Gegenstand der Untersuchung: Vorliegende Arbeit stellt eine molekularbiologische Studie dar, die der Frage nachging, ob der Genotyp für die NAT2 eine Rolle bei der Pathogenese des Mammakarzinoms spielt. Das Mammakarzinom hat eine erbliche Komponente. Neben hoch-penetranten genetischen Mutationen des BRCA1- und BRCA2-Gens stehen polymorphe Enzyme des Fremdstoffwechsels im Verdacht, Präkanzerogene zu aktivieren und somit das Karzinomrisiko zu erhöhen. Die NAT2 detoxifiziert aromatische Amine, wie sie z. B. im Zigarettenrauch enthalten sind und weist eine ausgesprochene bimodale Aktivitätsverteilung auf. Nach systematischer Aufklärung des genetischen Polymorphismus der NAT2 ist eine Vorhersage des Phänotyps mit hoher Sicherheit möglich. Design: Es wurde eine prospektive Fall-Kontroll-Studie an 248 Patientinnen mit Mammakarzinom und 248 Kontrollen (Patientinnen mit anderen, nicht malignen Erkrankungen und Gesunde) durchgeführt. Zusätzlich wurde eine Blutprobe entnommen, aus der DNA isoliert wurde. Damit wurden folgende Mutationen des NAT2-Gens bestimmt: G191A, C282T, T341C, C481T, G590A, A803G, G857A. Anhand dieser Mutationen erfolgte die Zuordnung zu Haplotypen. Da bekannt ist, welche mittlere Aktivität der NAT2 bei den einzelnen Genotypen zu erwarten ist, konnte mit dieser Information eine Vorhersage der Aktivität als "schnelle" und "langsame" Acetylierer vorgenommen werden. Methode: Die Genotypisierung erfolgte durch Amplifikation des NAT2 -Gens mit verschiedenen Primern in der PCR, anschließendem Verdau mit Restriktionsenzymen und Charakterisierung der Fragmente mittels Gelelektrophorese. Statistik: Mit der Berechnung von "Odds ratios" und multivariaten logistischen Regressionsanalysen zur Berücksichtigung möglicher Einflussfaktoren wurde der Zusammenhang zwischen NAT2-Genotyp bzw. daraus vorhergesagtem Phänotyp und Mammakarzinom überprüft. Ergebnisse: Es wurden acht verschiedene NAT2-Haplotypen nachgewiesen. 2 Haplotypen (*4 und *12A) kodieren für einen schnellen Acetylierer-Typ, 6 Haplotypen (5A, 5B, 5C, 6A, 7B und 14*B) für den langsamen Acetylierer-Typ. 55,6% der MC-Patientinnen und 58% der Kontrollpersonen Genotypen wiesen den langsamen Acetyliererstatus auf. Dies entspricht in etwa der von anderen Untersuchern beschriebenen Häufigkeit bei Kaukasiern. Es fand sich keine Überrepräsentierung bestimmter Genotypen oder Haplotypen in der Gesamtgruppe der Patientinnen mit Mammakarzinom im Vergleich zur Kontrollgruppe. Die Odds ratio betrug 1,12 (CI: 0,03 - 1,60). In einer Subgruppenanalyse fanden sich keine signifikante Unterschiede in bezug auf das mittlere Alter, das Ausmaß des Zigarettenkonsums und auch von Blutgruppenmerkmalen. Innerhalb des Patientenkollektivs wurde die Verteilung von schnellen und langsamen Acetylierern stratifiziert nach Menopausenstatus, Menstruationsdauer, TNM-Klassifikation und Grading. Bei den Patientinnen mit invasiv-lobulärer Tumorhistologie waren die schnellen Acetylierer in der Auswertung signifikant häufiger als bei invasiv-duktalem Mammakarzinom. Ein weiterer signifikanter Unterschied wird bezüglich des Hormonrezeptorstatus berichtet: Schnelle Acetylierer waren bei Patientinnen mit positivem Hormonrezeptorstatus deutlich häufiger als bei solchen mit negativem Rezeptorstatus. Bezüglich der Tumorhistologie fiel auf, dass die 33 Patientinnen mit einem invasiv-lobulären Mammakarzinom signifikant häufiger schnelle Acetylierer waren. Langsame Acetylierer wiesen dagegen häufiger einen negativen Östrogenrezeptorstatus auf. Schlussfolgerung: Dem Polymorphismus des NAT2-Genotyps als unabhängigem Risikofaktor bei der Entstehung des Mammakarzinoms kommt keine mit den bekannten Risikofaktoren vergleichbare Bedeutung zu. Die