Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas. Programa de Pós-Graduação em Bioquímica, Florianópolis, 2015. / Made available in DSpace on 2016-05-24T17:39:21Z (GMT). No. of bitstreams: 1 338971.pdf: 3352887 bytes, checksum: ce3157b765264ba2c34f1e75e377aa64 (MD5) Previous issue date: 2015 / A doença de Parkinson (DP) é uma doença neurodegenerativa de causa multifatorial, cujos sintomas manifestam-se normalmente na fase adulta tardia. Evidências recentes têm apontado para fatores ambientais do período perinatal (incluindo a exposição a pesticidas) e o processo inflamatório (causado por infecções virais ou bacterianas) como causadores de toxicidade direta aos neurônios dopaminérgicos. Ainda, estudos sugerem que exposições à toxicantes durante o período perinatal podem ser responsáveis por uma condição de toxicidade silenciosa com consequências tardias e duradouras no sistema dopaminérgico nigroestriatal, algumas das quais são evidenciadas apenas se este sistema sofrer um novo insulto na fase adulta. Embora tais evidências pareçam ser de grande importância para o entendimento da etiologia da doença de Parkinson idiopática, os mecanismos moleculares relacionados a tais fenômenos são desconhecidos. O objetivo do presente trabalho foi investigar os mecanismos relacionados à neurotoxicidade dopaminérgica tardia decorrente da exposição aos pesticidas paraquat (PQ) e maneb (MB) ou ao processo inflamatório induzido pela administração sistêmica de lipopolissacarídeo (LPS) no sistema nigroestriatal em desenvolvimento relacionando-os com o eventual aumento da susceptibilidade a insultos neurotóxicos decorrentes da exposição aos pesticidas na fase adulta. Além disso, objetivou-se investigar o efeito da exposição aos pesticidas PQ e MB em cultivos de células tronco neurais sobre parâmetros de proliferação e diferenciação celular. Camundongos Swiss machos e fêmeas foram expostos a uma combinação dos pesticidas PQ e MB (PQ + MB) diariamente entre o dia pós-natal (PN) 5 ao 19. A exposição PN ao PQ + MB não causou mortalidade, alterações no peso corporal e nem alterações comportamentais no sistema motor dos animais, indicando ausência de toxicidade evidente. Entretanto, houve redução na atividade dos complexos I e II da cadeia transportadora de elétrons mitocondrial, além de redução nos níveis dos marcadores dopaminérgicos tirosina hidroxilase (TH) e transportador de dopamina (DAT) no estriado. Ainda, houve uma diminuição significativa no número de neurônios TH e DAT positivos na substância negra pars compacta (SNpc), a qual pode estar relacionada ao mecanismo de toxicidade silenciosa. Essas alterações foram evidenciadas apenas nos camundongos machos. Quando esses animais foram reexpostos aos mesmos toxicantes na vida adulta foram observadas alterações motoras, bem como degeneração dos neurônios dopaminérgicos na SNpc, indicando um aumento na susceptibilidade dos animais machos à segunda exposição na vida adulta. Por outro lado, camundongos Swiss machos e fêmeas expostos ao LPS (dia PN 5 e 10) apresentaram comprometimento motor significativo e aumento nos níveis de interleucinas inflamatórias no estriado. Quando esses animais foram expostos aos pesticidas na vida adulta, apenas os camundongos machos apresentaram alterações comportamentais que podem indicar um possível aumento na susceptibilidade dos animais. Por fim, foi avaliado o efeito da exposição ao PQ e MB em cultivos primários de células tronco neurais de ratos. A exposição aos pesticidas, especialmente o PQ ou a associação PQ + MB induziu uma redução na proliferação celular e um aumento na geração de espécies reativas. A redução na proliferação celular foi relacionada a alterações na expressão gênica de proteínas importantes na regulação do ciclo celular. Os dados indicam que exposições a toxicantes ambientais e o processo inflamatório durante períodos críticos do desenvolvimento cerebral podem levar a uma progressiva neurotoxicidade na vida adulta.<br> / Abstract : Parkinson's disease (PD) is a multifactorial neurodegenerative disorder with late-life onset. It has been hypothesized that PD could arise from events that occur early in development that have long-term but delayed adverse consequences for the nigrostriatal dopamine system, which may become evident only if the system undergoes further adult-related insult. Possible developmental events could include exposures to environmental neurotoxicants (including pesticides) and inflammatory process (induced by bacterial or viral infections). A "silent toxic" status has been hypothesized to be responsible for the enhanced adult susceptibility to environmental factors known to be involved in the induction of neurodegenerative disorders. However, the molecular mechanisms related with this phenomenon are unknown. Therefore, the objective of the present study was to investigate the mechanisms of late dopaminergic