Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / Los antimicrobianos son la principal herramienta en el tratamiento de enfermedades causadas por bacterias en humanos y animales. El excesivo y mal uso de estos compuestos ha causado la aparición de resistencia bacteriana y uno de los problemas de interés público es el posible traspaso de estas resistencias de los animales al hombre. Es así que a nivel mundial, los Programas de Armonización y Globalización Internacional han hecho énfasis en el uso racional de los antimicrobianos en animales de producción, a través de programas de monitoreo de resistencia bacteriana. El método de determinación bacteriana más utilizado y aceptado mundialmente es el método de dilución en placa, que da valores de MIC (Concentración Mínima Inhibitoria) para un determinado antimicrobiano. Otro método que está siendo utilizado estos años en medicina humana, por su rapidez y sencillez es el de las Tiras Reactivas de MIC (E-test). En este trabajo se evaluó la utilización de este método como base para un plan de monitoreo de resistencia bacteriana en Medicina Veterinaria. Siendo las mastitis una de las principales causas de uso de antimicrobianos en el ganado bovino, se evaluó la susceptibilidad a 178 cepas aisladas de mastitis clínica de bovinos de leche por métodos de dilución en placa y E-test. Se encontró concordancia de resistencia. No se obtuvieron diferencias significativas entre los valores de MIC obtenidos por ambos métodos con cefoperazona, ampicilina, amoxicilina, bencilpenicilina y enrofloxacino, excepto con gentamicina. Estos resultados indicarían que E-test podría ser utilizado como método de screening por ser simple y rápido, pero faltan estudios con algunos antimicrobianos utilizados en Medicina Veterinaria. Por otro lado, una de las resistencias mas conocidas es a los compuestos -lactámicos. Es así, que en este trabajo también se estudió la presencia de vi enzimas -lactamasas en cepas de E. coli y estafilococos. Además, se estudió la presencia de -lactamasas de espectro expandido (BLEE) y la resistencia a meticilina, en ambos tipos de cepas respectivamente, ya que son causas de fallas terapéuticas comunes en humanos y posibles mecanismos de resistencia a las bacterias de mastitis bovina evaluadas. Se encontró la presencia de -lactamasas en el 100% de las cepas de E. coli y no se detectaron BLEE. En las cepas de estafilococos se detectó un 34% de presencia de -lactamasas: 1/26 en Staphylococcus aureus, 6/26 en Staphylococcus coagulasa negativos y 4/10 en Staphylococcus spp., fueron resistentes a meticilina. Estos resultados sugerirían que la presencia de -lactamasas y mecanismos de resistencia más complejos, como lo son a meticilina, podrían dar cuenta de las resistencias observadas a diferentes antimicrobianos del tipo -lactámicos en aislados de mastitis bovina.