Befunde in bezug auf die Tumorhistologie und auf den Hormonrezeptorstatus weisen möglicherweise auf Besonderheiten im Pathomechanismus bei der Entstehung des Mammakarzinoms hin, der derzeit unklar ist. Sie bedürfen weiterer Abklärung. / Genetically polymorphic xenobiotic metabolizing enzymes such as the polymorphic arylamine N-acetyltransferase (NAT2) are supposed to be a host factor for cancer susceptibility. A case-control study of a total of 248 patients with breast cancer and a matched reference group of 248 unrelated subjects without cancer was performed to explore the association between NAT2 genetic polymorphism and individual susceptibility to breast cancer. A structured questionnaire was used to collect relevant information regarding all known or suspected risk factors of breast cancer. Methods: The NAT2 genotype was determined using the polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism (PCR-RFLP). The NAT2-genotype was characterized at nucleotide positions 191, 282, 341, 481, 590, 803, and 857. For evaluation of nucleotide 341, a 3’-mismatch primer was used. Homozygous wild type genotypes NAT2*4/*4 were confirmed by DNA sequencing. Results: Genotypes for rapid acetylation amounted to 44.4% among breast cancer and 41.5% among reference patients. There was no over-representation of specific NAT2-genotypes in the total of breast cancer patients compared with the reference group (odds ratio 1.12, 95%; confidence limits 0.03-1.60). Neither NAT2-status nor smoking status was independently associated with breast cancer risk. Logistic regression analysis, considering confounders such as age, body mass index (BMI), and smoking status (PJ) showed that the NAT2 rapid acetylator genotype was not associated with an increased cancer risk (odds ratio 1.05; 95%-CI: 0.67-1.67; P=0.82). Discrimination into homozygous and heterozygous carriers of allele NAT2*4 did not show any over-representation of NAT2*4/*4 genotypes among breast cancer patients (odds ratio 1.31; 95% confidence limits 0.59-2.91; p=0.50). Hence carriers of the NAT2*4/*4 genotypes, with its especially high acetylation capacity are not at significantly increased risk to breast cancer. Further stratification to different risk factors revealed a non-significant elevation in risk of breast cancer among patients with increasing cigarette smoking who represented the NAT2 rapid acetylator genotype, but lack of association to age, blood groups, menopause, period of menstruation, TNM-classification, tumor grading, and histology. However, evaluation of the role of estrogen receptor status and NAT2 showed that there was a significant association between positive receptor status and NAT2 rapid acetylator genotype (odds ratio 2.07; 95%-CI: 1.32-5.27; P=0.005). Interestingly, in patients with infiltrating lobular breast cancer (n = 33), NAT2 rapid acetylator genotypes were more frequent compared with other tumor subtypes (odds ratio 2.59; 95%-CI: 1.20-5.60; P=0.014). Logistic regression analysis, considering estrogen receptor status, and age showed that the rapid acetylator genotypes were associated with an increased cancer risk (odds ratio 2.4; 95%-CI: 1.04-5.61; P=0.04). Our findings suggest that NAT2-polymorphism is not an independent susceptibility factor for breast cancer. In particular the NAT2 slow acetylator genotype was not associated with an increased breast cancer risk. Striking results point out to a likely association between NAT2 rapid acetylator genotype and tumor histology especially infiltrating lobular breast cancer and positive hormone receptor status These findings refer to special features of pathogenesis in breast cancer requiring more and detailed clarification.

