statistical tools described in this study.

Made available in DSpace on 2017-07-21T18:53:09Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Leila Roseli Diering.pdf: 1137921 bytes, checksum: 96411ec340f4cd23498229ca9ff27911 (MD5) Previous issue date: 2008-02-15 / In the Europe the fermentation process of apple juice for cider obtention comprehend 3 phases distinct, oxidative and alcoholic fermentation phase (synthesis of aromas and ethanol release respectively) and the malolatic phase (reduction of the acid). In the Brazil the process occurs in temperatures of 25-35C, presence of sulfite and with addition of yeast, resulting a fast process with predominance of aroma of yeast. In order to increase its consumption and to retake the identity of the beverage is necessary improve the quality and evaluate the processing technology. This work has as objective to evaluate the fermentation process of the cider, verified the interaction between the different microorganisms that influence in the quality. The experiments were lead with microfermentors. Were used two commercial strain Saccharomyces cerevisiae and Oenococcus oeni. The population of apiculate yeast of the apple must were superior (10 ufc.mL). In the natural fermentation the apiculate yeast had presented a fast growth, but they were supplanted by Saccharomyces sp in 3 days of fermentation, this microorganisms inhibited too the growth of the lactic bacteria. After 10 days of fermentation, the yeast starts a mortality phase that induced the bacterial growth. Inoculate of the yeast and/or the bacteria the behavior and developments of the microorganisms were similar at the natural fermentation. However with addition of lactic bacteria in the apple must, after 10 days of fermentation the populations were highest (10 ufc.mL) that can become the malolactic fermentation more efficient. / Na Europa o processo de fermentação do suco de maçã para obtenção da sidra compreende 3 fases distintas, fase oxidativa e fermentativa (síntese de aromas e produção de etanol) e fase malolática (redução da acidez). No Brasil o processo ocorre em temperaturas de 25-35 C, presença de sulfito e com adição de leveduras fermentativas, caracterizando um processo rápido e com predominância de aroma do fermento. A fim de aumentar o consumo e retomar a identidade da bebida torna-se necessário melhorar a qualidade avaliando a tecnologia. Este trabalho teve como objetivo avaliar o processo fermentativo da sidra, verificando a influência dos diferentes microrganismos, naturais ou comerciais, na sua qualidade. Os experimentos foram conduzidos em microfermentadores. Foram utilizadas duas cepas comerciais Saccharomyces cerevisiae e Oenococcus oeni. Dentre os microrganismos de interesse na fermentação, as leveduras apiculadas apresentaram as maiores populações presentes nos mostos (10 ufc.mL). Na fermentação natural as leveduras apiculadas apresentaram um rápido crescimento, mas foram suplantadas pelas fermentativas após 3 dias. As leveduras fermentativas inibiram o crescimento das bactérias láticas, porém com a autólise, após 10 dias, as bactérias retomaram o crescimento. Com o inóculo da levedura e/ou da bactéria o comportamento dos microrganismos foram semelhantes ao processo natural. Porém com inóculo de bactérias láticas no mosto as populações foram superiores (10 ufc.mL), o que pode tornar o processo de fermentação malolática mais eficiente.

Les bactériophages sont de puissants prédateurs bactériens. Leur développement est généralement redouté dans les industries agro-alimentaires mettant en oeuvre des fermentations, car les phages sont responsables d’accidents de fabrication affectant la qualité finale du produit. Leur impact lors de la vinification est moins bien défini. Le procédé comporte une étape de fermentation malolactique (FML), qui est assurée par la bactérie lactique Oenococcus oeni. La maîtrise de la FML est un moyen efficace pour protéger la qualité et la typicité des vins, vecteurs de commercialisation. Jusqu’à présent, cette étape fondamentale du processus de vinification n’est pas toujours maîtrisée. L’explication majeure réside dans l’insuffisance de la biomasse bactérienne endogène, liée aux conditions physico-chimiques difficiles du milieu. Des solutions visant à conduire rapidement la FML sont disponibles, comme l’inoculation de souches commerciales de O. oeni. Ces stratégies n’offrent toutefois pas une totale garantie de succès, et des retards ou non déclenchements de FML sont toujours observés. Ces situations inexpliquées amènent à s’interroger sur l’impact d’autres paramètres sur la fermentescibilité malolactique. L’objectif de cette thèse était d’évaluer la présence et la diversité des bactériophages antagonistes de la bactérie lactique O. oeni présents dans l’écosystème. La diversité des prophages présents dans le pangénome de O. oeni a été explorée. La lysogénie est fréquente dans l’espèce. Quatre groupes de prophages ont été identifiés sur la base de la séquence de l’intégrase, et du site de recombinaison site-spécifique utilisé. La pertinence de la classification établie a été vérifiée sur un panel de 40 phages isolés de moûts et de vins. Nos travaux suggèrent que la lysogénie est un moyen pour O. oeni de résister aux stress et aux phages, grâce à la présence de mécanismes de résistance sur les génomes prophagiques. La stabilité de la lysogénie lors de l’inoculation de souches lysogènes dans le vin et la possible libération de dérivés lytiques sont deux paramètres à prendre en compte lors des FML spontanées, et lors de l’inoculation de levains malolactiques. Ils sont susceptibles de moduler quantitativement et qualitativement la population. / Bacteriophages are responsible for the predation of bacteria. They pose an ever-present threat to the food industries because they invade and destroy the starter and affect production. Their destructive potential is currently difficult to establish during spontaneous production of wine. Malolactic fermentation (MLF) represents a main stage in the winemaking process, and is essentially driven by the lactic acid bacterium (LAB) Oenococcus oeni. A rapid and efficient FML is essential to optimize wine quality and typicity, as sales rely on top-quality products. Up to now, this essential step is not controlled, and this results from the limited growth of MLF bacteria in wine, due to stressing conditions. Inoculation of commercial bacterial starter cultures is a strategy to improve MLF control, and will allow a rapid and complete fermentation. However, despite these evolutions, sluggish or complete failures of MLF are still reported by wine farmers, either during spontaneous or directed fermentations. Such cases suggest that additional factors need to be identified. The outline of this thesis was to demonstrate the occurrence of phages infecting O. oeni in the ecosystem and provide essential information regarding phage diversity. We analyzed prophage diversity through comparative genomics and demonstrated that lysogeny is widespread. Four prophage groups were identified according to the integrase gene sequence and attachment site used for site specific recombination. The relevance of the classification scheme was verified through the analysis of a panel of 40 phages isolated from wine and must. We suggest that lysogeny helps O. oeni to cope with stress and phage attack, through the presence of specific anti-phage mechanisms harbored by the prophages. The stability of lysogens during inoculation in wine, and the possible release of lytic particules have to be considered during spontaneous or directed MLF. They are expected to shape the population.