Mastitis represents a major issue within the dairy industry responsible for economic loss via decreased animal productivity and associated veterinary costs. Currently, there is a push to identify a phenotypic innate immune response that will yield dairy cows with an enhanced resistance to mastitis. Bovine dermal fibroblasts were used as a cell model to measure the response of individuals to Gram-negative bacterial stimuli through the TLR4 signaling pathway. Fibroblast cultures were isolated from 15 dairy heifers at 5, 11, and 16 months of age in order to determine the variability in responsiveness to LPS as well as to monitor the development of the innate immune response in calves. These individuals displayed a large range in response to LPS as measured by IL-8 production. In addition, response within individuals increased dramatically with age. To determine the cause behind this, DNA methylation was investigated as a potential player in the variation in response described both within an individual over time as well as across individuals. Fibroblast exposure to 5-aza-2'-deoxycytidine, a DNA demethylating agent, increased the cellular response to LPS, but more so in cultures that had previously displayed low responding phenotypes. This suggested that DNA methylation acted as an inhibitor of the innate immune response, and may be responsible for some degree of the variation seen in the LPS response. To determine the effect of epigenetic factors on this response, microarray analysis was conducted on RNA isolated from cells either having been epigenetically modified (DNA demethylation and histone hyperacetylation) or without undergoing any epigenetic treatment. This analysis identified 1,758 genes with altered expression due to epigenetic modification. To focus on DNA methylation's role, methylated CpG island recovery assay (MIRA-Seq) libraries were created from fibroblasts to investigate differential methylation from a group of the same individuals sampled at 5 and 16 months of age. In addition, transcriptomic data were generated by RNA-Seq from fibroblasts collected from the young and older samples and exposed to LPS for 0, 2, and 8 hours to characterize age-associated changes in the innate immune response. Cultures from older animals were much more responsive to LPS as indicated by greater expression of IL-8, IL-6, TNF-α, and CCL20 at various times in response to LPS. TLR4 and CD14 were more highly expressed in older cultures, suggesting these fibroblasts are more able to detect the presence of LPS. Analysis of the bovine fibroblast methylome revealed methylation with remarkable stability except for 20 regions along the genome undergoing major shifts due to age. Similar data were collected from fibroblasts isolated from different individuals displaying either a low or high responding phenotype resulting in 843 regions with differential methylation between groups. This suggests that DNA methylation may be playing a role in both the age-dependent and between animal differential responses to LPS, and also gives the first in depth look at the bovine fibroblast methylome and its stability over time.

Memoria para optar al Titulo Profesional de Médico Veterinario / La mastitis bovina, en cualquiera de sus formas de presentación, genera importantes pérdidas en los planteles productores de leche. La mastitis clínica ocasionada por bacterias coliformes se hace más importante principalmente en las vacas que se encuentran en sistemas productivos en confinamiento. Una de las vías por la cual se ha logrado aumentar la protección de las vacas frente a este tipo de mastitis, es su inmunización mediante vacunación. La vacuna contra mastitis por coliformes más utilizada y estudiada es la vacuna J5, consistente en una bacterina de Eschericha coli de cepa mutante J5. El laboratorio fabricante recomienda que las vacas reciban tres dosis, que se aplican al momento del secado, tres semanas antes del parto y alrededor de una semana después del parto. Se ha propuesto que la aplicación de dosis adicionales a las tres recomendadas, mejoraría la eficacia de la vacuna y aumentaría la protección frente a la mastitis por coliformes. Consecuentemente, el objetivo de este estudio fue evaluar el efecto de un protocolo alternativo de aplicación de la vacuna J5, donde se agrega una dosis adicional de la vacuna al protocolo tradicional, sobre la salud mamaria, la producción de leche y la fertilidad de