toxicity induced by exposures to the pesticides paraquat (PQ) and maneb (MB), as well as the inflammatory process induced by systemic lipopolysaccharide (LPS) administration on the nigrostriatal dopaminergic system during the early-postnatal development. In addition, we aimed to evaluate whether pesticides or LPS exposure during critical periods of development could enhance the vulnerability of the dopaminergic system to the toxicity elicited by subsequent re-exposure to the pesticide in adult life. Moreover, we aimed to investigate the effects of PQ and MB exposure in primary embryonic neural stem cells (NSC) on parameters related to cell proliferation and differentiation. Male and female Swiss mice were treated daily with a combination of PQ and MB (PQ + MB) from post-natal (PN) day 5 to 19. Pesticide exposure did not induce mortally; neither modify body weight nor mice motor function. However, PQ + MB exposure decreased the activity of mitochondrial complex I and II and reduced the levels of tyrosine hydroxylase (TH) and dopamine transporter (DAT) in striatum. In addition, postnatal PQ+MB exposure decreased the number of TH and DAT positive neurons in the substantia nigra pars compacta (SNpc), which was related to the silent toxicity mechanism. These alterations were observed just in male mice. The findings indicate that the exposure to PQ + MB during PN period was able to produce permanent and progressive lesions of the nigrostriatal dopaminergic system and enhanced adult susceptibility of male mice to this pesticide. On the other hand, male and female mice exposed to LPS (at PN days 5 and 10) showed a significant motor deficits and an increase in striatal inflammatory interleukin levels. Male mice exposed developmentally to LPS and re-challenged as adults to PQ + MB showed alterations in motor function, indicating a possible increase in the adult susceptibility of male mice to the pesticides. The effect of PQ and MB exposure was also investigated in NSC. Pesticides exposure, especially to PQ or PQ+MB reduced cell proliferation and induced an increase in reactive species generation. The decrease in cell proliferation was elated to alterations in gene expression of important proteins modulating the cell cycle regulation. Taken together, these findings indicate that exposure to environmental toxicants and the inflammatory process during brain development might lead to a progressive neurotoxicity late in life.

Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas. Programa de Pós-Graduação em Bioquímica, Florianópolis, 2015. / Made available in DSpace on 2016-10-19T13:03:14Z (GMT). No. of bitstreams: 1 338971.pdf: 3352887 bytes, checksum: ce3157b765264ba2c34f1e75e377aa64 (MD5) Previous issue date: 2015 / A doença de Parkinson (DP) é uma doença neurodegenerativa de causa multifatorial, cujos sintomas manifestam-se normalmente na fase adulta tardia. Evidências recentes têm apontado para fatores ambientais do período perinatal (incluindo a exposição a pesticidas) e o processo inflamatório (causado por infecções virais ou bacterianas) como causadores de toxicidade direta aos neurônios dopaminérgicos. Ainda, estudos sugerem que exposições à toxicantes durante o período perinatal podem ser responsáveis por uma condição de toxicidade silenciosa com consequências tardias e duradouras no sistema dopaminérgico nigroestriatal, algumas das quais são evidenciadas apenas se este sistema sofrer um novo insulto na fase adulta. Embora tais evidências pareçam ser de grande importância para o entendimento da etiologia da doença de Parkinson idiopática, os mecanismos moleculares relacionados a tais fenômenos são desconhecidos. O objetivo do presente trabalho foi investigar os mecanismos relacionados à neurotoxicidade dopaminérgica tardia decorrente da exposição aos pesticidas paraquat (PQ) e maneb (MB) ou ao processo inflamatório induzido pela administração sistêmica de lipopolissacarídeo (LPS) no sistema nigroestriatal em desenvolvimento relacionando-os com o eventual aumento da susceptibilidade a insultos neurotóxicos decorrentes da exposição aos pesticidas na fase adulta. Além disso, objetivou-se investigar o efeito da exposição aos pesticidas PQ e MB em cultivos de células tronco neurais sobre parâmetros de proliferação e diferenciação celular. Camundongos Swiss machos e fêmeas foram expostos a uma combinação dos pesticidas PQ e MB (PQ + MB) diariamente entre o dia pós-natal (PN) 5 ao 19. A exposição PN ao PQ + MB não causou mortalidade, alterações no peso corporal e nem alterações comportamentais no sistema motor dos animais, indicando ausência de toxicidade evidente. Entretanto, houve redução na atividade dos complexos I e II da cadeia transportadora de elétrons mitocondrial, além de redução nos níveis dos marcadores dopaminérgicos tirosina hidroxilase (TH) e transportador de dopamina (DAT) no estriado. Ainda, houve uma