Os marcadores prognósticos em mastologia têm sido utilizados como apoio diagnóstico para prever o comportamento dos neoplasmas mamários (prognóstico) e determinar a provável resposta ao tratamento pré ou pós-cirúrgico. Estudos têm sido feitos sobre o prognóstico dos tumores mamários caninos (TMCs) que apresentam semelhanças e diferenças com tumores mamários humanos. Além disso, esses tumores exibem, com alta freqüência, proliferação de células mioepiteliais que podem sofrer metaplasia, acompanhada de alterações moleculares. O presente estudo teve o objetivo de verificar a expressão imuno-histoquímica e a associação de diferentes marcadores utilizados como prognósticos nos tumores de mama humana (RE, RP, c-erbB-2 e Ki-67) e marcadores mioepiteliais (p63, CK5 e vimentina) nos TMCs. O primeiro artigo analisa a expressão desses marcadores em 35 tumores encontrados em onze fêmeas caninas nas quais foram identificados tumores malignos múltiplos nas glândulas mamárias. Cada tipo histológico analisado em fêmeas portadoras de tumores múltiplos expressou marcadores prognósticos e mioepiteliais peculiares à sua histogênese, porém houve associação dessa expressão apenas em alguns tipos celulares presentes nos TMCs. Os tumores com componente epitelial carcinomatoso não apresentaram diferenças significativas, no entanto, nos tumores com componente complexo e misto, ocorreu associação entre a expressão da p63, CK5 e vimentina. No conjunto de marcadores estudados, a p63 e a CK5 mostram-se promissoras na elucidação da transformação das células mioepiteliais concomitante à invasão tumoral e com relação à expressão da vimentina que se mostrou bem evidenciada durante a transformação da célula mioepitelial proliferada a célula participante do mesênquima do neoplasma invasor em mamas de caninos, ao menos nos aspectos de expressão molecular e morfológica. O segundo artigo analisa os marcadores mioepiteliais em 82 casos de TMCs malignos. Este estudo comprovou a freqüência e a associação da expressão desses marcadores em determinados tipos histológicos tumorais e celulares, permitindo a identificação das células mioepiteliais em transformação na maior parte dos TMCs malignos, notadamente, os que apresentam componente mesenquimal metaplásico. Mais estudos devem ser feitos na tentativa de verificar a significância da expressão encontrada no comportamento biológico desses tumores. / Prognostic markers in mastology have been used as diagnostic support, to predict the behavior of mammary neoplasias (prognosis) and to determine their possible response to treatment before or after surgery. Studies have been conducted on the prognosis of canine mammary gland tumors (MGTs), which show similarities to and differences from human breast tumors. In addition, these tumors often show proliferation of myoepithelial cells, which may undergo metaplasia, accompanied by molecular alterations. The aim of the present study was to check the immunohistochemical expression and the association between different markers used as prognostic factors in human breast tumors (ER, RP, c-erbB-2 and Ki-67) and myoepithelial markers (p63, CK5 and vimentin) in MGTs. The first article analyzes the expression of these markers in 35 tumors in 11 female dogs, where multiple tumors were identified in the mammary glands. Each histological type analyzed in the female dogs with multiple tumors expressed prognostic and myoepithelial markers that were peculiar to their histogenesis, but the association of this expression was observed only in some cell types of MGTs. Tumors with a carcinomatous epithelial component did not have significant differences, but tumors with complex and mixed components showed association between the expressions of p63, CK5 and vimentin. Of the group of investigated markers, p63 and CK5 proved to be promising tools in elucidating the transformation of myoepithelial cells concomitantly to tumor invasion and in terms of vimentin expression, which was quite pronounced in this transformation from proliferating myoepithelial cells into cells that participate in the mesenchyma of the invasive neoplasia in canine mammary glands, at least with regard to the aspects of molecular and morphological expression. The second article analyzes myoepithelial markers in 82 cases of malignant MGTs. This study corroborated the frequency and association of the expression of these markers in certain histological tumor and cell types, allowing for the identification of myoepithelial cells in transformation in most malignant MGTs, chiefly those with a metaplastic mesenchymal component. Further studies are necessary in order to assess the importance of expression found in the biological behavior of these tumors.

Programa de Apoio aos Planos de Reestruturação e Expansão das Universidades Federais / Cancer is one of the main causes of death in dogs and cats and the mammary neoplasm is one of the most frequent in these species. Although some studies have been performed, there is little data on the epidemiology of this disease in cats. Thus, this study has, as primary goal, to determine the most prevalent tumors in cats and to associate the mammary tumors to some prognostic factors. The files from the Veterinary Pathology Laboratory of the Universidade Federal de Santa Maria were reviewed. Between the years 2000 and 2011, a total of 1427 feline cases including necropsies and biopsies were found. Based on the collected data from these cases, a relation between mammary tumors and some factors such as sex, age, breed, reproductive status, use of contraceptives, number and location of affected glands, presence of ulcerations, size of the tumor, and presence and location of metastases, was studied. Mammary tumors were the second most prevalent tumors (39,57%), after skin neoplasms (41,49%). All feline tumors were in females, mostly older and Domestic Shorthaired cats. Malignant neoplasms were the more frequently diagnosed (72,35%), followed by non-neoplastic tumors (22,58%), and benign neoplasms (5,06%). The smaller tumors were mostly carcinomas. Ulcers were observed in malignant tumors (92%) and non-neoplastic tumors as well (8%). Distant metastases were found mainly in the lungs and skin. / Câncer é uma das principais causas de morte em cães e gatos, sendo o neoplasma mamário um dos mais frequentes. Embora estudos tenham sido realizados nesta área, há, ainda, poucos dados epidemiológicos na espécie felina. Logo, esta dissertação teve como objetivos determinar os tumores mais prevalentes em gatos e relacionar os tumores mamários a alguns de seus fatores prognósticos. Os arquivos do Laboratório de Patologia Veterinária (LPV) da Universidade Federal de Santa Maria (UFSM) foram revisados e um total de 1.427 protocolos de biopsias e necropsias de felinos, entre 2000 e 2011, foi encontrado. Com base nas informações dos arquivos, foi estabelecida a relação entre os tumores mamários e alguns fatores como sexo, idade, raça, estado reprodutivo, uso de contraceptivos, número e localização das glândulas afetadas, ulcerações, tamanho do neoplasma, metástases distantes e para os linfonodos. Assim, observou-se que os tumores de mama foram o segundo diagnóstico (39,57%) mais prevalente, após os tumores de pele (41,49%). Todos os gatos com tumores mamários eram fêmeas, sendo os sem raça definida e os idosos os mais afetados. Os neoplasmas malignos foram diagnosticados com maior frequência (72,35%), seguidos pelos tumores não neoplásicos (22,58%) e pelos neoplasmas benignos (5,06%). Os tumores menores eram, na sua maioria, carcinomas (82,97%). Ulcerações estavam presentes não só em neoplasmas malignos (92%), mas também em alterações não neoplásicas (8%). Metástases distantes foram encontradas principalmente nos pulmões e na pele.

