Les bactériophages (ou phages) sont des prédateurs de bactéries et sont redoutés dans les productions agro-alimentaires mettant en œuvre des fermentations. En œnologie, la transformation du jus de raisin en vin fait appel à différents types de fermentation. La fermentation alcoolique est réalisée par des levures, et peut être suivie par une fermentation malolactique (FML), notamment pour les vins rouges, afin d’améliorer la stabilité microbiologique et les qualités organoleptiques du produit. La bactérie lactique OEnococcus oeni (O. oeni) appartient à la famille des Leuconostocaceae et est l’acteur principal de la FML. Des souches d’O. oeni sont utilisées comme levain malolactique, et inoculées dans le vin pour mieux maitriser les fermentations. O. oeni rencontre dans son environnement des phages spécifiques appelés oenophages. Toutefois, bien que la présence de ces oenophages ait été constatée, leur diversité reste à ce jour peu explorée, tout comme leurs implications dans l’élaboration du vin. Une fréquence élevée de la lysogénie a été observée dans l’espèce et parmi les levains commercialisés. Les risques associés a la présence de phages ou à la lysogénie sont des paramètres peu abordés dans la filière. Afin de répondre à ces interrogations, dans un premier axe, la diversité des oenophages a été étudiée en isolant des phages à partir d’une large collecte d’échantillons œnologiques menée dans le sud-ouest de la France. L’analyse d’échantillons de différents types de vin, de différents cépages, collectés à différentes étapes de la vinification nous a permis de mettre en lumière une diversité génomique des oenophages non suspectée. Nous avons initié le développement de nouveaux outils moléculaires pour étudier la dynamique des populations bactériennes et phagiques dans le contexte œnologique. Ainsi, une première approche par Digital Droplet PCR a été utilisée pour détecter et quantifier les populations lysogènes. Dans un deuxième axe, l’interaction phage-hôte en présence de composés phénoliques du vin a été étudiée. Les travaux suggèrent que la croissance d’O. oeni en présence de certains flavonols et acides phénoliques réduit la capacité d’adsorption des phages sur leur hôte. / Bacteriophages are viral predators of bacteria and a major concern in fermentations involved in food processing industry. In winemaking, transformation of grape juice into wine involves different types of fermentations. Alcoholic fermentation is driven by yeasts, and can be followed by malolactic fermentation (MLF), especially for red wines, which can improve microbial stability and sensorial quality of wine. The lactic acid bacterium OEnococcus oeni (O. oeni), member of Leuconostocacae family, is generally responsible for the MLF process. Strains of O. oeni are also used as starters to master MLF. O. oeni encounters specific phages called oenophages. Even though the presence of oenophages has been observed, their diversity remains poorly investigated, just like their implications in winemaking. However, high frequency of lysogeny has been observed among O. oeni strains and starters. Risks linked with the presence of phages and lysogeny are questioned in the sector. In the first part of this thesis, oenophages diversity has been studied with the isolation of a large number of phages during the collection of a broad range of oenological samples in South West France. Analysis of samples coming from different wine types and varieties, collected at different steps of winemaking enabled us to highlight an underestimated genomic diversity. We also initiated the development of new molecular tools to study population dynamics among phages and hosts in the winemaking context. Thus, a first approach by Digital Droplet PCR has been used to detect and quantify lysogenic strains. In the second part, phage-host interactions in the presence of wine phenolic compound were investigated. Our results suggest that growth of O.oeni cells in the presence of particular flavonols and phenolic acids reduces adsorption capacities of phages on their host.

La Fermentation Malo-Lactique (FML) réalisée par OEnococcus oeni est une étape importante de la vinification qui doit être maîtrisée. Bien que les vinificateurs aient à leur disposition des souches OE. oeni selectionnees la FML n’est pas toujours réussie. Les conditions physico-chimiques (pH, éthanol, température), la composition du vin et les facteurs biologiques influencent l’activite de cette bacterie ; parmi ces dernières les interactions entre micro-organismes sont primordiales. Souvent, après la fermentation alcoolique par la levure, des souches indigenes d’OE. oeni sont naturellement présentes dans le vin. Des interactions négatives peuvent alors se produire entre les souches autochtones et les souches sélectionnées apportées. Des connaissances sur ces interactions sont donc necessaires. L’objectif de ce travail etait d’etudier les interactions pendant la FML entre 5 souches d’OEnococcus oeni issues de différentes niches écologiques. Pour cela, des expériences ont été effectuées dans du milieu MRS modifié et dans des conditions proches à celles du vin (20 °C ; pH 3,5 et 10 % d’ethanol). Nous avons tout d’abord caracterise le comportement des souches en cultures pures à la fois dans les conditions de micro-aerobie et d’anaerobiose. Une grande variabilité a été retrouvée entre les souches dans les 2 conditions : trois des 5 souches sont favorisées en conditions d’anaerobiose tandis que les deux autres se sont mieux développées en conditions de micro-aérobie. La présence de 4 g.L-1 d’acide L-malique dans le milieu permet de produire, pour toutes les souches, une biomasse environ 2 fois plus élevée que celle obtenue dans le milieu sans acide L-malique. La totalite de l’acide malique est consommee par les 5 souches mais avec des vitesses différentes. Pour une souche donnée la vitesse spécifique de consommation d’acide L-malique (ν) et la vitesse specifique de croissance (μ) presentent des profils similaires au cours de la FML. Elles ont été reliées par un modèle mathématique qui a permis de quantifier ce lien pour chaque souche. Les interactions lors des cultures mixtes des 10 couples formés par les 5 souches ont ensuite été étudiées dans un Bio-Réacteur à Membrane (BRM) en anaérobiose. Trois catégories ont été mises en évidence: interactions à effets négatifs réciproques sur la croissance des 2 souches en culture mixte ; interactions à effet négatif sur la croissance de la souche la plus rapide en culture pure et à effet positif sur la croissance de la souche la plus lente en culture pure et interactions à effets positifs sur la souche la plus rapide en culture