diminuição significativa no número de neurônios TH e DAT positivos na substância negra pars compacta (SNpc), a qual pode estar relacionada ao mecanismo de toxicidade silenciosa. Essas alterações foram evidenciadas apenas nos camundongos machos. Quando esses animais foram reexpostos aos mesmos toxicantes na vida adulta foram observadas alterações motoras, bem como degeneração dos neurônios dopaminérgicos na SNpc, indicando um aumento na susceptibilidade dos animais machos à segunda exposição na vida adulta. Por outro lado, camundongos Swiss machos e fêmeas expostos ao LPS (dia PN 5 e 10) apresentaram comprometimento motor significativo e aumento nos níveis de interleucinas inflamatórias no estriado. Quando esses animais foram expostos aos pesticidas na vida adulta, apenas os camundongos machos apresentaram alterações comportamentais que podem indicar um possível aumento na susceptibilidade dos animais. Por fim, foi avaliado o efeito da exposição ao PQ e MB em cultivos primários de células tronco neurais de ratos. A exposição aos pesticidas, especialmente o PQ ou a associação PQ + MB induziu uma redução na proliferação celular e um aumento na geração de espécies reativas. A redução na proliferação celular foi relacionada a alterações na expressão gênica de proteínas importantes na regulação do ciclo celular. Os dados indicam que exposições a toxicantes ambientais e o processo inflamatório durante períodos críticos do desenvolvimento cerebral podem levar a uma progressiva neurotoxicidade na vida adulta.<br> / Abstract : Parkinson's disease (PD) is a multifactorial neurodegenerative disorder with late-life onset. It has been hypothesized that PD could arise from events that occur early in development that have long-term but delayed adverse consequences for the nigrostriatal dopamine system, which may become evident only if the system undergoes further adult-related insult. Possible developmental events could include exposures to environmental neurotoxicants (including pesticides) and inflammatory process (induced by bacterial or viral infections). A "silent toxic" status has been hypothesized to be responsible for the enhanced adult susceptibility to environmental factors known to be involved in the induction of neurodegenerative disorders. However, the molecular mechanisms related with this phenomenon are unknown. Therefore, the objective of the present study was to investigate the mechanisms of late dopaminergic toxicity induced by exposures to the pesticides paraquat (PQ) and maneb (MB), as well as the inflammatory process induced by systemic lipopolysaccharide (LPS) administration on the nigrostriatal dopaminergic system during the early-postnatal development. In addition, we aimed to evaluate whether pesticides or LPS exposure during critical periods of development could enhance the vulnerability of the dopaminergic system to the toxicity elicited by subsequent re-exposure to the pesticide in adult life. Moreover, we aimed to investigate the effects of PQ and MB exposure in primary embryonic neural stem cells (NSC) on parameters related to cell proliferation and differentiation. Male and female Swiss mice were treated daily with a combination of PQ and MB (PQ + MB) from post-natal (PN) day 5 to 19. Pesticide exposure did not induce mortally; neither modify body weight nor mice motor function. However, PQ + MB exposure decreased the activity of mitochondrial complex I and II and reduced the levels of tyrosine hydroxylase (TH) and dopamine transporter (DAT) in striatum. In addition, postnatal PQ+MB exposure decreased the number of TH and DAT positive neurons in the substantia nigra pars compacta (SNpc), which was related to the silent toxicity mechanism. These alterations were observed just in male mice. The findings indicate that the exposure to PQ + MB during PN period was able to produce permanent and progressive lesions of the nigrostriatal dopaminergic system and enhanced adult susceptibility of male mice to this pesticide. On the other hand, male and female mice exposed to LPS (at PN days 5 and 10) showed a significant motor deficits and an increase in striatal inflammatory interleukin levels. Male mice exposed developmentally to LPS and re-challenged as adults to PQ + MB showed alterations in motor function, indicating a possible increase in the adult susceptibility of male mice to the pesticides. The effect of PQ and MB exposure was also investigated in NSC. Pesticides exposure, especially to PQ or PQ+MB reduced cell proliferation and induced an increase in reactive species generation. The decrease in cell proliferation was elated to alterations in gene expression of important proteins modulating the cell cycle regulation. Taken together, these findings indicate that exposure to environmental toxicants and the inflammatory process during brain development might lead to a progressive neurotoxicity late in life.