vacas lecheras, comparándolo con el protocolo tradicional de vacunación. Para la realización del estudio se utilizaron 1.062 lactancias de 914 vacas de alta producción, pertenecientes a un plantel lechero en que los animales permanecían en confinamiento permanente, en galpones con cubículos individuales con cama de arena. En 588 casos las vacas recibieron el protocolo tradicional de aplicación de la vacuna J5 (grupo control), mientras que en 474 lactancias, las vacas recibieron una dosis adicional de la vacuna entre el día 28 y 35 post parto (grupo tratado). Los animales se asignaron aleatoriamente a los grupos de estudio. Para cada caso de mastitis clínica se registró su duración, grado de severidad (leve, moderada o severa) y agente causal. Se registraron además los recuentos mensuales de células somáticas en leche para cada vaca y la producción de leche diaria de cada vaca. Se registraron las eliminaciones y muertes de vacas hasta el día 200 post parto y sus causas y, finalmente, se calculó la tasa de concepción a la primera inseminación y los días desde el parto a la preñez para ambos grupos de vacas. La severidad de los casos de mastitis clínica y la tasa de concepción a la primera inseminación fueron comparadas mediante un análisis de regresión logística binaria; la incidencia de mastitis clínica, la proporción de vacas muertas o eliminadas por mastitis y la proporción de los tipos de agentes aislados de los casos de mastitis clínica fueron analizados a través de la prueba de χ2. La producción de leche y recuento de células somáticas fueron analizados utilizando un análisis de varianza, mediante el método GLM. Se realizó un análisis de sobrevivencia para la variable días desde el parto a la preñez, donde las curvas de sobrevida generadas fueron comparadas mediante el método del log-rank. No se observaron diferencias estadísticamente significativas en la incidencia de mastitis clínica, duración de los casos de mastitis clínica, proporción de agentes aislados de los casos de mastitis clínica, proporción de vacas muertas o eliminadas como consecuencia de mastitis, recuento de células somáticas, producción de leche acumulada a los 100 días de lactancia, días a la preñez y tasa de concepción a la primera inseminación, entre ambos grupos experimentales. Sin embargo, en el grupo de vacas tratadas se observó un menor riesgo de que los casos de mastitis clínica, presentados entre el momento de la aplicación de la dosis adicional de la vacuna y el día 171 de lactancia, fueran severos, en comparación al grupo control (OR: 0,61; IC 95%: 0,38 - 0,96; p = 0,03). Al realizar el análisis según el número de lactancia de las vacas, se determinó que el efecto depresor en la severidad de los casos de mastitis, fue estadísticamente significativo solamente en las vacas de tres o más lactancias (OR: 0,5; IC 95%: 0,33 - 0,96; p = 0,04). El efecto positivo que la dosis adicional de la vacuna produjo sobre la salud mamaria, no tuvo una magnitud suficiente para mejorar la mayor parte de los parámetros productivos y sanitarios estudiados. El principal efecto beneficioso fue la disminución de la severidad de los casos clínicos de mastitis en las vacas de más de dos lactancias

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / La mastitis bovina es uno de los problemas de mayor impacto económico en la industria láctea en Chile y alrededor del mundo. Esta enfermedad puede ser producida por traumas, hongos, algas, bacterias, entre otras causas. Dentro de los agentes bacterianos, E. coli es la de mayor importancia en granjas chilenas con animales en confinamiento, produciendo una mastitis de curso corto y signos visibles. Por esta razón en la presente memoria se evaluó la presencia de genes codificantes a factores de virulencia, asociados a la etapa de adhesión, descrita como de gran importancia en la patogenia de E.coli. Muestras provenientes de vacas cursando mastitis bovina clínica y subclínica de las zonas central (Región Metropolitana) y sur (Región de Los Lagos) fueron analizadas, a través de técnicas microbiológicas como el cultivo bacteriano y baterías bioquímicas en conjunto con técnicas basadas en el DNA como la Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR). De los 150 animales muestreados, solo 24 de estos mostraron ser positivos a E. coli. Asimismo tras evaluar 5 genes asociados a adhesinas, solo dos de estos se encontraron presentes en cuatro muestras. En todos los casos se encontró solo un gen por muestra. Los resultados concuerdan con otros estudios realizados en otros países, y sugieren que no existe una relación entre determinados factores de virulencia y, la presentación y severidad de la enfermedad / Proyecto FIA PYT 0055-2012