Diese Arbeit beschäftigt sich mit der prognostischen und prädiktiven Bedeutung der Serummessung des shed antigens des Onkoproteins HER-2/neu (s-HER-2/neu) für Mammakarzinompatientinnen in unterschiedlichen Erkrankungsstadien sowie unter verschiedenen Formen der Systemtherapie inklusive der Behandlung mit dem monoklonalen Antikörper Herceptin. Hierbei wurde der Stellenwert von s-HER-2/neu mit weiteren biochemischen Serummarkern (s-EGFR, s-uPA, CA 27.29) und etablierten Prognosefaktoren des Mammakarzinoms verglichen. Da HER-2/neu zu verschiedenen Zeitpunkten der Erkrankung mit verschiedenen Methoden an unterschiedlichen Materialien bestimmt werden kann, mußte schwerpunktmäßig auch die differentielle Wertigkeit von s-HER-2/neu im Vergleich zu Methoden der HER-2/neu-Bestimmung am Tumormaterial untersucht werden. Hierbei wurde insbesondere hinterfragt, ob die verschiedenen Methoden der HER-2/neu-Diagnostik stets zum gleichen Ergebnis führen, welche biologischen und technischen Ursachen möglichen Diskordanzen zugrunde liegen, und welche Konsequenzen diese Diskordanzen für die Therapiewahl (vor allem mit Herceptin beim metastasierten Mammakarzinom) mit sich bringen. Es wurden folgende Ergebnisse erzielt: - Grenzwerte: s-HER-2/neu: 50 ng/ml mit großer Wahrscheinlichkeit auch eine HER-2/neu-Überexpression am Tumorgewebe aufweisen. - Insgesamt 70% der Patientinnen mit HER-2/neu-negativen Tumoren hatten bei der späteren Fernmetastasierung einen erhöhten s-HER-2/neu-Spiegel. Diese Zunahme des Nachweises der HER-2/neu-Positivität zwischen Gewebenachweis am Primärtumor und dem Serumnachweis im Stadium IV ist nicht zufällig (p=0,001) und allenfalls teilweise durch den Einfluß der Tumormasse erklärbar. Klonale Veränderungen müssen in Erwägung gezogen werden. / This work focuses on the prognostic and predictive impact of the determination of the shed antigen of the oncoprotein HER-2/neu in serum (s-HER-2/neu) for breast cancer patients in different stages of the disease as well as under different forms of systemic therapy including treatment with the monocloncal antibody Herceptin. The biological meaning of s-HER-2/neu was compared to other serum markers (s-EGFR, s-uPA, CA 27.29) and established prognostic markers in breast cancer. As HER-2/neu can be measured at different times during the course of the disease using different methods and material, the differential meaning of s-HER-2/neu had to be investigated in relation to methods of HER-2/neu determination in tissue. Key questions were whether different methods of HER-2/neu testing lead to the same result, what biological and/or technical reason may lead to discordances, and if so, which are the consequences of these discordances for therapeutic decision making (before all Herceptin therapy in metastatic breast cancer). The results of the investigations are as follows: - Cut-offs of normal: s-HER-2/neu: 50 ng/ml are most probably HER-2/neu-positive in tissue. - Altogether, 70% of the patients with HER-2/neu negative tumors showed elevated s-HER-2/neu concentrations at later metastatic spread. This increase of the number of HER-2/neu positivity between tissue determination at the primary tumor and the serum results at stage IV disease cannot be explained by pure coincidence (p=0.001) and can only in part be explained by the influence of tumor burden . Clonal changes during the course of the disease must be considered.

