Einleitung: Der Einfluss von Stress während der Schwangerschaft auf den Fetus lässt sich auch postnatal bis in das Erwachsenenalter und teilweise sogar bis in nachfolgende Generationen nachweisen. Eine Vielzahl an Störgrößen erschwert es enorm, beim Menschen konkrete Kausalitäten auszuarbeiten. Mit dem Weißbüschelaffen steht ein humanrelevanter Modellorganismus zur Verfügung, der eine dem Menschen sehr ähnliche Situation in Bezug auf die Physiologie der Trächtigkeit sowie der männlichen Reproduktion bietet, gleichzeitig jedoch einen hohen Grad der Standardisierung ermöglicht. Ziele der Untersuchungen: Im Rahmen der vorliegenden Arbeit sollten ausgewählte Faktoren des Reproduktionssystems in den Hoden adulter Weißbüschelaffen mittels qPCR und Immunhistochemie nachgewiesen und auf Zellebene lokalisiert werden. Weiterhin sollte ermittelt werden, ob die nachgewiesenen Proteine durch pränatalen Stress beeinflusst werden. Ziel des zweiten Teils der vorliegenden Arbeit war es herauszufinden, ob und in welcher Form sich ein standardisierter pränataler Stressreiz postnatal auf ausgewählte Parameter der männlichen Reproduktion des Weißbüschelaffen bis hin zur F3-Generation auswirken kann. Tiere, Material und Methoden: Trächtige Weißbüschelaffen wurden von Trächtigkeitstag 42 bis 48 (EDEX) bzw. Trächtigkeitstag 90 bis 96 (LDEX) täglich mit 5 mg Dexamethason (DEX) pro kg Körpergewicht per os behandelt. Eine Kontrollgruppe (C) erhielt während der gesamten Trächtigkeit keine Glucocorticoide. Von den adulten männlichen Nachkommen der F1-Generation wurden 9 (C), 8 (EDEX) und 9 (LDEX) jeweils tiefgefrorene Hoden auf 12 Transkripte aus den Gruppen der Enzyme der Steroidbiosynthese, der Steroidrezeptoren, des Relaxinsystems und der Proliferationsmarker mittels qPCR quantitativ untersucht. Die jeweils kontralateralen Hoden waren in Paraformaldehyd fixiert worden und wurden parallel auf Proteinebene mittels Immunhistochemie (IHC) untersucht. Für den zweiten Teil der vorliegenden Arbeit wurden die jeweils in maternaler Linie weitergezüchteten Männchen der DEX F2 (n = 2) und DEX F3 (n = 3) auf relevante Parameter der Reproduktionsfähigkeit hin untersucht: Die Größe der Hoden wurde im Frühling, im Sommer und im Winter gemessen, Blutplasma¬proben an einem Tag im Sommer um 8 Uhr, 12 Uhr und 16 Uhr sowie an einem Tag im Winter um 8 Uhr entnommen und daraus mittels ELISA die Konzentration von Testosteron sowie teilweise von 17β Östradiol ermittelt; Ejakulate wurden durch penile Vibrostimulation (PVS) gewonnen und computergestützt untersucht. Alle Ergebnisse wurden jeweils mit mindestens elf unbehandelten männlichen Tieren derselben Kolonie verglichen. Ergebnisse: Alle untersuchten für die männliche Reproduktion relevanten Proteine konnten in den Hoden der F1 nachgewiesen werden. In den Hoden der EDEX F1 und der LDEX F1 war auf Proteinebene jeweils einzig die Steroid-5α-Reduktase 1 (SRD5A1) gegenüber C erhöht. Auf Genebene waren von den untersuchten Transkripten nur in den Hoden der EDEX F1 die SRD5A1, SRD5A2 und Ki 67 jeweils signifikant gegenüber C aufreguliert. Die Hodengröße änderte sich nicht signifikant im Jahresverlauf. Im Tagesverlauf konnte ein signifikanter Anstieg der Testosteronkonzentration im Blutplasma zwischen 8 Uhr und 12 Uhr ermittelt werden. Jedoch konnte kein signifikanter Unterschied zwischen Testosteronkonzentration im weiteren Tageszeitenvergleich, im Sommer und Winter und in Relation zum Alter festgestellt werden. Darüber hinaus bestand keine Korrelation zwischen Testosteron- und 17β Östradiol¬konzentration aus denselben Blutproben. Der Vergleich aller im Zusammenhang mit der PVS erhobenen Parameter zwischen DEX F2/F3 und C ergab, dass einzig die Erfolgsrate der PVS in DEX F2/F3 niedriger lag als in C. Der versuchsgruppen-übergreifende Vergleich aller Ejakulate zwischen den Altersgruppen ergab bei jung adulten Tieren einen signifikant höheren Anteil an motilen Spermien sowie eine signifikant schlechtere Erfolgsrate der PVS gegenüber adulten Tieren. Schlussfolgerungen: Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit geben Hinweise darauf, wie sich Stress während der Trächtigkeit beim Weißbüschelaffen auf die Nachkommen auswirken könnte: In DEX F1 sind wichtige Voraussetzungen für