pure. La comparaison des cultures pures et mixtes a révélé que l’activite specifique de croissance des souches est affectee en culture mixte, ce qui provoque le prolongement de la phase de la latence dans le cas de l’inhibition et son raccourcissement dans le cas de la stimulation. La modelisation de la consommation d’acide L-malique a révélé pour certains couples une activation de la consommation de cet acide bien que la croissance soit fortement inhibée. Ces interactions, qui affectent le déroulement de la FML, ne peuvent etre dues qu’a l’effet de metabolite(s) extracellulaire(s) excretee(s) dans le milieu de fermentation. Ces métabolites restent à identifier. / In winemaking, the control of malolactic fermentation (MLF) by OEnococcus oeni is an essential step for this process. Although winemakers have the availability for selected OE.oeni strains, the MLF is not always successful. The physical-chemical conditions (pH, ethanol, and temperature), the composition of wine, and biological factors, all together influence the activity of this bacterium; regarding biological factors, the interactions between microorganisms are essential. Often, after alcoholic fermentation by yeast, indigenous strains of OE.oeni are naturally present in wine, negative interactions can then occur between the indigenous strains and selected strains; therefore, knowledge on these interactions is needed. The goal of the present work was to study the interactions during MLF between five strains of OE.oeni from different origins. Experiments were performed in the modified MRS medium to be in nearly conditions to those of wine (20 °C, pH 3.5, and 10% ethanol). The characterization of the behavior of strains in pure cultures was done under both, micro-aerobic and anaerobic conditions; a large variability was found between the strains in the two conditions: three out of five strains were favored under anaerobic conditions while the two others were better developed in micro-aerobic conditions. The presence of 4 g.L-1 of L-malic acid in the culture medium increased the biomass produced, about two-fold higher than that obtained in medium without L-malic acid. All of the L-malic acid is consumed by the five strains but at different specific rates. A mathematical model allowed to quantifying the relationship between the specific consumption rate of L-malic acid (ν) and the specific growth rate two specific rates for each strain; for a given strain, both rates have similar profiles during the MLF. Interactions in mixed cultures of 10 couples formed by the five strains were then examined in a Membrane Bioreactor (BRM) under anaerobic conditions. Three different interaction types were identified: 1) negative reciprocal interactions of the both strains in mixture culture, 2) interaction that affect negatively the favored strain in pure culture and positively the slowest one, and 3) interaction with positive effect on the fastest strain in pure culture. Comparison of pure and mixed culture showed that the specific activity of strains was affected in mixture culture causing the extension of the lag phase in the case of inhibition and its shortcut in the case of stimulation. Modeling of the consumption of the L-malic acid revealed activation of the consumption of this acid for some couples however, growth is strongly affected. The interactions affecting the course of the MLF are due solely to the effect of excreted extracellular metabolite(s); these metabolites remain to be identified

Oenococcus oeni est la principale bactérie lactique retrouvée dans les fermentations malolactiques (FML) spontanées du vin. Pendant la FML, l’acide malique est converti en acide lactique, modulant l’acidité du vin et améliorant son goût. L’activité métabolique d’O. oeni produit aussi des changements dans la composition du vin, modifiant son profil aromatique. Des études précédentes ont suggéré que l’espèce est divisée en deux principaux groupes génétiques, désignés A et B. Nous avons examiné les souches d’O. oeni sous des approches de génomique comparative à l’aide d’outils bioinformatiques développés sur place, dévoilant l’existence de nouveaux de groupes et sous-groupes de souches. En outre, nos résultats suggèrent que certains groupes contiennent des souches qui sont adaptées à des produits spécifiques tels que le vin rouge, vin blanc, champagne et cidre. Ce phénomène est visible à différents niveaux des génomes des souches : l’identité de séquence, les signatures génomiques, et les caractéristiques génomiques spécifiques de groupes telles que la présence/absence de gènes et les mutations uniques. Afin de comprendre l’impact des caractéristiques génomiques dans l’adaptation de l’espèce à différents produits, nous avons sélectionné une collection de souches isolées de la même région, mais appartenant à deux groupes génétiques différents et adaptées soit au vin rouge, soit au vin blanc. Une analyse de données génomiques et métabolomiques intégrées révèle que les caractéristiques génomiques des souches de chaque groupe ont un impact sur l’adaptation des bactéries à leurs niches respectives et sur la composition de la fraction volatile du vin. / Oenococcus oeni is the main lactic acid bacteria found in spontaneous malolactic fermentation (MLF) of wine. During MLF, malic acid is converted into lactic acid, modulating wine’s acidity and improving its taste. The metabolic activity of O. oeni also produces changes in the composition of wine, modifying its aromatic profile. Previous studies have suggested that the species is divided in two major phylogenetic groups, namely A and B. We have examined O. oeni under comparative genomics approaches by the aid of bioinformatics tools developed in-place, unveiling the existence of more phylogenetic groups of O. oeni than previously thought. Moreover, our results suggest that certain groups are domesticated to specific products such as red wine, white wine, champagne and cider. This phenomenon is visible at different levels of the strains’ genomes: sequence identity, genomic signatures, and group-specific features such as presence/absence of genes and unique mutations. With the aim of understanding the impact of group-specific genomic features on the species adaptation to different products, we have selected a set of strains isolated from the same region, but belonging to two different genetic groups and adapted either to red wine, either to white wine. An integrated analysis of genomic and metabolomic data reveals that the genomic features of each genetic group have an impact on the strains adaptation to their respective niches, affecting the composition of the volatile fraction of wine.