Cyclooxygenasen regulieren die Produktion von Prostaglandinen und spielen eine Rolle bei der Entstehung und Progression maligner Tumore. Versuche mit COX Inhibitoren (NSAIDs) zeigten im Tiermodell eine deutliche Reduktion von Inzidenz und Größe der Tumoren in einer dosisabhängigen Weise. Das Ziel der vorliegenden Arbeit war, das Expressionsmuster der induzierbaren Isoform COX-2 und der konstitutiven Isoform COX-1 im Mammakarzinom zu untersuchen. Die Grundlage der Untersuchung bildeten Tumorproben von 221 Patientinnen mit primärem Mammakarzinom. Diese wurden mittels immunhistochemischer Methoden auf beide COX-Isoenzyme untersucht. Eine erhöhte COX-2 Expression wurde in 36% der untersuchten Mammakarzinome festgestellt. Sie korrelierte signifikant mit verschiedenen klinisch-pathologischen Parametern, insbesondere mit einem positiven Lymphknotenstatus, einer geringen Differenzierung und einer Tumorgröße >20 mm. Eine erhöhte COX-1 Expression wurde in 45% der untersuchten Tumoren gefunden und korrelierte signifikant mit kleineren und nicht in regionäre Lymphknoten metastasierten Karzinomen. In der univariaten Überlebensanalyse stellte sich eine positive COX-2 Expression im Gegensatz zur COX-1 sowohl im rezidivfreien Überleben als auch im Gesamtüberleben als prognostisch relevant heraus. In der multivariaten Analyse erreichte eine erhöhte COX-2 Expression eine grenzwertige statistische Signifikanz als unabhängiger Parameter innerhalb des rezidivfreien Überlebens. Eine erhöhte COX-1 Expression erreichte keinen statistisch signifikanten Einfluß auf die Prognose. Aufgrund dieser Ergebnisse ist somit eine erhöhte COX-2 Expression im Mammakarzinom mit prognostisch ungünstigen Faktoren assoziiert. Inwieweit selektive COX-2 Inhibitoren als Therapeutika geeignet sind, werden die Ergebnisse weiterer Studien zeigen. / Cyclooxygenases regulate the production of prostaglandins and play a role in tumor development and progression. COX-inhibitors (NSAIDs) showed a significant reduction of tumor incidence and tumor size in rodent models. In this study, we investigated the prognostic impact of expression of both COX-isoforms as well as the association of COX expression and other clinicopathological parameters in primary breast cancer. The expression of COX-1 and –2 was determined by immunohistochemistry retrospectivly in a cohort of 221 women. An elevated expression of COX-2 as the inducible form of the cyclooxygenases was detected in 36% of tumors and was significantly associated with several clinicopathological parameters, for example positive nodal status, poor differentiation and larger tumor size. In contrast, an increased expression of COX-1 was detected in 45% of breast carcinomas and was associated with smaller tumor size and negative nodal status. In univariate survival analysis a significant association between an increased expression of COX-2 and a decreased disease-free survival as well as decreased overall survival was found. An elevated expression of COX-1 had no significant influence on patient prognosis. The data of this study show a prognostic role of COX-2 expression. Further studies on selective COX-2 inhibitors will investigate their role in treatment of patients with breast cancer.

Zur Abschätzung der Prognose von Tumorerkrankungen und zur Therapieplanung können neben konventionellen klinischen Parametern auch molekulare Prognosemarker im Tumorgewebe bestimmt werden. In der vorliegenden Studie haben wir vier verschiedene potentielle molekulare Prognosefaktoren im Ovarialkarzinom und teilweise auch im Mammakarzinom untersucht: die Cyclooxygenase-2 (COX-2), das humane ELAV-ähnliche Protein HuR, das Oberflächenantigen CD24 und die Mitogen-aktivierte Protein Kinase Phosphatase-1 (MKP-1). Dabei lag der Schwerpunkt auf der Untersuchung der Cyclooxygenase-2 (COX-2), die sowohl in der Entzündungsreaktion als auch bei der Entstehung und Progression maligner Tumoren eine wichtige Rolle spielt. Wir konnten zeigen, dass eine erhöhte Expression der COX-2 beim Ovarialkarzinom und beim Mammakarzinom signifikant mit einer schlechteren Prognose assoziiert ist. In Zellkulturmodellen haben wir verschiedene Strategien zur Inhibition der COX-2 angewendet, nämlich die pharmakologische Inhibition durch NS-398 sowie die spezifische Inhibition durch RNA Interferenz. Dabei ergab sich, dass COX-2 Inhibitoren neben der Wirkung auf die COX-2 auch über anderen Zielproteine die Proliferation von Ovarialkarzinomzellen hemmen und zu einem Zellzyklusarrest führen. Bei weiteren Untersuchungen zur Regulation der COX-2 konnten wir zeigen, dass das RNA-stabilisierende Protein HuR mit der COX-2 Expression korreliert und ebenfalls ein Prognosefaktor für das Ovarialkarziom ist. Unsere Ergebnisse bilden eine Grundlage für klinische Studien zur Untersuchung des möglichen Effektes von COX-Inhibitoren in der Therapie maligner Tumoren. / Molecular prognostic markers can be determined in tumor tissue and can be used - in addition to conventional clinicopathological parameters - to estimate patient prognosis and to plan the therapy of malignant tumors. In this study we have investigated the expression of four different molecular prognostic factors in ovarian carcinoma and partially in breast carcinoma: cyclooxygenase-2 (COX-2), the human ELAV-like protein HuR, the surface antigen CD24, as well as the mitogen-activated protein kinase phosphatase-1 (MKP-1). For further evaluation, we have focused on COX-2, which plays an important role in tumor biology and inflammation. Increased expression of COX-2 in tumor tissue was associated with poor prognosis in ovarian carcinoma and breast carcinoma. In cell culture models, we have used two different strategies for inhibition of COX-2: pharmacological inhibition and RNA interference. We found that COX-2 inhibitors act on other cellular targets in addition to COX-2 and inhibit proliferation of ovarian carcinoma cells by induction of cell cycle arrest. In further studies we could show that the RNA-stabilizing protein HuR is associated with increased COX-2 expression and is an prognostic factor in ovarian carcinoma, as well. These results provide a basis for further evaluation of COX-inhibitors in tumor therapy.