Submitted by Reginaldo Soares de Freitas (reginaldo.freitas@ufv.br) on 2016-08-26T17:49:30Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 337538 bytes, checksum: 7a3a74d4b3207545736511cb0477a46e (MD5) / Made available in DSpace on 2016-08-26T17:49:30Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 337538 bytes, checksum: 7a3a74d4b3207545736511cb0477a46e (MD5) Previous issue date: 1996-08-28 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Os fungicidas ditiocarbamatos são amplamente empregados em diversas olericulturas no controle da requeima da batata e do tomate, no mídio da videira, em antraquinoses da abóbora e do pepino, etc. Apesar de a maioria desses fungicidas estarem catalogados na classe de toxicidade inexpressiva ao homem, eles podem apresentar, em casos excepcionais, riscos sérios à saúde humana. Procurou-se, neste trabalho, avaliar o nível de contaminantes em tomates produzidos e comercializados na região de Viçosa, determinando-se os índices de resíduos de fungicidas ditiocarbamatos no fruto total, na casca e na polpa. Desse modo, fez-se necessário determinar a curva de persistência do fungicida maneb, em tomates, em duas condições: amostras expostas no campo e amostras armazenadas em laboratório. Para essas análises utilizou-se o método espectrofotométrico de hidrólise ácida, amplamente estudado preliminarmente, no qual fez-se uso de Curva de Calibração e Calibração Multivariada (PLS) e do método espectrofotométrico de extração com 1-(2'-piridilazo)-2-naftol (PAN). Para identificar o fungicida ditio-carbamato presente nas amostras aleatórias, foi empregada Cromatografia em Camada Delgada (CCD). Os resultados foram expressos em níveis de maneb, fungicida ditio-carbamato bastante utilizado pelos agricultores dessa região. O tempo máximo de permanência deste fungicida foi de 10 dias no fruto armazenado em laboratório e de oito dias no fruto exposto no campo, sendo o tempo máximo de permanência estipulado pelo fabricante de sete dias. Comparando os resultados, o método espectrofotométrico de extração com PAN apresentou níveis de resíduos de maneb relativamente superiores aos encontrados pelo método espectrofotométrico de hidrólise ácida. Possivelmente, espécies de manganês presentes, oriundas da degradação do maneb, interferem no processo de complexação com PAN, o que poderia justificar esses resultados. O uso da Calibração Multivariada possibilitou estudos de técnicas com-putacionais, complementando o método espectrofotométrico de hidrólise ácida. Os níveis de resíduos de maneb determinados no fruto total estão abaixo do limite máximo permitido pela legislação, que é de 2 mg kg-1 em tomates. / Dithiocarbamates fungicides are widely used to control a great variety of fungous diseases in potatoes, grapes, pumpkins, cucumbers, etc. In general these fungicides are considered harmless to the human health, however in some exceptional cases they may show strong toxicity. The aim of this work was the determination of dithiocarbamates residues in tomatoes, produced and sold in Viçosa region. The tomatoes were analysed as total fruit, peel and pulp. It was studied the persistence time of the fungicide Maneb in tomatoes submitted to two different conditions: one exposed on field and the other stored in laboratory. The carbon disulfide evolution method, studied previously, was used for the analysis of dithiocarbamate residues, using both the univariated and the multivariated calibration methods. It was also used the extraction spectrophotometric determination with 1-(2’-pyridilazo)-2-naphthol (PAN). For the identification of the dithiocarbamate fungicide present in the samples it was used thin layer chromatography. The obtained fungicides concentrations were expressed as Maneb (μg g-1) which is the fungicide most frenquently used in Viçosa. It was found that the maximum persistence time of fungicide in tomatoes stored in laboratory was of 10 days whereas for tomatoes exposed on field were of 8 days. These results contrast with the persistence time reported by the Maneb’s manufacturer which is claimed to be of 7 days. The method of Maneb residues analyses by extraction spectrophotometric with PAN showed relatively higher values compared to the carbon disulfide evolution method. This might be due to manganese species such as MnS and MnO2 originated from the Maneb decomposition which can interfere in the process of complexation with PAN. The multivariated calibration method allowed the use of computacional techniques which improved the carbon disulfide evolution method. The Maneb residue levels detected in total fruit in all cases were lower than 2 μg g-1 of tomatoes which is the maximum value specified by the Brazilian legislation. / Não foi encontrado o CPF do autor e o mesmo não apresentou título em inglês.