La production de la majorité des vins rouges et de certains types de vins blancs et de vins pétillants requiert deux étapes fermentaires successives. La première est la fermentation alcoolique (FA) réalisée principalement par Saccharomyces cerevisiae. A la fin de la FA, les vins sont soumis à la fermentation malolactique (FML) réalisée principalement par Oenococcus oeni. Cependant, la FML est souvent difficile à déclencher et accomplir à cause de l’activité antibactérienne individuelle ou synergique de différents paramètres physicochimiques du vin et de métabolites levuriens inhibiteurs. Dans ce contexte, l’étude des interactions qui peuvent avoir lieu entre les souches de levures et de bactéries est importante pour le choix adéquat des souches et de la stratégie d’inoculation. Dans le présent travail, S. cerevisiae souche D a fortement inhibé O. oeni souche X pendant les fermentations séquentielles réalisées dans des milieux synthétiques jus de raisin (MSJ) alors que la souche levurienne A s’est révélée stimulatrice. Des traitements protéasiques et thermiques des MSJ fermentés par la souche D ont démontré la nature protéique des métabolites levuriens inhibiteurs. Le fractionnement par ultrafiltration de ces mêmes milieux a montré qu’une fraction peptidique extracellulaire de 5-10 kDa était responsable de l’inhibition de la FML. Elle a été graduellement relarguée au cours de la FA et a atteint sa concentration maximale à un stade avancé de la phase stationnaire. L’inhibition de la FML a été maintenue dans les jus de raisin commerciaux et les moûts naturels (CabernetSauvignon et Syrah) présentant des teneurs faibles et élevées en composés phénoliques. Ces derniers n’ont pas pu donc modifier l’activité biologique des peptides inhibiteurs. La fraction 5-10 kDa a été testée in vitro sur un extrait cellulaire contenant l’enzyme malolactique dans une gamme de pH comprise entre 3,5 et 6,7. Les résultats ont montré qu’elle a pu directement inhiber l’activité de l’enzyme malolactique avec une cinétique d’inhibition croissante corrélée à l’avancement de la fermentation alcoolique. La fraction 5-10 kDa du précipité au sulfate d’ammonium (60-80 %) a ensuite été analysée par chromatographie échangeuse d’ions. Les éluats récupérés avec 0,5 M NaCl par chromatographie anionique et cationique ont renfermé des peptides inhibiteurs et ont été migrés sur SDSPAGE. Les bandes d’intérêt ont ensuite été coupées et séquencées par LC1D-nanoESI-LTQ-Orbitrap. Les résultats ont montré 12 peptides qui ont probablement travaillé en synergie. 2 fragments de GAPDH de 0,9 et 1,373 kDa ayant un pI de 9,074 et un fragment de Wtm2p de 2,42 kDa ayant un pI de 3,35 sont impliqués dans l’inhibition de la FML. / The production of most red wines and certain white and sparkling wine styles requires two consecutive fermentation steps. The first one is the alcoholic fermentation (AF) and is carried out mainly by Saccharomyces cerevisiae. At the end of the AF, the wines undergo malolactic fermentation (MLF) carried out mainly by Oenococcus oeni. However, the MLF is often difficult to trigger and accomplish because of the individual or synergistic antibacterial activity of several physical chemical wine parameters and yeast inhibitory metabolites. In this context, the study of the interactions that may occur between specific strains of yeasts and bacteria is important for choosing the adequate strain combination and inoculation strategy. In the present work, S. cerevisiae strain D strongly inhibited O. oeni strain X during sequential fermentations performed in synthetic grape juice (SGJ) media whereas S. cerevisiae strain A stimulated it. Protease and heat treatments of the SGJ media fermented by strain D showed the protein nature of the yeast inhibitory metabolites. Fractionation by ultrafiltration of the same media revealed that an extracellular peptidic fraction of 5-10 kDa was responsible for the inhibition. It was gradually released during AF and reached its highest concentration at late stages of the stationary phase. The MLF inhibition was maintained in natural grape juices and grape musts (Cabernet-Sauvignon and Syrah) presenting low and high phenolic contents. Therefore, the activity of the inhibitory peptides was not affected by grape phenolic compounds. The 5-10 kDa fraction was tested in vitro on cell-free bacterial cytosolic extracts containing the malolactic enzyme in a pH range between 3.5 and 6.7. Results showed that it was able to directly inhibit the malolactic enzyme activity with an increasing inhibitory kinetic correlated to the AF time at which it was collected. The 5-10 kDa peptidic fraction of the 60-80 % ammonium sulfate precipitate was submitted to analyses by both anionic and cationic exchange chromatography (AEXC and CEXC). Eluates recuperated with 0.5 M NaCl from both AEXC and CEXC contained inhibitory peptides and were further migrated by SDS-PAGE. The bands of interest were excised and sequenced by LC1D-nanoESI-LTQ-Orbitrap. Results gave 12 different peptidic fractions that may have worked synergistically. 2 GAPDH fragments of 0.9 and 1.373 kDa having a pI of 9.074 and a Wtm2p fragment of 2.42 kDa having a pI of 3.35 were involved in the MLF inhibition.