Im ersten Teil der Arbeit wurde die random amplified polymorphic DNA (RAPD) Methode für die Anwendung humaner DNA optimiert, indem die Konzentrationen der einzelnen Agentien und das thermische Profil der PCR-Reaktion verändert wurden. Des weiteren wurde der Einfluss von Polymerasen und PCR-Maschinen auf die RAPD, insbesondere auf die Erweiterung des Spektrums der Amplimere und die Reproduzierbarkeit der Reaktionen untersucht. Unsere Untersuchungen haben gezeigt, dass die RAPD eine sehr robuste und reproduzierbare Methode ist. Im zweiten Teil wurden qualitative und quantitative Unterschiede zwischen DNA von Brustkrebszellen und DNA von Leukozyten detektiert. Die dazu benutzten Primer basieren auf Sequenzen die in den Mechanismen der Tumorgenese involviert sind. Unsere Studie hat gezeigt, dass random priming in der Abschätzung von genomischen Schäden im Brustkrebs sehr nutzbar sein kann. / In the first part of this work, we have optimized random amplified polymorphic DNA (RAPD) for the use of human DNA in altering the concentration of the reaction components and the steps of the thermal profile in the polymerase chain reaction, by testing a large number of polymerases and multiple combinations with respect to their ability to increase the spectrum of amplimers and by examining the performance of various thermocyclers. We conclude that RAPD is a robust and reproducible method that could prove very useful for scientists and physicians. In the second part we used primers that were designed by choosing sequences involved in the development of DNA mutations, to successfully detect qualitative and quantitative differences between breast cancer DNA/normal DNA pairs. Our study showed that random priming proves very useful for assessing genomic damage in breast cancer.

Die Metastasierung in den Knochen ist beim fortgeschrittenen Mammakarzinom ein häufiges Problem. Insbesondere die Mammakarzinome, welche keinen Östrogenrezeptor α (ERα), keinen Östrogenrezeptor ß (ERß) und keine Überexpression des human epidermal growth factor receptor 2 (Her2/neu) aufweisen, die so genannten triple-negativen Mammakarzinome (TNBCs), werden als sehr aggressiv angesehen und haben eine schlechte Prognose. Kürzlich konnten wir zeigen, dass die Invasion von Mammakarzinomzellen in Kokultur mit der Osteoblastenähnlichen Zelllinie MG63 stark anstieg. Unter Verwendung dieses Modells haben wir nun untersucht, inwieweit der ERß eine Rolle bei der Zellinvasion von TNBC-Zellen in vitro spielt. Die ERα-und ERß-Proteinexpression wurde mithilfe des Western Blot-Verfahrens untersucht. Die Zellinvasion wurde mithilfe der Migrationsrate von TNBC-Zellen durch eine künstliche Basalmembran in einer modifizierten Boyden-Kammer während Kokultur mit der Osteoblastenähnlichen Zelllinie MG63 quantifiziert. Die Migration wurde mithilfe eines Scratch-Assays untersucht. Die Wirkung der ERß-Agonisten auf die CXC motif chemokine receptor 4 (CXCR4)-Proteinexpression während der Kokultur mit der Osteoblastenähnlichen Zelllinie MG63 wurde mithilfe des Western Blot-Verfahrens analysiert. Die Proliferation ist mit dem almarBlue®assay untersucht worden. Die TNBC-Zellen HCC1806 und HCC1937 zeigten keine ERα-Proteinexpression, jedoch eine hohe ERß-Proteinexpression. Die Zellinvasion der TNBC-Zelllinien HCC1806 und HCC 1937 zeigte in Kokultur mit Osteoblastenähnlichen Zelllinie MG63 einen signifikanten Anstieg. Die Behandlung mit den selektiven ERß-Agonisten Liquiritigenin und ERB-41 reduzierte die Invasion der TNBC-Zellen durch eine künstliche Basalmembran als Antwort auf eine zelluläre Stimulation. Während der Kokultur stieg die CXCR4-Proteinexpression der TNBC- Zelllinien HCC1806 und HCC1937 signifikant an. Die Behandlung mit Liquiritigenin resultierte in einem signifikanten Abfall der CXCR4-Proteinexpression. Beide ERß-Agonisten zeigten keinen Effekt auf die Proliferation der TNBC-Zelllinien. Unsere Ergebnisse weisen darauf hin, dass der ERß eine wesentliche Rolle bei der Invasion von TNBC-Zellen spielt. Die knochengerichtete Invasion kann durch ERß-Agonisten inhibiert werden.