Made available in DSpace on 2015-03-26T13:47:09Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 226846 bytes, checksum: fab823cf7946385dda72c2e97936a8ec (MD5) Previous issue date: 2006-09-28 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Mammary tumor is the most frequent neoplasms in female dogs and the similarity of those tumors with the mammary tumors in the woman determines an interest in the study of the compared pathology. The expression of Heat Shock Proteins (HSP) have been observed in many neoplasms, including breast cancer. The aim of this work was to classify histopatologically and to investigate the expression of HSP 72 in normal and neoplastic canine mammary glands of female dogs assisted in the service of the Veterinary Hospital of the Federal University of Viçosa. 34 samples of mammary tissue were collected, including 23 neoplastics and 11 normal tissue, for histopatological analysis and investigation of expression of HSP 72 using Western blotting. Furthermore, the variables age to the diagnosis, breed, attacked mammary glands and histopatological classification of the tissue were investigated. Statistical analysis was carried out using Chi-square test (&#967;²). The result were considered statistically significant in the P < 0,05. The major frequency of the neoplasm diagnostic was at 8 to 13 years old, at the inguinal and caudal abdominal mammary glands and no statistical difference was observed between malignants and benign tumors nor at histopatological classifications. The expression of HSP 72 was determined in normal and neoplastic mammary gland tissue, this last one presenting an accentuated expression of this protein. The neoplastic tissue presented a larger proportion of expression of the protein HSP 72 when compared to the normal tissue, being observed equivalence among benign and malignants tumors as for the expression of that protein. / Tumor de mama é a neoplasia mais freqüente em cadelas e a semelhança com os tumores da mama na mulher determina um interesse crescente no estudo da patologia comparada. A expressão de proteínas de choque térmico (HSP) tem sido observada em muitas neoplasias, incluindo o câncer de mama. O objetivo desse trabalho foi classificar histopatologicamente e investigar a expressão de HSP 72 em glândula mamária normal e neoplásica de cadelas atendidas no serviço ambulatorial do Hospital Veterinário da Universidade Federal de Viçosa. Foram utilizadas 34 amostras de tecido mamário, sendo 23 neoplásicas e 11 normais, submetidas à análise histopatológica e pesquisa de HSP 72 através de Western blotting. Além disso, foram investigadas as variáveis: idade ao diagnóstico, raça, glândulas mamárias acometidas e classificação histopatológica da amostra. Os dados foram analisados por meio de tabelas de freqüência e a comparação entre as proporções das variáveis pelo teste de Qui-quadrado (&#967;²), utilizando nível de significância de 5%. Observou-se maior frequência de diagnóstico da neoplasia mamária em cadelas entre 8 e 13 anos de idade, nas glândulas mamárias abdominais caudais e inguinais, sem diferença estatística entre malignas e benignas e classificação histopatológica. Os tecidos neoplásicos apresentaram uma maior proporção de expressão da proteína HSP 72 quando comparados ao tecido normal, sendo observado equivalência entre tumores benignos e malignos quanto à expressão dessa proteína.

A interação entre as vias de sinalização dos estrógenos e fatores de crescimento está relacionada a maior agressividade dos tumores de mama. Assim, o objetivo deste trabalho foi verificar a interação entre as vias do E2 e do EGF no controle da expressão dos genes HNRPK, PAWR e PHLDA1 nas células MCF-7 (ER+) e MDA-MB-231 (ER-). Nas células MCF-7, o EGF e o E2 diminuíram a expressão do PAWR e aumentaram a expressão de PHLDA1. A inibição do ER pelo ICI resultou no aumento da expressão de PAWR sendo que a adição do E2 ou do EGF diminuiu sua expressão sem retomar os níveis observados nos tratamentos com E2 ou EGF isoladamente. Para o gene PHLDA1, o efeito do E2 e do EGF não variou após o tratamento com ICI. Nas células MDA-MB-231, a ação do EGF foi mais efetiva sobre a expressão de PAWR. A via ERK1/2 é importante na ativação do ER pelo EGF. O efeito do EGF sobre o PHLDA1 ocorre através da ativação das vias ERK1/2 e p38 MAPK. Estes resultados mostram a interação entre as vias do E2 e do EGF no controle da expressão do PAWR, mas não do PHLDA1. / The crosstalk between estrogens and growth factors pathways has been associated with breast cancer aggressiveness. Based on this, the present study aimed to determine the possible crosstalk between E2 and EGF pathways on the HNRPK, PAWR and PHLDA1 expression regulation in MCF-7 (ER+) and MDA-MB-231 (ER-) cells. In MCF-7 cells, treatments with E2 and EGF decreased PAWR expression and increased PHLDA1 expression. The ER inhibition by the ICI treatment resulted in increased PAWR expression. The E2 or EGF addition down-regulated its expression without a return to the levels observed after the E2 or EGF treatments alone. To the PHLDA1 gene, the effect of E2 and EGF treatments did not change after the ICI treatment. In MDA-MB-231 cells, the EGF effect was more significant on the PAWR gene expression control. The ERK1/2 pathway is important to the ER activation by EGF. The EGF effect over the PHLDA1 is dependent on the ERK1/2 and p38 MAPK activation. These findings suggest a crosstalk between E2 and EGF pathways on the PAWR expression control but not to PHLDA1.