A presença de resíduos de antimicrobianos no leite representa um problema de saúde pública, podendo causar reações alérgicas e a seleção de bactérias resistentes aos antimicrobianos. É também um problema econômico interferindo nas culturas lácteas utilizadas na fabricação de derivados. A mastite é a causa mais freqüente para o tratamento de bovinos leiteiros com antimicrobianos. Foram objetivos deste trabalho estudar a influência do processo inflamatório no tempo de eliminação de diferentes antimicrobianos, administrados por via sistêmica ou intramamária em vacas em lactação e avaliar a presença de resíduos detectáveis em tanques resfriadores de propriedades leiteiras, correlacionando com os níveis de mastite nos rebanhos. Foi utilizado teste microbiológico comercial (Delvotest) para a avaliação da corrência de resíduos de antimicrobianos em 60 amostras de leite de tanques resfriadores de propriedades leiteiras e individualmente de 135 vacas em lactação com e sem processo inflamatório na glândula mamária. Foi verificada correlação entre a ocorrência de resíduo de antimicrobiano no tanque resfriador e o aumento da freqüência de mastite clínica (r= 1,0; teste de Spearman).O aumento do período de carência, no leite de glândulas com processo inflamatório, foi observado tanto nos animais tratados por via sistêmica quanto naqueles tratados por via intramamária, ultrapassando o período estipulado pelo fabricante do medicamento. Tal fato foi observado em relação a todos os grupos tratados com diferentes antimicrobianos (betalactâmicos, aminoglicosídeos, tetraciclinas e sulfa) variando de 11 a 60 % das amostras analisadas. Após 72 horas da aplicação de medicamento por via sitêmica, houve diferença significante (p < 0,05, Fisher) entre as amostras de animais com mastite e as de animais com ausência de processo inflamatório, indicando uma maior persistência de resíduo nas amostras de animais com mastite. Na avaliação da influência de inibidores naturais observou-se que 33% das amostras de quartos com mastite clínica e 18% das amostras de quartos com mastite subclínica apresentaram resultados positivos, sendo que na ausência de processo inflamatório todas as amostras apresentaram resultados negativos. A diferença de positividade foi estatisticamente significante, quando foram comparadas as amostras de quartos mamários com mastite clínica com as amostras de quartos mamários com ausência de processo inflamatório (p < 0,05, Fisher). Em síntese concluiu-se que houve uma correlação entre o nível de ocorrência de mastite clínica e a presença de resíduo no leite dos tanques resfriadores de propriedades leiteiras e que glândulas mamárias com processo inflamatório apresentaram maior período de eliminação de resíduos de antimicrobiano pelo leite, em relação às glândulas sem processo inflamatório, muitas vezes ultrapassando o período estipulado pelos fabricantes de medicamentos. Observou-se também que as amostras de leite de animais não tratados, analisadas sem aquecimento prévio, apresentaram positividade demonstrando a influência dos inibidores naturais, produzidos em decorrência do processo inflamatório, nos resultados dos testes microbiológicos, indicando a necessidade de aquecimento das amostras antes da realização dos testes microbiológicos para a detecção de resíduos, para evitar a ocorrência de resultados falso positivos. Como conclusão geral, a análise dos resultados obtidos no presente estudo demonstrou que a mastite interferiu na ocorrência de antimicrobianos no leite. / The presence of antimicrobial residues im milk is a public health concern, because they may cause allergic reactions and may lead to the development of resistance to antimicrobial agents by bacterial strains. It is also an economic problem because it interferes with starter cultures used in dairy products. Mastitis, the inflammatory process of the mammary gla nd, is the main reason to treat dairy cows with antimicrobial agents. The purpose of this study was to verify the influence of mastitis on the withdrawal period of several intramammary and parenteral antimicrobial agents used in lactating cows, as well as to evaluate the presence of detectable