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Das Mammakarzinom ist weltweit eine der häufigsten Malignomerkrankung der Frau. Im fortgeschrittenen Stadium der Erkrankung entwickeln bis zu 75 % der Patientinnen ossäre Metastasen. Basierend auf der Erkenntnis, dass GnRH-Analoga in vitro die Migration und Invasion von Mammakarzinomzellen während der Kokultur mit humanen Osteoblasten bzw. der Osteoblasten-ähnlichen Zellreihe MG-63 hemmen, sollten in dieser Arbeit die dem zugrundeliegenden molekularen Mechanismen näher betrachtet werden. Es ist bekannt, dass GnRH-Analoga in vielen verschiedenen GnRH-Rezeptor exprimierenden Tumorzelllinen die Wachstumsfaktor- und Wachstumsfaktorrezeptor-Expression beeinflussen und somit z.B. antiproliferative oder Apoptose-induzierende Effekte vermitteln. In dieser Arbeit wurde die humane Mammakarzinomzelllinie MCF-7 mit der osteoblasten-ähnlichen Zellreihe MG-63 kokultiviert. Zu bestimmten Zeitpunkten erfolgte die Behandlung der Mammakarzinomzellen mit drei verschiedenen GnRH-Analoga. Dem GnRH-I-Agonisten Triptorelin, dem GnRH-I-Antagonisten Cetrorelix und dem GnRH-II-Agonisten [D-Lysin]-GnRH-II. Neben einer nicht-kokultivierten Kontrolle jeder Zelllinie wurde eine nicht behandelte Kokulturkontrolle mitgeführt. Nach 48 h (bzw. nach 72 h od. 96 h) wurde der Versuch beendet und die mRNA-Expression von EGF, EGFR, TGF-beta und TGFBRI und -II in MCF-7 und MG-63 mittels PCR bestimmt. Zudem wurde die mRNA-Expression von EGF, EGFR und TGF-beta auch nach längerer Kokultur- und Behandlungszeit sowie unter Stressbedingungen beobachtet. Es hat sich gezeigt, dass es weder in MG-63 noch in MCF-7 signifikante Expressionsunterschiede von EGF, EGFR und TGF-beta im Vergleich zur Kokulturkontrolle gab. Dies hat sich auch weder im Zeitverlauf noch unter Stressbedingungen geändert. In MG-63 konnte man ebenfalls keine Expressionsunterschiede der TGFB-Rezeptoren beobachten. Dagegen konnte erstmals gezeigt werden, dass alle drei GnRH-Analoga die mRNA-Expression des TGFBR-I und -II während der Kokultur mit der osteoblasten-ähnlichen Zellreihe MG-63 signifikant hemmen. Während man in anderen Gewebetypen bereits eine verminderte Expression von TGFBR-I und -II nach Behandlung mit GnRH-Analoga nachweisen konnte, ist dies erstmals in einer Mammakarzinomzelllinie gelungen. Desweiteren kann man aus den vorliegenden Ergebnissen den Schluss ziehen, dass die verminderte Expression der TGFB-Rezeptoren eine Rolle in der bereits nachgewiesene GnRH-Analoga-vermittelten Migrations- und Invasionshemmung spielt.

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