Las enfermedades neurodegenerativas se caracterizan por la muerte de las neuronas de forma selectiva y progresiva que lleva a la pérdida de funciones primordiales, y muchas veces vitales, en distintas zonas del cerebro. Se desarrollan, por lo general, en una forma familiar hereditaria y una esporádica, siendo esta última la de mayor prevalencia. En líneas generales, presentan ciertas características moleculares que parecen ser comunes a todas ellas: la presencia de estrés oxidativo y agregados patológicos de proteínas, lo que desencadena proteotoxicidad y disfunción mitocondrial. La formación de agregados proteicos intra- o extracelulares ha sido objeto de estudio recurrente en estas patologías. Estas proteínas se encuentran, por lo general, mal plegadas, con predominio de estructuras en lámina β, lo que lleva a la formación de oligómeros en primer lugar, que luego se transforman en fibrillas y, por último, en agregados macromoleculares. La α-sinucleína es una proteína de bajo peso molecular (19 kDa) a la que se le han atribuido diversas funciones biológicas entre las que se encuentran la regulación de la plasticidad sináptica y el flujo y liberación de vesículas sinápticas en el proceso de neurotransmisión. Sin embargo, la sobreproducción de la proteína o su agregación patológica son marcadores comunes en un conjunto de enfermedades neurodegenerativas llamadas sinucleinopatías, entre las que se incluye a la enfermedad de Parkinson. En este trabajo, entonces, buscamos conocer la respuesta neuronal ante la sobreexpresión de la α-sinucleína inducida por dos mecanismos diferentes: la transfección de una línea neuronal con la forma salvaje de la proteína y el tratamiento con un pesticida cuya exposición ha demostrado ser inductora de parkinsonismo. En el primer capítulo, sabiendo que una característica aún no completamente dilucidada es la relación de la α-sinucleína con los lípidos, estudiamos el rol de la vía de la fosfolipasa D1 (PLD1) y su producto, el ácido fosfatídico, en la respuesta a la sobreexpresión de la α-sinucleína. Utilizamos la línea celular IMR32 transfectada con la forma salvaje de la α- sinucleína (WT α-sin) y como controles, la misma línea sin transfectar (st) y transfectada con el vector vacío (vv). La sobreexpresión de la α-sinucleína, que fue de entre 2 y 3 veces mayor que en los controles, provocó una significativa disminución de los niveles del marcador neuronal neurofilamento liviano y alteraciones en el citoesqueleto de actina, todos estos efectos se reflejaron en una disminución en la viabilidad celular de un 20 %, por lo que consideramos que el modelo de trabajo representaba los estadios tempranos de la neurodegeneración asociada a las sinucleinopatías. Se observó que la sobreexpresión de la α-sinucleína causó la disminución tanto de los niveles proteicos como de ARNm de la PLD1, así como también de la actividad de la enzima, lo cual se manifestó con una menor producción de ácido fosfatídico. La inhibición de la PLD1 inducida por el aumento de expresión de la α-sinucleína provocó defectos en la señalización de las quinasas 1 y 2 reguladas por señales extracelulares (ERK1/2) representados por una disminuida expresión y fosforilación de estas quinasas, así como su secuestro en la fracción nuclear. Con estos datos, y para dilucidar una posible relación entre la PLD1, las ERK1/2 y la α-sinucleína, utilizamos un inhibidor farmacológico de la PLD1 en células st y observamos que el inhibidor produjo una disminución en la fosforilación de las ERK1/2 y un cambio en su distribución subcelular, translocando al núcleo en el caso de las células tratadas con inhibidor. Este efecto se vio potenciado en las células WT α-sin, lo que indicaría una relación entre la inhibición de la expresión y la actividad de la PLD1 y la desregulación de la vía de las ERK1/2 con su predominante localización nuclear. El uso de este inhibidor selectivo de la actividad de la PLD1 en neuronas st también demostró que el bloqueo farmacológico de esta vía de señalización provocaba una marcada disminución en la expresión del neurofilamento liviano. En células WT α-sin la inhibición farmacológica de la vía de la PLD1 y de las ERK1/2 provocó una drástica disminución de los niveles del neurofilamento liviano que fueron prácticamente indetectables, potenciándose, de este modo, los resultados hallados en presencia de sobreexpresión de la α-sinucleína. Para corroborar observado, realizamos un ensayo de recuperación de función realizando una transfección transitoria de células WT α-sin con las formas constitutivamente activas de la PLD1, la fosfolipasa D2 y de las ERK1/2 para luego analizar la expresión del neurofilamento liviano. Observamos una recuperación en los niveles de expresión de este neurofilamento en células positivas para PLD1 y ERK1/2 en neuronas WT α-sin. También analizamos la expresión del marcador de apoptosis caspasa-3 clivada que resultó aumentado significativamente cuando se sobreexpresó la PLD1 de forma transitoria. Esto nos llevó