La fermentation malolactique permet une désacidification et une amélioration de la qualité du vin. Elle est réalisée par des bactéries lactiques principalement de l’espèce Oenococcus oeni : cette espèce est privilégiée pour son efficacité et ses intérêts organoleptiques. La capacité de O. oeni à résister au stress du vin et à garder son activité fermentaire est un sujet d’intérêt majeur. Les prélèvements des fûts de chêne ont montré que O. oeni adhère au bois et est capable de persister plusieurs mois dans le vin. Or, dans la majorité des habitats naturels, les microorganismes se développent attachés à un support, au sein d’un écosystème structuré appelé biofilm. Sous cette forme de vie, les cellules bénéficient d’une résistance accrue au stress. Ces deux propriétés que sont l’adhésion à une surface ainsi que la résistance au stress ont donc été étudiées pour O. oeni. Des observations par microscopie électronique à balayage ont ainsi permis de mettre en évidence la formation de biofilms par O. oeni. Puis, nous avons évalué la capacité de résistance au stress du vin de O. oeni sous forme de biofilm. L’intérêt pour le biofilm est croissant dans les industries agroalimentaires et biotechnologiques, en raison de la conservation de son activité métabolique en milieu stressant. C’est pourquoi la fermentation malolactique avec un biofilm de O. oeni a été suivie dans le vin. Enfin, l’influence du biofilm de O. oeni sur les transferts de composés aromatiques entre le bois et le vin a été étudiée. Cette étude est la première caractérisation du biofilm de O. oeni, de sa résistance au stress du vin et de son potentiel fermentaire / Malolactic fermentation improves wine quality, mainly by decreasing acidity. It is carried out by lactic acid bacteria, mainly Oenococcus oeni. This species is favored for its efficiency and its organoleptic outcome. O. oeni ability to withstand wine stress and to keep its fermentation activity is a subject of major interest.Samples of oak showed that O. oeni adheres to wood and is able to persist for several months in wine. However, in the majority of natural habitats, microorganisms grow attached to a surface, within a structured ecosystem called biofilm. In this form of life, cells benefit from an increased stress resistance.These two properties, adherence to a surface and stress resistance, were studied for O. oeni. Observations by scanning electron microscopy have highlighted biofilm formation by O. oeni. Then, we evaluated the wine stress resilience of O. oeni biofilm. Biofilm is a growing interest in food and biotechnology industries, due to the conservation of its metabolic activity in stressful environment. Therefore, malolactic fermentation with an O. oeni biofilm was monitored in wine. Finally, the influence of O. oeni biofilm on transfers of aromatic compounds between wood and wine was studied.This study is the first characterization of O. oeni biofilm, its wine stress resistance and its fermentation potential.