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Os tumores da glândula mamária constituem as neoplasias mais freqüentes em cadelas e a doxorrubicina é uma das principais drogas quimioterápicas utilizadas no tratamento deste tipo de câncer. A quimioterapia neoadjuvante com doxorrubicina possibilita a redução do tumor e permite a avaliação da resposta ao tratamento quimioterápico in vivo. A procura por marcadores preditivos de resposta tem o objetivo de identificar as pacientes responsivas e não responsivas ao tratamento com o quimioterápico de modo a permitir a indicação de uma abordagem terapêutica específica para cada paciente. A expressão de alguns trios de genes, incluindo PRSS11, MTSS1 e CLPTM1 e, PRSS11, MTSS1 e SMYD2 em mulheres com câncer de mama que receberam tratamento neoadjuvante com doxorrubicina permitiu a classificação das pacientes em sensíveis e resistentes ao tratamento. Outros genes diferencialmente expressos entre amostras consideradas sensíveis e resistentes à doxorrubicina foram NOTCH1 e RPL37A. Avaliamos no presente trabalho se a expressão de trios de genes permitia a classificação de resposta ao tratamento quimioterápico em outro modelo, constituído por carcinoma de mama de cadela, mantido em cultura de tecido na forma de fatias e exposto à doxorrubicina in vitro. A cultura de fatias de tecidos permite a manutenção da interação epitélio-mesênquima e é considerado um modelo mais próximo ao observado in vivo. Foram obtidas amostras de tumor mamário de 38 pacientes caninas atendidas no Hospital Veterinário da Faculdade de Medicina Veterinária da Universidade Metodista de São Paulo (UMESP), em São Bernardo do Campo, durante a cirurgia de mastectomia. Os proprietários deram seu consentimento livre e esclarecido para a realização do estudo. A idade mediana das pacientes foi de 10,4 anos e, 55% e 18,4% destas pacientes eram animais sem raça definida (SRD) e da raça poodle, respectivamente. Oito pacientes haviam sido submetidas previamente à cirurgia de esterilização. As pacientes apresentaram-se em estadio clínico III (39,47%), II (28,9%), I (18,4%) e IV (metástase pulmonar) (13,1%). Os carcinomas foram classificados como de arranjo cístico-papilífero (34,2%), tubular (34,2%), túbulo-papilífero (18,42%) e sólido (10,52%). Os tumores foram fatiados e cultivados na ausência e presença de doxorrubicina (1 uM) por 24 horas e, para avaliação da resposta após o tratamento, procedeu-se à contagem do número de células nas amostras tratadas e não tratadas. O tratamento com doxorrubicina promoveu uma redução média do número de células de 13,6% e, nove amostras foram consideradas responsivas, enquanto 29 não responderam ao tratamento. Amostras de tumor mantidas em cultura na ausência de doxorrubicina tiveram seu RNA extraído para determinação da expressão dos genes alvo por meio de reação de transcrição reversa e da polimerase em cadeia do DNA em tempo real. A distribuição tridimensional das amostras, baseada na expressão dos trios de genes, não permitiu a classificação das amostras em responsivas e não responsivas. Logo, a combinação da expressão de três genes alvos, incluindo PRSS11, MTSS1, CLPTM1, SMYD2, NOTCH1 e RPL37A, não separou adequadamente os tumores responsivos e não responsivos neste modelo de carcinoma mamário canino, tratado in vitro com doxorrubicina. / Mammary gland tumors are the most common neoplasias of bitches and doxorubicin is one the mainstay drugs used in their treatment. Neoadjuvant chemotherapy with doxorubicin not only reduces the primary tumor as well as allows an in vivo evaluation of tumor response. Predictive markers of response, if identified, might allow a tailored treatment of each patient. In women with breast cancer submitted to neoadjuvant chemotherapy with doxorubicin, expression of groups of three genes, including PRSS11, MTSS1 and CLPTM1 and PRSS11, MTSS1 and SMYD2, classified the patients in responsive and resistant. Other genes differentially expressed between responsive and non-responsive tumors were NOTCH1 and RPL37A. We have then evaluated whether the expression of trios of these genes could allow the classification of tumors according to their response to chemotherapy, in another animal model constituted by mammary carcinoma of bitches, cultured as tissue slices and exposed to doxorrubicin in vitro. Culture of tissue slices preserves epithelial-mesenchymal interactions, in a similar way to that observed in vivo. Tumor samples were obtained from 38 canine patients treated at Hospital Veterinaria da Faculdade de Medicina Veterinária da Universidade Metodista de São Paulo (UMESP), São Bernardo do Campo, during mastectomy. Animal owners gave their informed consent to this study. Median age of patients was 10,4 years and 55% and 18,4% of them were mixed and poodle breed, respectively. Eight patients were previously spayed. Patients were classified in clinical stage III (39,47%), II (28,9%), I (18,4%) and IV (pulmonary metastasis only) (13,1%). Carcinomas were classified as cystic-papillary (34,2%), tubular (34,2%), tubular-papillary (18,42%) and solid (10,52%). Tumors were sliced and cultured in the absence or in the presence of doxorubicin (1 uM) for 24 hours and response evaluation was performed by cell counting of treated and untreated samples. Doxrubicin exposure promoted a mean reduction of 13,6% in the number and nine samples were considered responsive and 29 non-responsive. RNA was extracted from samples maintained in culture without doxorubicin and expression of target genes was evaluated by reverse transcription and real time polimerase chain reactions. Three-dimensional distribution of samples according to expression of groups of three genes could not separate responsive from non-responsive tumors. NOTCH1 and RPL37A expression was similar between responsive and resistant tumors but NOTCH1 was over expressed in poorly differentiated as compared to well differentiated carcinomas. Hence, expression of combination of three target genes, including, PRSS11, MTSS1, CLPTM1, SMYD2, NOTCH1 and RPL37A, could not correctly separate responsive from non-responsive tumors in this model of mammary carcinoma of canine species treated in vitro with doxorubicin.