a concluir que ante la sobreexpresión de la α-sinucleína las neuronas adoptan una estrategia de supervivencia en detrimento de la pérdida del neurofilamento liviano y, consecuentemente, del fenotipo neuronal. En el segundo capítulo utilizamos el pesticida maneb, un agroquímico asociado con la inducción de síndrome parkinsoniano, y evaluamos su efecto en las líneas celulares vv y WT α-sin. Encontramos que el tratamiento con el pesticida produjo un incremento de la muerte celular acompañado de un aumento de las especies reactivas de oxígeno y de la permeabilidad de la membrana plasmática. La sobreexpresión de la α-sinucleína resultó ser protectora frente al pesticida. Esta observación se vio acompañada por un aumento en la expresión de dos enzimas del sistema de defensa antioxidante, superóxido dismutasa y glutamato-cisteína ligasa. También evaluamos la expresión y la fosforilación de la α-sinucleína, y observamos que el tratamiento con el pesticida aumentó la expresión de esta proteína, algo que no sucedió cuando la proteína ya se encontraba sobreexpresada. La fosforilación de la α-sinucleína se vio significativamente aumentada por tratamiento con maneb en el caso de células vv, y no hubo cambios en las células WT α-sin con respecto al control. También evaluamos la fosforilación de Tau como marcador de neurodegeneración y encontramos que los niveles de pTau aumentaron tanto por exposición al pesticida como por sobreexpresión de la α-sinucleína, siendo aún mayor este incremento en las células WT α-sin tratadas con maneb. También tratamos a las células con el antioxidante N-acetilcisteína para determinar las implicancias del incremento de especies reactivas de oxígeno inducido por maneb en la expresión de la α-sinucleína, y encontramos que efectivamente la expresión de la proteína disminuyó por tratamiento con el antioxidante tanto en células vv como WT α-sin. Para indagar en los mecanismos de señalización involucrados en la respuesta a la toxicidad del pesticida, estudiamos el estado de la vía fosfatidilinositol 3 quinasa/proteína quinasa B/y el factor de transcripción FoxO3a (PI3K/Akt/FoxO3a). Encontramos que Akt incrementaba su expresión en el núcleo con el tratamiento con maneb, de igual manera en células vv y WT α-sin, mientras que su fosforilación se veía incrementada tanto en el citosol como en el núcleo de las dos líneas celulares trabajadas. En el caso de FoxO3a, su expresión se vio aumentada por sobreexpresión de la α-sinucleína y conjuntamente con el tratamiento con maneb; su fosforilación aumentó de forma muy significativa por tratamiento con maneb en ambas líneas celulares. Evaluamos, en último lugar, la alteración de la expresión de FoxO3a y la viabilidad celular por tratamiento con el inhibidor de PI3K LY294002. Encontramos un aumento de la expresión del factor de transcripción por tratamiento conjunto con el inhibidor y el pesticida en las dos líneas celulares. En cuanto a la viabilidad, el tratamiento con inhibidor y pesticida produjo una disminución significativa de igual magnitud tanto en células vv como WT α-sin. Podemos decir entonces que la respuesta al daño inducido por maneb y la protección por sobreexpresión previa de la α-sinucleína en este modelo celular podría estar siendo mediada por la vía PI3K/Akt/FoxO3a. En resumen, en este trabajo de tesis se caracterizó el rol de dos vías de señalización dependientes de la producción de lípidos bioactivos en procesos de daño neuronal asociados con sinucleinopatías. / Neurodegenerative diseases are characterized by neuronal death in a selective and progressive manner leading to the gradual loss of functions in different brain areas. These disorders mostly develop in a sporadic form, being a small percentage due to inheritance. In general, these neurodegenerative disorders have share different molecular features, namely, the presence of oxidative stress and pathological protein aggregates, both of which lead to proteotoxicity and mitochondrial dysfunction. The formation of intra- or extracellular protein aggregates in these pathologies constitutes a subject of recurrent study. These proteins are generally misfolded, with a predominance of β-sheet structures, which leads to the formation of oligomers, fibrils, and, finally, macromolecular aggregates. α-Synuclein is a small protein (19 kDa) that has been extensively studied for its structural and biophysical properties. Several biological functions have been attributed to α-synuclein, namely, the regulation of synaptic plasticity and the flow and release of synaptic vesicles in the neurotransmission process. However, its overexpression and pathological aggregation are hallmarks in a group of neurodegenerative disorders grouped under the name of synucleinopathies, including Parkinson's disease. This thesis work aimed to study the neuronal response to α-synuclein overexpression induced by two different methods: transfection of a neuronal cell line with the wild type form of human α-synuclein and the treatment with an