Les amines biogènes sont des composés allergènes, notamment rencontrés dans les produits fermentés tel que le vin. Les bactéries lactiques du vin, dont Oenococcus oeni, le principal acteur de la fermentation malolactique, sont capables de produire ces molécules, à partir de précurseurs azotés. Afin de réduire la teneur en amines biogènes, il est nécessaire de comprendre le rôle de cette production, chez les souches impliquées dans la synthèse de ces métabolites. Le projet européen BiamFood FP7 (n°211441) a été mis en place pour répondre à cette problématique. Au cours de mon travail de thèse, des outils moléculaires ont été développés afin de muter de manière ciblée les gènes de O. oeni et d’exprimer des gènes d’intérêt. Ainsi, les clusters hdc de Lactobacillus hilgardii et odc de O. oeni, responsables respectivement de la synthèse de l’histamine et de la putrescine, ont été clonés dans le vecteur pGID052 et transférés dans la souche de laboratoire O. oeni ATCC BAA-1163, déficiente pour la production d’amines biogènes. Cette stratégie n’ayant pas donnée lieu à la production d’amine biogène, mon travail de recherche s’est orienté vers la caractérisation biochimique de l’ornithine décarboxylase de O. oeni. L’ornithine décarboxylase de O. oeni BR14/97 a été sur-produite chez E. coli via le système pET. Après purification de l’enzyme, le pH optimal et la température optimale de fonctionnement, 5,5 et 35°C respectivement, ont été caractérisés. Les constantes cinétiques Km = 1 mM et Vmax = 0,57 U. mg-1 ont également été déterminées en mesurant la putrescine produite par HPLC (Gomez-Alonso et al, 2007). De plus, l’ODC de O. oeni BR14/97 est spécifique de la L-ornithine et ne peut pas dégrader la L-lysine en cadavérine, ce qui implique la présence d’une voie métabolique propre à la production de cadavérine chez cette souche. Dans un second axe du projet, l’influence de la source azotée et notamment des peptides versus acides aminés libres, a été étudiée chez une souche de Lactobacillus plantarum, isolée du vin et productrice de tyramine. Les peptides contenant de la tyrosine, sont utilisés par cette souche pour former de la tyramine. La production augmente en phase stationnaire de croissance, et est corrélée à l’expression du transporteur tyrP. L’analyse de la tyrosine présente dans le milieu de culture montre que ces peptides seraient dégradés dans le milieu extracellulaire chez L. plantarum. / Biogenic amines are indesirable compounds found in fermented products like wine. Lactic acid bacteria from wine, including Oenococcus oeni, the main actor of malolactic fermentation, are able to produce these molecules from nitrogenous precursors. In order to limited biogenic amines accumulation, it is necessary to understand the role of this production by strains responsible for the synthesis of these metabolites in food. That is why the European BiamFood project was put in place. Along my thesis, molecular tools were developed in order to mutate O. oeni genes (encoding decarboxylases), and to express genes of interest. Genetic clusters hdc from L. higardii and odc from O. oeni, responsible for histamine and putrescine synthesis respectively, were cloned into the pGID052 vector and transferred into the laboratory strain O. oeni ATCC BAA-1163, which is not able to produce any biogenic amines. However no biogenic amines production was observed. My work thesis was then redirected in the in vitro biochemical characterization of the ODC from O. oeni. The odc from O. oeni BR14/97 was overproduced in E. coli BL21 via the pET system. Optima pH and temperature were determined with the purified enzyme obtained. Kinetic constants Km = 1 mM and Vmax = 0,57 U.mg-1 were also determined by measuring putrescine production by HPLC (Gomez-Alonso et al, 2007). Furthermore, ODC from O. oeni BR14/97 is specific for the L-ornithine and can not decarboxylated the L-lysine into cadaverine. In a second part of the BiamFood project, the impact of nitrogen sources, especially peptides compared to free amino acids, was studied in a Lactobacillus plantarum strain, isolated from wine and able to produce tyramine. Peptides containing tyrosine residues are used by this strain to produce tyramine. Tyramine production increases during the growth and reaches a maximum at stationary phase. The production is correlated with tyrP expression. The tyrosine measured in culture media shows that peptides may be hydrolyzed in the extracellular medium in L. plantarum.

INFLUÈNCIA DE COMPONENTS DELS VINS SOBRE EL METABOLISME D'Oenococcus oeni I SOBRE LA SEVA DINÀMICA DE POBLACIONS A LA FERMENTACIÓ MALOLÀCTICALa fermentació malolàctica (FML) del vi és el resultat del metabolisme d'algunes espècies de bacteris làctics que converteix l'àcid L-(-)-màlic en L-(+)-làctic i CO2. L'espècie Oenococcus oeni és la més tolerant a les condicions poc favorables del vi (deficiències nutritives, pH baix, etanol, àcids grassos dels llevats, SO2, etc.) i la que habitualment realitza la FML. A part de la disminució d'acidesa, la FML contribueix a l'estabilització microbiològica del vi i a millorar-ne les qualitats organolèptiques. Alguns paràmetres bioquímics indicadors de l'estat metabòlic cel·lular són l'activitat ATPasa, l'expressió de proteïnes d'estrès i d'exoproteases involucrades en l'obtenció de fonts de nitrogen. D'altra banda, algunes de les condicions desfavorables per al creixement bacterià poden influir sobre la dinàmica de poblacions de bacteris làctics durant la FML, tant a nivell d'espècie com de soca. Els estudis realitzats en aquesta tesi indiquen que l'activitat ATPasa de membrana, deguda principalment a una H+-ATPasa, es veu afectada per concentracions inhibidores de la viabilitat cel·lular d'etanol, SO2, coure i àcids grassos, per