eine funktionierende Testosteron-Biosynthese sowie die Vermittlung von Testosteron- und Östrogen-mediierten Signalen im Hoden gegeben, möglicherweise sogar in verstärkter Weise. Darüber hinaus bestätigen diese Ergebnisse die Humanrelevanz des Weißbüschelaffen als Modell¬organismus zum männlichen Reproduktionssystem. In DEX F2/F3 könnte die niedrige Erfolgsrate der PVS ein Hinweis auf verminderte Konzentrationsfähigkeit in den auf intra¬uterinen Stress folgenden Generationen sein. Jedoch unterscheiden sich die meisten erhobenen reproduktions-physiologisch bedeutsamen Parameter nicht zwischen DEX F2/F3 und C.:1 EINLEITUNG 2 LITERATURÜBERSICHT 2.1 Glucocorticoide und Stress während der Trächtigkeit 2.2 Relevante Hormone der Reproduktion und ihre Biosynthese 2.2.1 3β-Hydroxysteroid-Dehydrogenase 2 2.2.2 Testosteron und Androgenrezeptor 2.2.3 Steroid-5α-Reduktasen 2.2.4 Aromatase 2.2.5 17β-Hydroxysteroid-Dehydrogenase 7 2.2.6 Östradiol und Östrogenrezeptoren 2.2.7 Relaxinsystem 2.2.8 Proliferationsfaktoren 2.3 Weißbüschelaffen 2.3.1 Allgemeines zu Weißbüschelaffen 2.3.2 Reproduktionsbiologie der männlichen Weißbüschelaffen 3 TIERE, MATERIAL UND METHODEN 3.1 Versuchsteil I – ex vivo Hoden DEX F1 3.1.1 Versuchsaufbau (DEX) im DPZ 3.1.2 qPCR an DEX F1 Hoden 3.1.3 Immunhistochemie an Hoden der DEX F1 3.2 Versuchsteil II – in vivo DEX F2/DEX F3 3.2.1 Herkunft der Weißbüschelaffen 3.2.2 Haltung der Weißbüschelaffen 3.2.3 Bestimmung der Hodengrößen und des Körpergewichtes 3.2.4 Blutentnahmen und Hormonbestimmungen mittels ELISA 3.2.5 Penile Vibrostimulation 3.3 Statistische Auswertung 4 ERGEBNISSE 4.1 Versuchsteil I – ex vivo Hoden DEX F1 4.1.1 qPCR der Hoden der F1 4.1.2 Immunhistochemie der Hoden der DEX F1 4.1.2.1 Enzyme der Steroidbiosynthese 4.1.2.2 Steroidrezeptoren 4.1.2.3 Relaxinsystem 4.1.2.4 Proliferationsmarker 4.1.3 Zusammenfassung der Ergebnisse des Versuchsteils I – ex vivo DEX F1 4.2 Versuchsteil II – in vivo DEX F2/F3 4.2.1 Hodengrößen 4.2.2 Testosteron 4.2.3 Ejakulatanalyse 4.2.4 Zusammenfassung der Ergebnisse des Versuchsteils II – in vivo DEX F2/F3 5 DISKUSSION 5.1 Versuchsteil I – ex vivo Hoden DEX F1 5.1.1 Vergleichende Diskussion der Ergebnisse auf Gen- und Proteinebene in den Hoden der F1 5.1.1.1 Relevante Enzyme der Testosteronbiosynthese 5.1.1.2 Steroidrezeptoren 5.1.1.3 Das Relaxinsystem 5.1.1.4 Proliferationsfaktoren 5.2 Versuchsteil II – in vivo DEX F2/F3 5.2.1 Hodengrößen 5.2.2 Testosteron 5.2.3 Ejakulatanalyse 5.3 Schlussbetrachtung 6 ZUSAMMENFASSUNG 7 SUMMARY 8 Literaturverzeichnis 9 ANHANG 10 DANKSAGUNG / Introduction: The impact of prenatal stress can also be detected in the grown-up offspring and partly even in following generations. There are many interfering variables that make it nearly impossible to establish precise correlations in humans. However, the common marmoset is a model organism very similar to humans with respect to the physiology of pregnancy as well as to male reproduction. In addition to that, the possibility of a high-grade standardisation is extremely advantageous. Objective: The first part of this work aimed at detecting selected factors of the reproductive system in testes of adult common marmosets by qPCR and immunohistochemistry, and localising them at the cellular level; both were directed at clarifying whether or not the target proteins respond to prenatal stress. The second part aimed at determining in which form and to what extent standardised prenatal stress affects selected parameters of male reproduction up to the F3-generation in the common marmoset. Animals, materials and methods: Pregnant common marmosets were treated daily with a dose of 5 mg dexamethasone (DEX) per kg body weight per os on gestational days 42 to 48 (EDEX) and gestational days 90 to 96 (LDEX). A control group (C) received no glucocorticoid treatment during pregnancy at all. By qPCR, 12 transcripts from the groups of steroidogenic enzymes, steroid receptors, the relaxin system and the proliferation markers were quantitatively analysed in 9 (C), 8 (EDEX) und 9 (LDEX) frozen testes of F1 generation adult male offspring. Respective contralateral testes had been fixed in paraformaldehyde and were analysed on protein level by immunohistochemistry (IHC). In the second