As neoplasias mamárias apresentam um grande desafio tanto para a medicina humana, quanto para a medicina veterinária. Esses tumores apresentam ampla heterogeneidade intertumoral e intratumoral, dificultando assim a busca por tratamentos eficazes. Recentemente, pesquisadores tem voltado sua atenção para uma população de células que apresentam características muito semelhantes as células-tronco. São as chamadas células iniciadoras de tumores (CITs). Estas são descritas como as principais responsáveis por falhas nas quimioterapias e no surgimento de recidivas tumorais, devido ao seu potencial tumorigênico, de auto-renovação e de resistência a drogas antineoplásicas. Entretanto, o estudo dessas células é limitado pelas dificuldades no isolamento e na caracterização pós-enriquecimento dessas células, devido à perda do fenótipo em modelos in vitro. Sendo assim, vários estudos estão buscando maneiras alternativas de enriquecer essa população. Uma das maneiras mais utilizadas, baseia-se na indução do processo de transição epitélio-mesenquimal, através da superexpressão de fatores de transcrição como SNAI1, SLUG, ZEB1 e ZEB2. Sendo assim, nós objetivamos expressar de maneira exógena os fatores de transcrição SLUG e ZEB1 em células oriundas de carcinomas mamários caninos, caracterizar seus efeitos nessas células e observar se esses fatores de transcrição seriam capazes de induzir o fenótipo de CIT. Primeiramente, quatro amostras de carcinomas mamários caninos foram analisados quanto sua morfologia e os níveis de expressão gênica de quatro fatores de transcrição associados a transição epitélio-mesenquimal: SLUG, STAT3, ZEB1 e ZEB2. Após, nós selecionamos duas dessas amostras (CC-20E e CL-28E), que apresentavam morfologia típica de células epiteliais e baixa expressão dos fatores de transcrição citados acima e expressamos de maneira exógena e de forma estável os fatores de transcrição SLUG e ZEB1, através do processo de transdução lentiviral. Entretanto, apenas a transdução com os plasmídeos contendo a região codificante de SLUG foi eficiente. Sendo assim, nós avaliamos os efeitos da expressão exógena de SLUG nas células CC-20E e CL-28E, quanto a alteração de morfologia e expressão de filamentos intermediários como citoqueratina, vimentina e actina. Além disso, nós avaliamos se a expressão exógena de SLUG poderia regular a expressão de outros genes associados a EMT, além de genes supressores de tumores, alvos de SLUG. Por fim, nós avaliamos se a expressão exógena de SLUG poderia induzir ao fenótipo de CITs, verificando se havia alteração na sensibilidade das células aos quimioterápicos doxorrubicina e paclitaxel, além de avaliar o potencial tumorigênico e de auto-renovação dessas células em cultivos de baixa aderência. A expressão exógena de SLUG nas células CC-20E e CL-28E, não induziu a alterações na morfologia epitelial das células. Entretanto, as células alteraram sua disposição em monocamada no cultivo, formando tipos de túbulos semidiferenciados, característicos do processo de EMT híbrido ou parcial. Além, disso, houve um equilíbrio entre a expressão dos filamentos intermediários de citoqueratina e vimentina nas células, além do aumento na expressão dos genes CDH1 (E-caderina) e CDH2 (N-caderina), resultado que sustentou a indução de EMT parcial. O processo de EMT parcial induziu maior resistência ao quimioterápico paclitaxel, além de potencializar a tumorigenecidade e a capacidade de auto-renovação das células em cultivos de baixa aderência. Sendo assim, no presente estudo, nós obtivemos um cultivo com características que mimetizam as CITs, demonstrando que os processos que induzem esse fenótipo são semelhantes tanto na espécie canina, quanto em humanos, sustentando a hipótese de que neoplasias mamárias caninas podem servir como modelo para o estudo das CITs e, consequentemente, do desenvolvimento neoplásico de tumores sólidos. / Mammary neoplasms present a major challenge for both human and veterinary medicine, due to intertumoral and intratumoral heterogeneity, hindering the search for effective treatments. Recently, researchers has highlighted a population of cells with features very similar to stem cells. Known as Tumor-Initiating Cells (TICs), they are described as the main responsible for chemotherapy failures and tumor recurrence, due to their tumorigenic potential, self-renewal ability and drug resistance. The study of TICs is limited mainly by their difficult isolation owing to specific markers absence, and furthermore, cells lose their phenotype when placed in vitro. Therefore, several studies are seeking for alternatives to enrich this population in regular cultures. One way is based on the epithelial-mesenchymal transition induction through of transcription factors overexpression, such as SNAI1, SLUG, ZEB1 e ZEB2. So, the aim of this study was to overexpresse the SLUG and ZEB1 transcription factors in a cell culture derived from canine mammary carcinomas, evaluate its effects and observe whether these transcription factors would be capable of inducing the TIC phenotype. First, four canine mammary carcinomas cell cultures were analyzed for their morphology and gene expression levels of four transcription factors associated with epithelial-mesenchymal transition: SLUG, STAT3, and ZEB1 ZEB2. After, we selected two samples (CC-20E and CL-28E) with typical morphology of epithelial cells and low expression of the transcription factors mentioned above. We then overexpress, stably, the transcription factors SLUG and ZEB1 by lentiviral transduction, However, only SLUG transduction was efficient. Then, we evaluated the effects of