antimicrobial residues in bulk tank milk, in relation to the mastitis rates among the studied dairy farms. A total of 60 bulk tank samples of dairy farms and 135 individual samples of healthy and mastitic dairy cows were screened to verify the occurrence of antimicrobial residues with a microbiologic test (Delvotest®). A correlation was detected between antimicrobial residues in bulk tank and high clinical mastitis rates (r= 1.0; Spearman\'s test). A higher withdrawal period, exceeding that determined by the manufacturer, was observed in the milk of mammary glands presenting inflammatory processes, both in animals treated by the parenteral route, and those treated by the intramammary route. This observation ranged from 11 to 60% of the analyzed samples and was verified in all groups treated with different antimicrobial agents (betalactam, aminoglycosides, tetracycline and sulfas). Statistically significant difference was detected (p<0.05, Fisher\'s test) at seventy two hours after the parenteral treatment in samples from animals presenting inflammatory processes, in relation to samples from animals that did not present mastitis. That is, there was a higher withdrawal period in the samples from animals presenting mastitis. In the evaluation of the influence of inflammatory reaction natural inhibitors on Delvotest®, it was verified that 33% of the samples from clinical mastitis quarters and 18% from subclinical mastitis quarters were positive, and that quarter samples without inflammatory processes were negative. These differences were statistically significant (p<0.05, Fisher\'s test). Among the main onclusions, it should be pointed out that there was a correlation between high clinical mastitis rates in the dairy herd and antimicrobial residues in bulk tank milk. Another important result was that mammary glands presenting inflammatory processes exhibited higher withdrawal periods when compared with mammary glands that did not present inflammatory processes, and that sometimes this withdrawal period exceeded the period recommended by the manufacturer. It was also observed that milk samples from untreated animals, when tested without preliminary heating at 80ºC, were positive, due to the occurrence of natural inhibitors produced by the inflammatory process, showing their interference on microbiologic tests. Therefore, it was demonstrated that previous heating is helpful to avoid false positive results when microbiologic tests are used to detect antimicrobial agents residues in milk samples. As an overall conclusion, it was well demonstrated that mastitis interferes in antimicrobial residues in milk.

Os processos inflamatórios na glândula mamária são especialmente freqüentes e importantes em bovinos leiteiros, sendo responsáveis por grandes prejuízos à pecuária leiteira. A mastite infecciosa é a mais importante doença sob o ponto de vista econômico e de saúde pública. A contagem de unidades formadoras de colônias por mililitro (UFC/mL) de leite proveniente diretamente de uma glândula mamária permitiria avaliar o comportamento de cada um dos agentes etiológicos da mastite infecciosa. A comparação desta informação com a contagem de células somáticas (CCS/mL) na amostra de leite permitiria uma avaliação mais acurada do processo infeccioso e inflamatório na glândula mamária. O presente trabalho teve como objetivos: avaliar o \"status\" microbiológico de amostras de leite de vacas em lactação que apresentaram mastite e comparar a quantidade de UFC/mL de colônias dos diferentes microrganismos com as respectivas CCS/mL, levando em consideração a diferenciação de células polimorfonucleares (PMN/mL) e mononucleares (MN/mL) nas amostras. Quinhentas e seis amostras de 15 propriedades de exploração leiteira do Estado de São Paulo, Brasil, foram submetidas aos testes de Tamis e California Mastitis Test (CMT), e realizados os exames microbiológicos, contagem de UFC/mL e CCS/mL. Destas, 112 não apresentaram crescimento de microrganismos, e das amostras com crescimento foram isolados: 94 Corynebacterium spp., 104 Staphylococcus spp., 73 Streptococcus spp., 36 Prototheca zopfii, 08 Candida spp., 02 Nocardia spp. e 77 associações entre os microrganismos. Houve correlação entre o número de UFC/mL com a CCS/mL, assim como entre PMN/mL e entre MN/mL. Concluiu-se que existe um aumento da CCS/mL, PMN/mL e MN/mL no leite quando há um aumento das contagens de UFC/mL. As quantidades de UFC/mL no leite