part of this work, males of DEX F2 (n = 2) and DEX F3 (n = 3), each bred in the maternal line, were analysed for relevant parameters of reproduction ability: testes were measured in spring, summer, and winter; blood plasma samples were taken on one day in summer at 8 a.m., 12 noon and 4 p.m. as well as on a day in winter at 8 a.m. and subsequently analysed by ELISA for testosterone and partly 17β oestradiol; ejaculates have been gathered by penile vibrostimulation (PVS) and were tested by computer-assisted sperm analysis. All results were compared with those on at least 11 untreated male common marmosets of the same colony. Results: Each of the targeted proteins relevant for male reproduction was detected in testes of F1. At the protein level only steroid 5α-reductase 1 (SRD5A1) was enhanced expressed in testes of EDEX F1, and LDEX F1 compared to C. At the gene level, SRD5A1, SRD5A2 and Ki 67 were each enhanced expressed compared to C, but in testes of EDEX F1 only. Testis size did not vary significantly during the course of the year. During the course of the day there was a significant rise of the testosterone concentration in blood plasma between 8 a.m. and 12 noon. However, there was no significant difference in the testosterone concentration during other times of the day, nor between summer and winter or in relation to the age of the monkeys. Furthermore there was no correlation between the testosterone and the 17β oestradiol concentrations in the same blood samples. Comparisons of all measured PVS parameters between DEX F2/F3 and C gave a lower success rate of PVS in DEX F2/F3 as the only difference. Comparisons of the ejaculates between age groups irrespective of the DEX classification revealed that young adult common marmosets possess a significantly higher percentage of motile sperms as well as a significantly lower success rate of PVS compared to adult monkeys. Conclusions: The results of this study suggest how stress during pregnancy could influence subsequent generations in the common marmoset: in DEX F1, important requirements of active testosterone biosynthesis as well as of mediation of testosterone and oestrogen signals in testis are met, possibly even enhanced. In addition, these results confirm the relevance of the common marmoset as a model organism for human male reproduction. In DEX F2/F3, the low success rate of PVS might indicate a reduced capability to concentrate in generations following intrauterine stress on F1. Yet, most of the tested parameters pertinent to reproduction physiology do not differ between DEX F2/F3 and C.:1 EINLEITUNG 2 LITERATURÜBERSICHT 2.1 Glucocorticoide und Stress während der Trächtigkeit 2.2 Relevante Hormone der Reproduktion und ihre Biosynthese 2.2.1 3β-Hydroxysteroid-Dehydrogenase 2 2.2.2 Testosteron und Androgenrezeptor 2.2.3 Steroid-5α-Reduktasen 2.2.4 Aromatase 2.2.5 17β-Hydroxysteroid-Dehydrogenase 7 2.2.6 Östradiol und Östrogenrezeptoren 2.2.7 Relaxinsystem 2.2.8 Proliferationsfaktoren 2.3 Weißbüschelaffen 2.3.1 Allgemeines zu Weißbüschelaffen 2.3.2 Reproduktionsbiologie der männlichen Weißbüschelaffen 3 TIERE, MATERIAL UND METHODEN 3.1 Versuchsteil I – ex vivo Hoden DEX F1 3.1.1 Versuchsaufbau (DEX) im DPZ 3.1.2 qPCR an DEX F1 Hoden 3.1.3 Immunhistochemie an Hoden der DEX F1 3.2 Versuchsteil II – in vivo DEX F2/DEX F3 3.2.1 Herkunft der Weißbüschelaffen 3.2.2 Haltung der Weißbüschelaffen 3.2.3 Bestimmung der Hodengrößen und des Körpergewichtes 3.2.4 Blutentnahmen und Hormonbestimmungen mittels ELISA 3.2.5 Penile Vibrostimulation 3.3 Statistische Auswertung 4 ERGEBNISSE 4.1 Versuchsteil I – ex vivo Hoden DEX F1 4.1.1 qPCR der Hoden der F1 4.1.2 Immunhistochemie der Hoden der DEX F1 4.1.2.1 Enzyme der Steroidbiosynthese 4.1.2.2 Steroidrezeptoren 4.1.2.3 Relaxinsystem 4.1.2.4 Proliferationsmarker 4.1.3 Zusammenfassung der Ergebnisse des Versuchsteils I – ex vivo DEX F1 4.2 Versuchsteil II – in vivo DEX F2/F3 4.2.1 Hodengrößen 4.2.2 Testosteron 4.2.3 Ejakulatanalyse 4.2.4 Zusammenfassung der Ergebnisse des Versuchsteils II – in vivo DEX F2/F3 5 DISKUSSION 5.1 Versuchsteil I – ex vivo Hoden DEX F1 5.1.1 Vergleichende Diskussion der Ergebnisse auf Gen- und Proteinebene in den Hoden der F1 5.1.1.1 Relevante Enzyme der Testosteronbiosynthese 5.1.1.2 Steroidrezeptoren 5.1.1.3 Das Relaxinsystem 5.1.1.4 Proliferationsfaktoren 5.2 Versuchsteil II – in vivo DEX F2/F3 5.2.1 Hodengrößen 5.2.2 Testosteron 5.2.3 Ejakulatanalyse 5.3 Schlussbetrachtung 6 ZUSAMMENFASSUNG 7 SUMMARY 8 Literaturverzeichnis 9 ANHANG 10 DANKSAGUNG