SLUG overexpression in CC-20E and CL-28E cells as the change of morphology, expression of intermediate filaments as cytokeratin, vimentin and actin. In addition, we evaluated whether SLUG overexpression could regulate the expression of other EMT-associated genes as well as tumor suppressor genes, and assessed evaluated the tumorigenic potential and self-renewal of these cells in low adherence cultures. Finally, we assessed whether SLUG overexpression could induce drug resistance through doxorubicin and paclitaxel sensivity assay. The SLUG overexpression did not induce modification in epithelial cell morphology, however, cells changed their arrangement in monolayer culture, inducing the semidifferentiated tubules, typical of hybrid or partial EMT process. In, addition, there was a balanced expression between cytokeratin and vimentin, possibly explained by an increase in CDH1 expression (E-cadherin) and CDH2 (N-cadherin) typical of partial EMT. Furthermore, the partial EMT generated cells presenting paclitaxel resistance, and enhanced the tumorigenic potential and self-renewal capacity of the cells on low adherent plates. Thus, in this study, we obtained a cell culture exhibiting features that mimics the TICs, demonstrating the mechanisms which regulate this phenotype are similar in dogs and humans, supporting the hypothesis that canine mammary carcinomas are a great model for the study of TICs and solid tumors development.

Os tumores da glândula mamária constituem as neoplasias mais freqüentes em cadelas e a doxorrubicina é uma das principais drogas quimioterápicas utilizadas no tratamento deste tipo de câncer. A quimioterapia neoadjuvante com doxorrubicina possibilita a redução do tumor e permite a avaliação da resposta ao tratamento quimioterápico in vivo. A procura por marcadores preditivos de resposta tem o objetivo de identificar as pacientes responsivas e não responsivas ao tratamento com o quimioterápico de modo a permitir a indicação de uma abordagem terapêutica específica para cada paciente. A expressão de alguns trios de genes, incluindo PRSS11, MTSS1 e CLPTM1 e, PRSS11, MTSS1 e SMYD2 em mulheres com câncer de mama que receberam tratamento neoadjuvante com doxorrubicina permitiu a classificação das pacientes em sensíveis e resistentes ao tratamento. Outros genes diferencialmente expressos entre amostras consideradas sensíveis e resistentes à doxorrubicina foram NOTCH1 e RPL37A. Avaliamos no presente trabalho se a expressão de trios de genes permitia a classificação de resposta ao tratamento quimioterápico em outro modelo, constituído por carcinoma de mama de cadela, mantido em cultura de tecido na forma de fatias e exposto à doxorrubicina in vitro. A cultura de fatias de tecidos permite a manutenção da interação epitélio-mesênquima e é considerado um modelo mais próximo ao observado in vivo. Foram obtidas amostras de tumor mamário de 38 pacientes caninas atendidas no Hospital Veterinário da Faculdade de Medicina Veterinária da Universidade Metodista de São Paulo (UMESP), em São Bernardo do Campo, durante a cirurgia de mastectomia. Os proprietários deram seu consentimento livre e esclarecido para a realização do estudo. A idade mediana das pacientes foi de 10,4 anos e, 55% e 18,4% destas pacientes eram animais sem raça definida (SRD) e da raça poodle, respectivamente. Oito pacientes haviam sido submetidas previamente à cirurgia de esterilização. As pacientes apresentaram-se em estadio clínico III (39,47%), II (28,9%), I (18,4%) e IV (metástase pulmonar) (13,1%). Os carcinomas foram classificados como de arranjo cístico-papilífero (34,2%), tubular (34,2%), túbulo-papilífero (18,42%) e sólido (10,52%). Os tumores foram fatiados e cultivados na ausência e presença de doxorrubicina (1 uM) por 24 horas e, para avaliação da resposta após o tratamento, procedeu-se à contagem do número de células nas amostras tratadas e não tratadas. O tratamento com doxorrubicina promoveu uma redução média do número de células de 13,6% e, nove amostras foram consideradas responsivas, enquanto 29 não responderam ao tratamento. Amostras de tumor mantidas em cultura na ausência de doxorrubicina tiveram seu RNA extraído para determinação da expressão dos genes alvo por meio de reação de transcrição reversa e da polimerase em cadeia do DNA em tempo real. A distribuição tridimensional das amostras, baseada na expressão dos trios de genes, não permitiu a classificação das amostras em responsivas e não responsivas. Logo, a combinação da expressão de três genes alvos, incluindo PRSS11, MTSS1, CLPTM1, SMYD2, NOTCH1 e RPL37A, não separou adequadamente os tumores responsivos e não responsivos neste modelo de carcinoma mamário canino, tratado in vitro com doxorrubicina. / Mammary gland tumors are the most common neoplasias of bitches and doxorubicin is one the mainstay drugs used in their treatment. Neoadjuvant chemotherapy with doxorubicin not only reduces the primary tumor as well as allows an in vivo evaluation of tumor response. Predictive markers of response, if identified, might allow a tailored treatment of each patient. In women with breast cancer submitted to neoadjuvant chemotherapy with doxorubicin, expression of groups of three genes, including PRSS11, MTSS1 and CLPTM1 and PRSS11, MTSS1 and SMYD2, classified the patients in responsive and resistant. Other genes differentially expressed between responsive and non-responsive tumors were NOTCH1 and RPL37A. We have then evaluated whether the expression of trios of these genes could allow the classification of tumors according to their response to chemotherapy, in another animal model constituted by