com isolamento de Streptococcus spp. foram maiores estatisticamente (P < 0,05) que as quantidades de UFC/mL com isolamento de Corynebacterium spp. e Staphylococcus spp. Concluiu-se também que, em havendo necessidade de tratamento de mastite clínica e subclínica no rebanho devido às altas contagens de UFC/mL, deve-se tratar inicialmente os quartos nos quais foram isolados Streptococcus spp. e deixar para uma segunda etapa ou para o processo de secagem o tratamento das mastites associadas à Staphylococcus coagulase-positivo, Staphylococcus coagulase-negativo e Corynebacterium spp. nessa mesma ordem. / Mastitis is a complex pathologic condition which may have different etiology and consequences. Mastitis usually starts with the penetration of microorganisms through the teat canal towards mammary parenchyma and secretory cells, and an inflammatory response occurs due to the products of the microbial growth. The aim of this work was to evaluate the microbial status of milk samples collected from lactating cows with mastitis and comparing the colonies forming units (CFU)/mL and the somatic cell counts (SCC)/mL, taking into consideration the differentiation of polymorphonuclear (PMN/mL) and mononuclear (MN/mL) cells. From primiparous and pluriparous dairy cows, 506 milk samples were collected from 15 dairy farms located in the State of São Paulo, Southeastern Brazil. Samples were submitted to strip cup test and California Mastitis Test (CMT) and evaluated for CFU and SCC procedures. For microbial examinations, 112 (22.13%) samples were found negative and from the other 394, the following microorganisms were isolated: 94 (18.58%) Corynebacterium spp., 104 (20.55%) Staphylococcus spp., 73 (14.42%) Streptococcus spp., 36 (7.11%) Prototheca zopfii, 8 (1.60%) Candida spp., 2 (0.39%) Nocardia spp., and 77 (15.21%) associations among distinct microorganisms. Significant correlations were found between the CFU/mL and SCC/mL, and also with the PMN and MN cell countings. With the increased CFU/mL countings, it was observed the increase in SCC, PMN, and MN countings. The CFU/mL counts in samples with Streptococcus spp were statistically higher (P < 0.05) than the ones positive for Staphylococcus spp. and Corynebacterium spp. In case of treatments of mastitis, target must be primarily oriented to treat the mammarial glands showing clinical or subclinical mastitis with Streptococcus spp. showing high CFU/mL, and at the second stage, in case of treatment or drying the cows, therapy must be directed against coagulase-positive Staphylococcus, coagulase-negative Staphylococcus and Corynebacterium spp.

Setenta e sete vacas distribuídas em três propriedades foram divididas em três grupos: G1 (sem suplementação vitamínica), G2 (suplementação com 1000 UI de vitamina E durante 30 dias antes do parto previsto e 30 dias após o parto), G3 (suplementação com 1000 UI de vitamina E de 30 a 15 dias antes do parto previsto e 3000 UI de 15 dias antes do parto a 30 dias após o parto). Todas as propriedades continham os três grupos, sendo que as vacas foram sorteadas para cada grupo de acordo com a ordem de parição e a data prevista para o parto, para que ficassem homogeneamente distribuídas. Na interrupção da lactação que antecedeu o experimento, os quartos mamários foram tratados com antibióticos específicos para o tratamento de vacas secas. Os animais foram alimentados com silagem de milho e concentrado, permanecendo confinados com acesso a piquetes de descanso. Foram efetuados os exames: tamis, CMT e microbiológico do leite de cada quarto mamário, logo após a fase colostral e uma vez por mês durante a lactação, para o diagnóstico de mastite. Foram colhidas amostras de soro de 20% dos animais e dos alimentos fornecidos para a análise de selênio. Os resultados obtidos mostraram que a ocorrência de mastite clínica foi maior (p<0,05) no grupo não suplementado do que nos grupos suplementados. Não foram verificadas diferenças estatísticas entre os três grupos quanto à ocorrência de mastite subclínica. Os principais microrganismos isolados foram Staphylococcus sp, Streptococcus sp, Corynebacterium sp. A ocorrência de infecções intramamárias foi maior (p<0,05) no grupo G3 do que nos grupos G2 e G1 e maior (p<0,05) no grupo G2 do que no grupo G1. Em relação à ocorrência de mastite nas fazendas, foi verificado maior (p<0,05) ocorrência da forma clínica no grupo G1 do que nos demais grupos apenas em uma delas e