This thesis extends the understanding of the neural and neurochemical contributions to two forms of behavioural adaptation, reversal learning and contingency degradation, in which stimulus/action-reward contingencies are altered. The results are interpreted within the psychological framework of the compulsivity construct, and their implications for the pathological behaviour of obsessive-compulsive-disorder (OCD) are considered. The orbitofrontal cortex (OFC) and striatum are key brain structures involved in reversal learning, as are the neurotransmitters serotonin (5-hydroxytryptamine, 5-HT) and dopamine (DA) within those respective regions. However, there has been little empirical evidence of how these two structures and neurochemical systems interact, especially in the functional context of reversal learning. In Chapter Three, the impact of experimentally-induced reductions of 5-HT in the anterior OFC on monoamine levels in subcortical structures such as the striatum and amygdala was determined, DA being found to be significantly up-regulated in the amygdala. Functionally, 5-HT depletion of the OFC has previously been shown to induce deficits in reversal learning. To determine the possible causal significance of amygdala dopamine up-regulation for said reversal learning deficit, the effects of blocking the upregulation with the infusion of intra amygdala DA receptor antagonists following bilateral OFC 5-HT depletion were investigated in a reversal learning paradigm. In Chapter Four, the differential roles of regions of striatum were examined in visual reversal learning. Two recent investigations in non-human primates highlighted the role of the striatum in reversal learning,but pinpointed the critical region to be either the ventromedial caudate or the putamen. Marmosets were trained on a serial reversal task that allowed multiple acute neural manipulations, and the ventromedial caudate and putamen were then reversibly inactivated using the GABAA agonist muscimol. Results indicated dose-related impairments specifically in reversal learning within the putamen, with sparing of discrimination retention. By contrast, similar reversible inactivation of the caudate nucleus produced marked deficits in visual discrimination performance (retention). In Chapter Five, the neural basis of action-outcome contingency knowledge was investigated by inactivating distinct regions of the PFC, the perigenual ACC (pgACC; area 32) and the anterior OFC, and determining response sensitivity to the degradation of action-outcome contingencies. In previous work, excitotoxic lesions of either the pgACC or the OFC had been found to induce insensitivity to contingency degradation in marmosets. However, the design of that experiment did not allow specification of whether stimulus- or action-outcome associations were disrupted, and a precise neural locus could not be determined for the behavioural effects as the OFC lesions included parts of the lateral and medial OFC. I therefore developed a novel contingency degradation paradigm that distinguished between stimulus- and action-outcome associations to enable the study of acute pharmacological manipulations in both brain regions. The pgACC and OFC were reversibly inactivated using GABAA-GABAB agonists (muscimol-baclofen). Whereas the pgACC inactivation produced selective deficits in sensitivity to action-outcome contingency degradation, OFC inactivation reduced the suppressive effect of noncontingent reward on responding more generally but left intact sensitivity to degradation of the contingencies. These results are discussed in terms of different theories of the functions of the pgACC and OFC. In the final discussion the findings on the neural substrates of reversal learning and contingency degradation are drawn together in terms of their significance for theories of PFC involvement in cognitive control, and for the understanding of OCD and other neuropsychiatric disorders.