la qual cosa es pot establir una relació directa entre la inhibició del creixement d'O. oeni en condicions reals de vinificació i la inhibició de l'activitat ATPasa. Al seu torn, l'etanol no produeix un perfil de proteïnes de membrana excessivament diferent respecte al control, mentre que la incubació en condicions àcides o en presència de l'àcid gras C12 inhibeix, en general, l'expressió proteica.El coure i l'acidesa afavoreixen la sobreexpressió d'una proteïna de membrana, de 40 kDa, així com el SO2, la seqüència N-terminal de la qual correspon a la família de gliceraldehid-3-fosfatdeshidrogenases (GAPDH). El SO2 també inhibeix l'activitat GAPDH citoplasmàtica, i per tant, el mecanisme glucolític d'obtenció d'energia per part d'O. oeni.Mitjançant RT-PCR, s'ha comprovat que els nivells d'expressió gènica d'hsp18 (gen d'una proteïna d'estrès descrita en O. oeni) en resposta al xoc tèrmic són fins a cinquanta vegades superiors que en les condicions controls, mentre que en presència de concentracions de C12, coure o SO2 inhibidores del creixement, únicament s'observa una certa inducció en resposta al coure i en condicions de fase exponencial de creixement. Pel que fa a l'activitat exoproteasa, aquesta no és significativa en les condicions experimentals emprades i en les soques estudiades, excepte al final de la fase exponencial de creixement i en presència de dosis elevades d'etanol (14 %). En condicions de carència nutricional nitrogenada, s'ha observat una relació directa entre la biodisponibilitat de nitrogen α-aminat i la taxa de creixement d'O. oeni.S'assajaren diferents condicions de microvinificació, amb tres soques diferents (CECT 4100, soca tipus; CR1, soca aïllada pel nostre grup de recerca, i Vitilactic, soca comercial). La soca tipus va mostrar menor capacitat d'adaptació, mentre que la soca aïllada s'implantà en la majoria de casos. Per a comprovar-ho, s'empraren tècniques de Biologia Molecular, com ara la PCR i la RAPD-PCR. En vinificacions amb concentracions moderades i elevades de SO2 i lisozim, s'observà un predomini de l'espècie O. oeni ja des de l'inici de la fermentació alcohòlica, i una evolució diferent de les poblacions en presència de lisozim. En tots els casos, una mateixa soca s'imposà durant la FML, i coincideix amb la que s'havia implantat en campanyes anteriors i aïllada pel nostre grup com a CR1. / INFLUENCE OF WINE COMPONENTS OVER THE METABOLISM OF Oenococcus oeni AND OVER THE POPULATION DYNAMICS DURING MALOLACTIC FERMENTATIONMalolactic fermentation (MLF) in wine is carried out by certain lactic bacteria which decarboxylate L-malic acid to L-lactic and CO2. Oenococcus oeni is the most tolerant species under the unfavourable wine conditions (nutrients starvation, low pH, ethanol, fatty acids from yeasts, SO2, etc.) and the main responsible of driving the MLF. As a consequence of the MLF, the wine quality improves because the acidity decreases, the organoleptic characteristics are better and the microbiological stability of wine increases. Some biochemical parameters, indicators of metabolic cellular conditions, are the ATPase activity and the expression of stress proteins and exoproteases involved in the obtention of nitrogen. On the other hand, some unfavourable conditions for bacterial growth can modify the bacterial population dynamics during MLF by effects over species and strains of the same species. The studies performed in this work show that ATPase-membrane activity principally corresponds to an H+-ATPase, which is affected by cellular viability inhibitory concentrations of ethanol, SO2, copper and fatty acids. So, a direct relationship between growth inhibition of O. oeni in real cellar conditions and ATPase activity inhibition is stablished. The stress protein profile produced by ethanol is not significantly different from the control's one, whereas the incubation in acidic conditions or in the presence of C12 fatty acid inhibits the protein expression in general. Copper and low pH induce the overexpression of a proteinic band close to 40 kDa, as SO2 does, which N-terminal sequence shows a significant identity with the family of glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenases (GAPDH). In his turn, SO2 inhibits the cytoplasmatic GAPDH activity also. Using RT-PCR, it has been shown that gene expression levels of hsp18 (the gene of a heat-shock protein found in O. oeni) as a response to the heat shock are near fifty-fold greater than in normal conditions. On the other hand, in contact with inhibitory concentrations of C12, copper or SO2, it only appears weak induction as a response to copper. About the exoprotease activity, this one is not significative in the strains studied, except for final exponential growth phase in the presence of high ethanol levels (14 %). Under conditions of nitrogen starvation, it's observed a direct relationship between the bioavailability of α-amino nitrogen and growth rate of O. oeni. Different microvinification conditions were assayed using three different strains (CECT 4100 as the type strain; CR1, an strain isolated by our research group, and Vitilactic, a commercial strain). The type strain showed fewer ability for adaptation, whereas the isolated strain was the responsible for performing the FML the most times. To demonstrate that, we used Molecular Biology techniques, like specific PCR and RAPD-PCR. In cellar vinifications with normal and high levels of SO2 and lysozyme, it was observed a dominance of O. oeni species from the beginning of the alcoholic fermentation, and a different evolution of the populations in the presence of lysozyme. In all the cases, it's the same strain which performs FML and it coincides with that one imposed in other campaigns and isolated by our group as CR1.