quanto às infecções intramamárias, o grupo G3 apresentou maior (p<0,05) ocorrência que o grupo G1 em todas as fazendas. Os resultados das análises sorológicas de selênio mostraram que as concentrações do elemento nos animais estavam adequadas. / Seventy seven dairy cows, kept in three herds were randomly allocated in three homogeneous groups: Group 1, control group (without vitamin E supplementation), Group 2 (supplementation of 1,000 UI of vitamin E during 60 days, thirty days prior and 30 days post-parturition) and Group 3 (supplementation of 1,000 UI of vitamin E from the thirtieth day to the fifteenth day before parturition, and, then, a supplementation of 3,000 UI from the fourteenth day before parturition until the thirtieth day after it). All the cows in the groups received a long-action intramammary antibiotic at the drying off. Animals were fed with corn silage and concentrate-mixture, and they were confined in a free stall system with grass paddock. Examinations were performed at the drying off, in the first week of lactation and once a month during lactation. Strip cup, CMT and the microbiological exams were used. Twenty percent of the animals of each group were randomly assigned for selenium analysis. The obtained results showed that clinical mastitis occurrence in Group 1 was significantly higher than in Groups 2 and 3. In relation to subclinical mastitis cases, no significant differences were detected among the groups. Microorganisms that were most frequently isolated were: Staphylococcus sp, Streptococcus sp, Corynebacterium sp. Results obtained for mammary gland infections showed a higher level of infections in supplemented groups compared to the control group. The occurrence of clinical mastitis in Group 1 was significantly higher than in Groups 2 and 3 only in one of the dairy herds. The occurrence of the intramammary infections was significantly higher in Group 3 than in Group 1 in all herds. The results obtained from selenium analysis demonstrated to be range of recommended levels.

O Brasil é o quinto maior produtor de leite do mundo, entretanto sua produtividade é considerada baixa. Um dos motivos desta baixa produtividade é a alta incidência da mastite no rebanho. A mastite é a reação inflamatória da glândula mamária, causada principalmente pela invasão e ação de espécies de micro-organismos patogênicos. O principal tratamento consiste no uso de antibióticos de aplicação intramamária. Entretanto, o uso constante de antibióticos apresenta problemas graves como o surgimento de cepas de bactérias resistentes e a presença de resíduos destes medicamentos no leite. Para reduzir esses problemas, formas alternativas de prevenção e tratamento da mastite têm sido estudadas, como o uso de preparações contendo espécies probióticas. Pesquisas recentes têm demonstrado o potencial de algumas destas espécies no tratamento e prevenção da mastite bovina tendo em vista sua atividade inibitória sobre os patógenos responsáveis por esta infecção. Desta forma, a proposta deste estudo foi desenvolver e avaliar a estabilidade de uma preparação probiótica na forma de emulsão de aplicação intramamária contendo 108 UFC/mL de um \"pool\" constituído de cinco cepas de Lactobacillus (L. acidophilus ATCC 4356, L. casei ATCC 7469, L. fermentum ATCC 9338, L. plantarum ATCC 8014 e L. paracasei Nestlé ST11). Para tanto, 12 formulações de emulsão base foram desenvolvidas e avaliadas em ensaios preliminares de estabilidade (centrifugação e estresse térmico), sendo a formulação contendo monestearato de glicerila, lanolina anidra, óleo mineral, Tween 80® e Spam 80® selecionada para formulação da preparação probiótica. Adicionalmente, selecionou-se como agente conservante sorbato de potássio visando aumentar a vida útil da preparação probiótica. A preparação, assim desenvolvida, foi submetida ao teste de estabilidade físico-químico por 90 dias a 50°C ± 2°C. Observou-se que o aspecto da preparação se manteve estável, mas com redução nos parâmetros pH, densidade e aumento na viscosidade. A manutenção da viabilidade dos Lactobacillus na preparação foi estudada em um ensaio de 120 dias, sendo avaliada a influência dos fatores: temperatura de estocagem, adição de sacarose e sorbato de potássio. Observou-se influência significativa da temperatura demonstrando a importância da refrigeração na manutenção na viabilidade dos Lactobacillus. Verificou-se também que, sob refrigeração, a adição de