mammary carcinoma of bitches, cultured as tissue slices and exposed to doxorrubicin in vitro. Culture of tissue slices preserves epithelial-mesenchymal interactions, in a similar way to that observed in vivo. Tumor samples were obtained from 38 canine patients treated at Hospital Veterinaria da Faculdade de Medicina Veterinária da Universidade Metodista de São Paulo (UMESP), São Bernardo do Campo, during mastectomy. Animal owners gave their informed consent to this study. Median age of patients was 10,4 years and 55% and 18,4% of them were mixed and poodle breed, respectively. Eight patients were previously spayed. Patients were classified in clinical stage III (39,47%), II (28,9%), I (18,4%) and IV (pulmonary metastasis only) (13,1%). Carcinomas were classified as cystic-papillary (34,2%), tubular (34,2%), tubular-papillary (18,42%) and solid (10,52%). Tumors were sliced and cultured in the absence or in the presence of doxorubicin (1 uM) for 24 hours and response evaluation was performed by cell counting of treated and untreated samples. Doxrubicin exposure promoted a mean reduction of 13,6% in the number and nine samples were considered responsive and 29 non-responsive. RNA was extracted from samples maintained in culture without doxorubicin and expression of target genes was evaluated by reverse transcription and real time polimerase chain reactions. Three-dimensional distribution of samples according to expression of groups of three genes could not separate responsive from non-responsive tumors. NOTCH1 and RPL37A expression was similar between responsive and resistant tumors but NOTCH1 was over expressed in poorly differentiated as compared to well differentiated carcinomas. Hence, expression of combination of three target genes, including, PRSS11, MTSS1, CLPTM1, SMYD2, NOTCH1 and RPL37A, could not correctly separate responsive from non-responsive tumors in this model of mammary carcinoma of canine species treated in vitro with doxorubicin.

As neoplasias mamárias apresentam um grande desafio tanto para a medicina humana, quanto para a medicina veterinária. Esses tumores apresentam ampla heterogeneidade intertumoral e intratumoral, dificultando assim a busca por tratamentos eficazes. Recentemente, pesquisadores tem voltado sua atenção para uma população de células que apresentam características muito semelhantes as células-tronco. São as chamadas células iniciadoras de tumores (CITs). Estas são descritas como as principais responsáveis por falhas nas quimioterapias e no surgimento de recidivas tumorais, devido ao seu potencial tumorigênico, de auto-renovação e de resistência a drogas antineoplásicas. Entretanto, o estudo dessas células é limitado pelas dificuldades no isolamento e na caracterização pós-enriquecimento dessas células, devido à perda do fenótipo em modelos in vitro. Sendo assim, vários estudos estão buscando maneiras alternativas de enriquecer essa população. Uma das maneiras mais utilizadas, baseia-se na indução do processo de transição epitélio-mesenquimal, através da superexpressão de fatores de transcrição como SNAI1, SLUG, ZEB1 e ZEB2. Sendo assim, nós objetivamos expressar de maneira exógena os fatores de transcrição SLUG e ZEB1 em células oriundas de carcinomas mamários caninos, caracterizar seus efeitos nessas células e observar se esses fatores de transcrição seriam capazes de induzir o fenótipo de CIT. Primeiramente, quatro amostras de carcinomas mamários caninos foram analisados quanto sua morfologia e os níveis de expressão gênica de quatro fatores de transcrição associados a transição epitélio-mesenquimal: SLUG, STAT3, ZEB1 e ZEB2. Após, nós selecionamos duas dessas amostras (CC-20E e CL-28E), que apresentavam morfologia típica de células epiteliais e baixa expressão dos fatores de transcrição citados acima e expressamos de maneira exógena e de forma estável os fatores de transcrição SLUG e ZEB1, através do processo de transdução lentiviral. Entretanto, apenas a transdução com os plasmídeos contendo a região codificante de SLUG foi eficiente. Sendo assim, nós avaliamos os efeitos da expressão exógena de SLUG nas células CC-20E e CL-28E, quanto a alteração de morfologia e expressão de filamentos intermediários como citoqueratina, vimentina e actina. Além disso, nós avaliamos se a expressão exógena de SLUG poderia regular a expressão de outros genes associados a EMT, além de genes supressores de tumores, alvos de SLUG. Por fim, nós avaliamos se a expressão exógena de SLUG poderia induzir ao fenótipo de CITs, verificando se havia alteração na sensibilidade das células aos quimioterápicos doxorrubicina e paclitaxel, além de avaliar o potencial tumorigênico e de auto-renovação dessas células em cultivos de baixa aderência. A expressão exógena de SLUG nas células CC-20E e CL-28E, não induziu a alterações na morfologia epitelial das células. Entretanto, as células alteraram sua disposição em monocamada no cultivo, formando tipos de túbulos semidiferenciados, característicos do processo de EMT híbrido ou parcial. Além, disso, houve um equilíbrio entre a expressão dos filamentos intermediários de citoqueratina e vimentina nas células, além do aumento na expressão dos genes CDH1 (E-caderina) e CDH2 (N-caderina), resultado que sustentou a indução de EMT parcial. O processo de EMT parcial induziu maior resistência ao quimioterápico paclitaxel, além de potencializar a tumorigenecidade e a capacidade de auto-renovação das células em cultivos de baixa aderência. Sendo assim, no presente estudo, nós obtivemos um cultivo com características que mimetizam as CITs, demonstrando que os processos que induzem esse fenótipo