Les résultats obtenus dans ce travail ont permis de démontrer que chez les deux bactéries lactiques modèles, L. lactis subsp. cremoris et O. oeni, la transcription du gène cfa, codant pour la Cfa synthase, est stimulée lorsque les cellules entrent en phase stationnaire de croissance ou lorque que les cellules sont cultivées en conditions de stress (milieu acide ou présence d'éthanol dans le milieu). Le rôle des CFA a pû être appréhendé par l'analyse physiologique comparative de la souche parentale L. lactis subsp. cremoris et du mutant Δcfa généré chez cette souche. Les forts pourcentages de survie obtenus chez les souches cultivées à pH 5,0, puis subissant un stress acide (pH 3,0), prouvent que la cyclopropanation des acides gras insaturés n'est pas indispensable à la survie de L. lactis subsp. cremoris en conditions de stress acide. En outre, les données d'anisotropie de fluorescence démontrent que la présence de CFAs membranaires ne permet pas de réguler le niveau de fluidité membranaire, en particulier avec les souches cultivées en présence d'éthanol, où une fluidification membranaire est observée dans tous les cas. L'hypothèse d'un équilibre entre les acides palmitoléique / cis-vaccénique / lactobacillique pour réguler la fluidité membranaire chez L. lactis subsp. cremoris est avancée. L'étude du rôle physiologique des CFA chez O. oeni nécessite l'expression du gène cfa de la bactérie en système hétérologue. Les résultats obtenus confirment la fonctionnalité du gène chez la bactérie hôte L. lactis subsp. cremoris, cependant la cyclisation du précurseur acide cis-vaccénique, reste partielle chez la souche mutante complémentée. Un travail de caractérisation biochimique in vitro de l'enzyme Cfa synthase de O. oeni a donc été entrepris afin d'expliquer la faible efficacité de l'enzyme de O. oeni chez la bactérie hôte. Les travaux réalisés ont permis la surproduction et la purification de l'enzyme. Une technique de mesure d'activité in vitro a été également développée. Une stratégie d'expression du gène cfa de O. oeni en système hétérologue dans la bactérie hôte E. coli BL21 Star a permis la surpoduction d'une protéine d'environ 45 kDa, en accord avec la masse moléculaire théorique de la Cfa synthase de O. oeni. A partir de l'extrait protéique, une purification a été réalisée par chromatographie d'affinité sur colonne d'agarose nickel. Les tests d'activité enzymatique in vitro ont pu été réalisés. La température optimale de l'enzyme est de 35,8°C. Son pH optimal est de 5,6. Même en se plaçant dans les conditions physico-chimiques optimales de l'enzyme, nous constatons que la cyclisation in vitro de l'acide cis-vaccénique issu des phospholipides membranaires du mutant L. lactis subsp. cremoris Δcfa reste partielle. Ceci induit une détermination expérimentale de valeurs de KM et Vmax largement supérieures aux données citées dans la littérature. La différence, entre les deux bactéries modèles, de nature et de répartition des phospholipides membranaires pourrait expliquer l'action partielle de la Cfa synthase de O. oeni.

Les résultats obtenus dans ce travail ont permis de démontrer que chez les deux bactéries lactiques modèles, L. lactis subsp. cremoris et O. oeni, la transcription du gène cfa, codant pour la Cfa synthase, est stimulée lorsque les cellules entrent en phase stationnaire de croissance ou lorque que les cellules sont cultivées en conditions de stress (milieu acide ou présence d’éthanol dans le milieu). Le rôle des CFA a pû être appréhendé par l’analyse physiologique comparative de la souche parentale L. lactis subsp. cremoris et du mutant Δcfa généré chez cette souche. Les forts pourcentages de survie obtenus chez les souches cultivées à pH 5,0, puis subissant un stress acide (pH 3,0), prouvent que la cyclopropanation des acides gras insaturés n’est pas indispensable à la survie de L. lactis subsp. cremoris en conditions de stress acide. En outre, les données d'anisotropie de fluorescence démontrent que la présence de CFAs membranaires ne permet pas de réguler le niveau de fluidité membranaire, en particulier avec les souches cultivées en présence d’éthanol, où une fluidification membranaire est observée dans tous les cas. L'hypothèse d'un équilibre entre les acides palmitoléique / cis-vaccénique / lactobacillique pour réguler la fluidité membranaire chez L. lactis subsp. cremoris est avancée. L’étude du rôle physiologique des CFA chez O. oeni nécessite l’expression du gène cfa de la bactérie en système hétérologue. Les résultats obtenus confirment la fonctionnalité du gène chez la bactérie hôte L. lactis subsp. cremoris, cependant la cyclisation du précurseur acide cis-vaccénique, reste partielle chez la souche mutante complémentée. Un travail de caractérisation biochimique in vitro de l’enzyme Cfa synthase de O. oeni a donc été entrepris afin d’expliquer la faible efficacité de l’enzyme de O. oeni chez la bactérie hôte. Les travaux réalisés ont permis la surproduction et la purification de l’enzyme. Une technique de mesure d’activité in vitro a été également développée. Une stratégie d’expression du gène cfa de O. oeni en système hétérologue dans la bactérie hôte E. coli BL21 Star a permis la surpoduction d’une protéine d’environ 45 kDa, en accord avec la masse moléculaire