agrochemical pesticide that has been shown to induce parkinsonism. In the first chapter, on the base of the still not fully dilucidated relationship between α-synuclein and lipids, we studied the role of the phospholipase D1 (PLD1) pathway and its product, phosphatidic acid, in the response to α-synuclein overexpression. For this purpose, human IMR32 neuroblastoma cells transfected with either the wild type form of α-synuclein (WT α-syn) or the empty vector (vv), and the untransfected cell line (st) were used as experimental models. WT α-syn cells, which displayed α-synuclein levels 2-3-fold higher than the controls (st and vv), showed a significant decrease in the levels of the neuronal marker neurofilament light chain, alterations in the actin cytoskeleton, and a decreased cell viability of 20%. This characterization allowed us to propose this biological model as representative of early-stage neurodegeneration associated with synucleinopathies. We also observed that α-synuclein overexpression caused a decrease in the protein and mRNA levels of PLD1, as well as in the activity of the enzyme, which was manifested by a lower production of phosphatidic acid. Also, the inhibition of PLD1 induced by α-synuclein overexpression caused an impairment in extracellular signal-regulated kinases (ERK1/2) signaling mainly represented by the decreased expression and phosphorylation of both kinases as well as their sequestration in the nuclear compartment. To elucidate a possible cross-talk between PLD1, ERK1/2, and α-synuclein, we used a pharmacological inhibitor of PLD1 in st cells. In these conditions, PLD1 inhibition caused a decrease in the phosphorylation level of ERK1/2 and a predominantly nuclear localization of these kinases. These effects were enhanced in WT α-syn cells, which would indicate a cross-talk between α-synuclein overexpression-induced PLD1 downregulation and the changes observed in ERK1/2 pathway. Moreover, PLD1 inhibition in st cells also triggered the decreased expression of the neurofilament light chain, and pharmacological inhibition of the PLD1 and ERK1/2 pathways in WT α-syn cells provoked almost the loss of the expression of the neuronal marker, showing potentiated effects in the latter case. To support these findings, we performed function recovery assays by inducing the transient expression of the constitutively active forms of PLD1, phospholipase D2, and ERK1/2 in WT α-syn cells. The restoration of PLD1 and ERK1/2 level in WT α-syn cells was able to recover the expression level of the neurofilament light chain. We also observed that the recovery of neurofilament light chain expression also triggered an increase in the apoptotic marker cleaved caspase-3. This led us to conclude that α-synuclein overexpression triggers a survival strategy in neurons that is characterized by the loss of the neurofilament light chain and, consequently, loss of the neuronal phenotype. In the second chapter, we evaluated the effect of the pesticide maneb, an agrochemical associated with the induction of parkinsonian syndrome, on vv and WT α-syn cells. We found that maneb treatment caused an increase in cell death, accompanied by the generation of reactive oxygen species and increased plasma membrane permeability. The exposure to the pesticide showed to be less harmful in neurons with α-synuclein overexpression than in control cells. The protection exerted by α-synuclein overexpression was accompanied by the increased expression of two enzymes of the antioxidant defense system: superoxide dismutase and glutamate-cysteine ligase. Maneb exposure increased α-synuclein expression and phosphorylation only in vv cells. Tau phosphorylation was also evaluated as a marker of neurodegeneration. p-Tau levels increased both by the exposure to the pesticide and by α-synuclein overexpression, being this increase even greater in the WT α-syn cells. To study the relationship between maneb-induced increase of reactive oxygen species and α-synuclein expression, we utilized the antioxidant N-acetyl-cysteine in our experiments. N-acetyl-cysteine decreased the levels of α-synuclein expression in vv and WT α-syn cells. To investigate the signaling mechanisms involved in the neuronal response to maneb toxicity, we studied the PI3K/Akt/FoxO3a pathway. We found that Akt expression was increased in the nuclear compartment of vv and WT α-syn cells treated with maneb. However, Akt phosphorylation was found to be increased in the cytosolic and nuclear compartments of both cell lines treated with the pesticide. Similar results were observed in FoxO3a expression and phosphorylation in both cell lines.Finally, we evaluated the alteration of FoxO3a expression and cell viability by treatment with the PI3K inhibitor LY294002. We found an increase in the transcription factor expression induced by the cotreatment of maneb and the PI3K inhibitor in vv and WT α-syn cells. In terms of cell survival, the treatment with LY294002, together with the pesticide, produced a similar decrease in cell viability in both cell lines. Based on these results, it can be concluded that the PI3K/Akt/FoxO3a pathway could mediate the response to maneb-induced damage in vv cells and that the neuroprotection exerted by α-synuclein overexpression could be mediated by different mechanisms that still need to be elucidated. In summary, this work characterized the role of two signaling pathways that produce bioactive lipids in neuronal damage processes associated with synucleinopathies. / TESIS PARCIAL en período de teletrabajo