são semelhantes tanto na espécie canina, quanto em humanos, sustentando a hipótese de que neoplasias mamárias caninas podem servir como modelo para o estudo das CITs e, consequentemente, do desenvolvimento neoplásico de tumores sólidos. / Mammary neoplasms present a major challenge for both human and veterinary medicine, due to intertumoral and intratumoral heterogeneity, hindering the search for effective treatments. Recently, researchers has highlighted a population of cells with features very similar to stem cells. Known as Tumor-Initiating Cells (TICs), they are described as the main responsible for chemotherapy failures and tumor recurrence, due to their tumorigenic potential, self-renewal ability and drug resistance. The study of TICs is limited mainly by their difficult isolation owing to specific markers absence, and furthermore, cells lose their phenotype when placed in vitro. Therefore, several studies are seeking for alternatives to enrich this population in regular cultures. One way is based on the epithelial-mesenchymal transition induction through of transcription factors overexpression, such as SNAI1, SLUG, ZEB1 e ZEB2. So, the aim of this study was to overexpresse the SLUG and ZEB1 transcription factors in a cell culture derived from canine mammary carcinomas, evaluate its effects and observe whether these transcription factors would be capable of inducing the TIC phenotype. First, four canine mammary carcinomas cell cultures were analyzed for their morphology and gene expression levels of four transcription factors associated with epithelial-mesenchymal transition: SLUG, STAT3, and ZEB1 ZEB2. After, we selected two samples (CC-20E and CL-28E) with typical morphology of epithelial cells and low expression of the transcription factors mentioned above. We then overexpress, stably, the transcription factors SLUG and ZEB1 by lentiviral transduction, However, only SLUG transduction was efficient. Then, we evaluated the effects of SLUG overexpression in CC-20E and CL-28E cells as the change of morphology, expression of intermediate filaments as cytokeratin, vimentin and actin. In addition, we evaluated whether SLUG overexpression could regulate the expression of other EMT-associated genes as well as tumor suppressor genes, and assessed evaluated the tumorigenic potential and self-renewal of these cells in low adherence cultures. Finally, we assessed whether SLUG overexpression could induce drug resistance through doxorubicin and paclitaxel sensivity assay. The SLUG overexpression did not induce modification in epithelial cell morphology, however, cells changed their arrangement in monolayer culture, inducing the semidifferentiated tubules, typical of hybrid or partial EMT process. In, addition, there was a balanced expression between cytokeratin and vimentin, possibly explained by an increase in CDH1 expression (E-cadherin) and CDH2 (N-cadherin) typical of partial EMT. Furthermore, the partial EMT generated cells presenting paclitaxel resistance, and enhanced the tumorigenic potential and self-renewal capacity of the cells on low adherent plates. Thus, in this study, we obtained a cell culture exhibiting features that mimics the TICs, demonstrating the mechanisms which regulate this phenotype are similar in dogs and humans, supporting the hypothesis that canine mammary carcinomas are a great model for the study of TICs and solid tumors development.

A vitamina D (VD) pode estar envolvida no controle da proliferação, diferenciação e apoptose em linhagens mamárias. Existem evidências de que mulheres com câncer de mama apresentam menor concentração sérica de 25(OH)D3 ou de 1,25(OH)2D3 em relação às mulheres sem câncer. Por outro lado, pouco se sabe se a concentração sérica de VD pode influenciar o desenvolvimento de câncer de mama em cadelas e se o hormônio pode ter efeito quimiopreventivo, inibindo o aparecimento de tumores ou mesmo efeito terapêutico, reduzindo a proliferação de células malignas. Logo, nossos objetivos foram comparar a concentração sérica de 25(OH)D3 em animais com e sem tumor mamário e analisar as ações de 1,25(OH)2D3 em glândulas mamárias normais e tumorais de cadelas, utilizando como modelo a cultura de tecidos. Inicialmente foram incluídas 39 cadelas portadoras de tumor de mama e 64 cães sem tumor (controle), sendo que 50 eram fêmeas e 14 eram machos. Observamos que os animais do grupo tumoral possuíam idade mais avançada (mediana de 108 meses) em relação ao grupo controle (mediana de 36 meses para os machos e 24 meses para as fêmeas). No grupo controle, a concentração sérica foi maior nos machos (32,5 ± 19,3 ng/mL) do que nas fêmeas (22,8 ± 9,6 ng/mL), mas não houve diferença em relação ao grupo tumor (26,62 ± 14,25 ng/mL). Em relação à dieta, a concentração sérica de 25(OH)D3 foi maior nas fêmeas do grupo controle que se alimentavam de ração em comparação às que se alimentavam de comida caseira e ração. Entretanto, não houve diferença em relação à exposição ao sol e características da pelagem em todos os animais. No grupo tumoral, houve correlação inversa da concentração sérica de 25(OH)D3 em relação à idade, mas não houve diferença quanto ao tipo histológico ou estadiamento da doença. Foram coletadas 70 amostras de tumor de mama e de tecido mamários normal de cadelas, as quais foram cultivadas em fatias. Dos tecidos tumorais, 50% eram positivos para receptor de estrógeno (acima de 10% de células marcadas) e 44% eram positivos para HER-2 (método HercepTest). Detectou-se expressão gênica e proteica do receptor da vitamina D (VDR) em tecido mamário normal e tumoral, sendo identificado três padrões