théorique de la Cfa synthase de O. oeni. A partir de l’extrait protéique, une purification a été réalisée par chromatographie d’affinité sur colonne d’agarose nickel. Les tests d’activité enzymatique in vitro ont pu été réalisés. La température optimale de l’enzyme est de 35,8°C. Son pH optimal est de 5,6. Même en se plaçant dans les conditions physico-chimiques optimales de l’enzyme, nous constatons que la cyclisation in vitro de l’acide cis-vaccénique issu des phospholipides membranaires du mutant L. lactis subsp. cremoris Δcfa reste partielle. Ceci induit une détermination expérimentale de valeurs de KM et Vmax largement supérieures aux données citées dans la littérature. La différence, entre les deux bactéries modèles, de nature et de répartition des phospholipides membranaires pourrait expliquer l’action partielle de la Cfa synthase de O. oeni. / The results obtained in this work have shown that in both lactic acid bacteria models, L. lactis subsp. cremoris and O. oeni, transcription of the cfa gene, encoding the Cfa synthase is stimulated when cells enter stationary phase of growth or when the cells are grown under stress conditions (acidic or presence of ethanol in the medium). The role of the CFAs has been apprehended by the comparative physiological analysis of the parental strain L. lactis subsp. cremoris and a Δcfa mutant generated in this strain. The high percentages of survival obtained in strains grown at pH 5.0 and undergoing acid stress (pH 3.0) prove that the cyclopropanation of unsaturated fatty acids is not essential to the survival of L. lactis subsp. cremoris under conditions of acid stress. In addition, fluorescence anisotropy data show that the presence of membrane CFA does not regulate the level of membrane fluidity, especially with strains grown in the presence of ethanol. The assumption of a balance between palmitoleic acid / cis-vaccenic acid / lactobacillic acid in membrane fluidity regulation in L. lactis subsp. cremoris is advanced. The study of the physiological role of CFA in O. oeni requires cfa gene expression of the bacterium in a heterologous system. The results confirm the functionality of the gene in the host bacterium L. lactis subsp. cremoris. However, the cyclopropanation of the precursor cis-vaccenic acid remains partial in the mutant strain complemented. Biochemical characterization in vitro of the enzyme CFA synthase from O. oeni was therefore undertaken in order to explain the low efficiency of the enzyme of O. oeni in the host bacterium. The work led to the overproduction and purification of the enzyme. A technique for measuring the activity in vitro has also been developed. A strategy of O. oeni cfa gene expression in the heterologous host bacterium E. coli BL21 Star has permitted the surpoduction of a protein of approximately 45 kDa. This data is in agreement with the theoretical molecular weight of the CFA synthase from O. oeni. Protein purification was performed by affinity chromatography on nickel-agarose column. Enzymatic activity assays in vitro have been made. The optimum temperature for the enzyme is 35.8 ° C. Its optimum pH is 5.6. However, we find that the in vitro cyclopropanation of cis-vaccenic acid from membrane phospholipids of the mutant L. lactis subsp. cremoris Δcfa remains partial. This leads to an experimental determination of KM and Vmax values much higher than the data cited in the literature. The difference between the nature and the distribution of membrane phospholipids in the two model bacteria may explain the partial activity of Cfa synthase from O. oeni.

Thermal processing has been used as a means of modifying the sensory aspects of wine. Cabernet Sauvignon wines were heated prior to dejuicing (3C per day from 25C to 42C) or after bottling (42C for 21 days) to determine the effects on total glycosides and glycosidic fractions. Total and phenol-free glycosidic concentrations in the wine and skins were quantified by analysis of glycosyl-glucose. Pre-dejuicing thermal vinification resulted in higher total glycosides (12%), phenol-free glycosides (18%), total hydroxycinnamates (16%), large polymeric pigments (LPP) (208%) small polymeric pigments (SPP) (41%), and lower monomeric pigments (42%) in wines. Skins had lower total glycosides (-16%), and no significant difference in phenol-free glycosides. Post-bottling heat treatment resulted in lower total (-15%) and phenol-free (-16%) glycosides, increased hue (25%), a 62% increase in LPP and a 29% decrease in monmeric pigments. A second study investigated the potential of enological spoilage microorganisms to affect wine aroma, flavor, and color. The activities of b-glucosidase were determined in model systems for fourteen strains of Brettanomyces bruxellensis yeast and nine strains of lactic acid bacteria (Oenococcus oeni). All Brettanomyces strains and seven Oenococcus strains exhibited enzymatic activity. B. bruxellensis b-glucosidase activity was primarily intracellular; O. oeni showed some extracellular activity. Yeasts and bacteria showing activity greater than 1000 nmole mL-1 g -1 for Brettanomyces, or 100 nmole mL-1 g -1 for Oenococcus, were evaluated for their effect on Viognier grape glycosides. Neither was active on native grape glycosides. / Master of Science