La présente étude a investi les effets des lésions des systèmes monoaminergiques surles fonctions motrices et non-motrices, y compris l’évaluation des comportements anxieux etdépressifs ainsi que les rythmes circadiens dans le contexte de la maladie de Parkinson (MP).D’abord, nous avons mis en place un modèle animal approprié en utilisant une intoxication auParaquat/Maneb (PQ/MB) ou avec des lésions sélectives des systèmes monoaminergiques.Ensuite, nous avons caractérisé les modèles en utilisant des approches comportementale,biochimique et électrophysiologique.Dans la première partie de cette étude, nous avons investi la validité du modèle PQ/MB parévaluer les effets du PQ/MB sur : (1) l’activité locomotrice et la coordination motrice enutilisant les tests de l’Open Field et du Rotarod, (2) les comportements anxieux et dépressif enutilisant les tests du labyrinthe en croix surélevé et de la nage forcée respectivement, (3)l’activité neuronale du noyau sous-thalamique en utilisant des enregistrements extracellulairesunitaires et (4) les concentrations tissulaires en dopamine, noradrénaline et sérotonine dans lestriatum et le cortex frontal.Nos résultats montrent que les rats Sprague Dawley mâles ne sont pas sensibles de la mêmefaçon au PQ/MB et que les déficits moteurs observés chez les animaux vulnérables ne sont passeulement le résultat d’une dégénérescence des neurones dopaminergiques, mais pourraient êtreaussi une conséquence des problèmes périphériques. Néanmoins, les troubles non-moteursobservés chez les animaux de tous les groupes traités pourraient constituer une conséquencedirecte de la déplétion dopaminergique bilatérale.En se basant sur les résultats de la première partie, nous avons utilisé le modèle du rat 6-OHDApour investir les effets de dégénérescence des cellules dopaminergique seule ou combinée avecles déplétions noradrénergique et sérotoninergique sur l’activité électrique des neurones dunoyau suprachiasmatique (SCN) en utilisant des enregistrements électrophysiologiquesextracellulaires. Le SCN est une structure clé impliquée dans le contrôle des rythmescircadiens. Nos résultats montrent pour la première fois que les déplétions monoaminergiquessont à l’origine des changements dans l’activité électrique des neurones du SCN, apportant desrésultats nouveaux qui suggèrent que les changements dans la décharge électrique des SCN quiperturbent les rythmes circadiens font partie de la physiopathologie de la MP. / The present study aimed to investigate the effects of monoaminergic system lesionson the motor and non-motor functions, including anxiety, depression and circadian rhythmswithin the context of Parkinson’s disease. First, we developed appropriate animal models usingcombined paraquat/maneb (PQ/MB) intoxication or using selective lesions of monoaminergicsystems; second, we characterized the models using behavioral, biochemical andelectrophysiological approaches.In the first part of the study, we investigated the relevance of the PQ/MB model by studyingthe effects of combined PQ/MB on: (1) locomotor activity and motor coordination using theopen field and the rotarod test respectively, (2) anxiety and “depressive-like” behaviors usingthe elevated plus maze and the forced swim test respectively, (3) subthalamic nucleus neuronalactivity using extracellular single unit recordings and (4) tissue level of dopamine,noradrenaline and serotonin in the striatum and frontal cortex.Our data provide evidence that male Sprague Dawley rats are not equally sensitive to PQ/MBand that the observed motor deficits in vulnerable animals are not only a result of dopamineneuron degeneration, but may also be a consequence of peripheral disabilities. Nevertheless,the parkinsonian-like non-motor impairments may be a direct consequence of the bilateraldopamine depletion.Based on the results of the first part, we used the 6-OHDA rat model to investigate the effectsof DA cell degeneration, alone or combined with the noradrenaline (NA) and/or serotonin (5-HT) depletions, on the electrical activity of suprachiasmatic nucleus (SCN) neurons usingextracellular electrophysiological recordings. SCN is a key structure involved in the control ofcircadian rhythms. Our data provide the first evidence that monoamine depletions are at theorigin of changes in the firing activity of SCN neurons, suggesting new insight into theinvolvement of these electrical changes in the pathophysiology of circadian rhythms disruptionin PD.