na imunoistoquímica: I - células epiteliais e mioepiteliais (mais frequentemente encontrada em tecido normal), II - marcação predominante em células mioepiteliais (mais comum em tecido tumoral e III - marcação predominante em células epiteliais. As amostras foram tratadas com 1,25(OH)2D3 nas concentrações 0,228 nM, 2 nM e 100 nM (concentração fisiológica, farmacológica que não induz hipercalcemia e farmacológica que induz hipercalcemia, respectivamente). O conteúdo de VD tecidual avaliado por cromatografia líquida foi crescente de acordo com as concentrações de VD utilizadas, indicando penetração do hormônio nas fatias. Observou-se indução da expressão de CYP24A1, que variou de 27 a 158 vezes dependendo da concentração utilizada, indicando ativação genômica da via da VD e que o tecido permanece metabolicamente ativo em cultura. Entretanto, não houve diferença da expressão gênica de outros genes envolvidos com o metabolismo da VD (CYP27B1), genes envolvidos no controle da proliferação (CDKN1A e CDKN1B) e genes envolvidos com a imunidade (CD14). O tratamento com calcitriol nas diferentes concentrações não induziu a apoptose (expressão proteica de caspase-3 clivada) e não alterou a proliferação nos tecidos normais (expressão proteica de Ki-67), mas diminuiu a proliferação nos tecidos tumorais. Não foi observada correlação entre a indução da apoptose e redução da proliferação com os padrões de expressão proteica de VDR. Concluindo, não observamos diferença na concentração sérica de 25(OH)D3 entre cadelas com tumor de mama e animais controle. Detectamos que o calcitriol em concentração fisiológica ativa a via genômica de VD em mama normal e tumoral e reduz o índice de proliferação (expressão de Ki-67) nos tumores de mama / Vitamin D (VD) may be involved in the control of proliferation, differentiation and apoptosis of mammary cell lines exposed to high concentrations of the hormone. There is some evidence that women with breast cancer present lower serum level of 25(OH)D3 or 1,25(OH)2D3 compared to women without cancer. Moreover, little is known if serum concentration of VD can influence the development of mammary tumors in dogs and if the hormone may have chemopreventive effect by inhibiting the appearance of tumors or therapeutic effect, reducing the proliferation of malignant cells. Therefore, our goals were to compare the serum 25(OH)D3 level in animals with and without mammary tumor and to analyze 1,25(OH)2D3 effects in normal and tumoral canine mammary glands, using as a model the tissue culture. At first, 39 bitches with mammary tumor and 64 dogs without tumor (control), of which 50 were females and 14 were males were included. Animals in tumor group were older (median 108 months) compared to control group (median 36 months for males and 24 months for females). In control group, serum concentration was higher in males (32.5 ± 19.3 ng/mL) than in females (22.8 ± 9.6 ng/mL), but there was no difference when compared to tumor group (26.62 ± 14.25 ng/mL). Regarding diet, serum 25(OH)D3 level was higher in control bitches fed commercial pet food compared to those fed homemade and commercial pet food combined. However, there was no difference of serum 25(OH)D3 concentration, sun exposure and coat features. In tumor group, there was an inverse correlation between serum 25(OH)D3 and age, but there was no difference in 25(OH)D3 concentration among bitches with different histological type or clinical stage of the disease. Seventhy bitches diagnosed with mammary tumors had tumor and mammary samples collected, sliced and cultured. In tumor tissues, 50% were positive for estrogen receptor (over 10% of cells stained), and 44% were positive for HER-2 (HercepTest method). Vitamin D receptor (VDR) protein and genic expression was detected in normal and tumoral samples. Three patterns of VDR were detected by immunohistochemistry: I - localizated in epithelial and myoepithelial cells (more often in normal tissues), II - predominantly in myoepithelial cells (most common in tumor tissues) and III - predominantly in epithelial cells. Normal anmammary slices were treated with 1,25(OH)2D3 0.228 and 100nM concentrations (concentration physiological and pharmacological, respectively) and mammay tumor slices were treated with 1,25(OH)2D3 2 nM concentrations (drug concentration which does not induce hypercalcemia) and 100 nM, for 24 hours. VD tissue content measured by liquid chromatography was higher in samples exposed to high VD concentration, indicating penetration of the hormone in slices. VD treatment induced CYP24A1 expression, 27 to 158 fold depending on the concentration used, and indicating activation of the VD genomic pathway. This result also suggest that the tissue remains metabolically active in culture. However, no difference in gene expression of other target genes such as CYP27B1, genes involved in proliferation as CDKN1A and CDKN1B and genes involved in immunity, such as CD14. Calcitriol treatment at different concentrations did not induce apoptosis (protein expression of cleaved caspase-3) and did not alter proliferation in normal tissues (expression of protein Ki -67), but decreased proliferation in tumor tissues. No correlation was observed between the induction of apoptosis and reduction of proliferation with the protein expression patterns of VDR. In conclusion, no difference in serum 25(OH)D3 between bitches with mammary tumor and control animals was observed. In normal and tumoral mammary samples calcitriol physiologic concentration activated VD genomic pathway and in tumor samples calcitriol reduced the proliferation index (Ki-67)