sacarose promoveu redução de 0,5 ciclo logarítmico em relação a população inicial de células viáveis. Observou-se redução do pH da preparação probiótica avaliada nestas condições. Estes resultados permitem concluir que a refrigeração da preparação é indispensável para a manutenção da viabilidade das bactérias probióticas. A adição de 2% de sacarose à preparação, mantida sob refrigeração, se mostrou eficiente na manutenção da população de células viáveis ao final de 120 dias de ensaio, contendo 108 UFC/g, característica desejável para um produto probiótico. / Brazil is the world\'s fifth largest milk producer, though its productivity has been considered low. One of the reasons for this low productivity is the high incidence of mastitis in the herd. Mastitis is the inflammation of the mammary gland, mainly caused by the invasion and action of pathogenic microorganisms. The treatment is accomplished through the use of intramammary application of antibiotics. However, the constant use of antibiotics has serious problems such as the emergence of resistant strains of bacteria and the presence of residues of these drugs in milk. To reduce these problems, alternative means of prevention and treatment of mastitis has been studied as the use of preparations containing probiotic species. Recent studies have demonstrated the potential of some of these species in the treatment and prevention of bovine mastitis due to their inhibitory activity on pathogen species responsible for the infection. Thus, the purpose of this study was to develop and evaluate the stability of probiotic preparation in the form of intramammary application emulsion containing 108 CFU/mL of five Lactobacillus strains (L. acidophilus ATCC 4356, L. casei ATCC 7469 L. fermentum ATCC 9338, ATCC 8014, L. plantarum and L. paracasei ST11 Nestle). Therefore, 12 basic emulsion formulations were developed and evaluated in preliminary tests for stability (thermal stress and centrifugation), and only one was selected. Additionally, potassium sorbate was selected as preservative in order to increase the shelf life of the preparation. The developed preparation was subjected to study the physicochemical stability for 90 days at 50 ° C ± 2 ° C. The results showed that the aspect of the preparation remained stable, but decreasing in pH and density and increasing in viscosity. The maintenance of the viability of the lactobacillus in the preparation was studied in a 120-day test, and flowing factors were considered: storage temperature, sucrose addition and the potassium sorbate addition. It was observed that there was significant differences in the temperature factor demonstrating the importance of cooling in maintaining the viability of Lactobacillus. It was also observed that sucrose decreased by 0,5 log cycle compared to initial population of viable cells in the refrigerated preparation. Regarding the pH, it was noted a decrease in the different formulations evaluated. These results show that the cooling of the preparation is indispensable for maintaining the viability of probiotic bacteria. The addition of 2% sucrose to the preparation proved efficient with a slower decrease in viability maintaining the population of viable cells at the end of the 120 days of the assay.

A mastite é o processo inflamatório da glândula mamária que constitui uma doença comum no setor pecuário leiteiro, evidenciado principalmente durante o período de lactação de vacas leiteiras e, cujos principais agentes etiológicos são o Staphylococcus aureus, Streptococcus sp. e espécies de coliformes. Os protocolos de combate à mastite preconizam o uso de antibióticos, o que pode trazer riscos à saúde dos animais e humana. Dependendo do agente patogênico, esta estratégia é considerada frequentemente ineficiente e de alto custo, o que leva pesquisadores a buscarem alternativas à antibioticoterapia, testando princípios ativos homeopáticos, fitoterápicos e micro-organismos probióticos, que apresentam potencial como alternativa promissora para a terapia quimioterápica. As formulações contendo bactérias probióticas podem representar uma alternativa de baixo custo para o combate à mastite, com a vantagem de não estimular a resistência entre os patógenos. Desta forma, este estudo baseou-se na avaliação in vitro do potencial antimicrobiano de cepas de Lactobacillus frente a agentes patógenos causadores de mastite, bem como na avaliação in vivo da inocuidade de formulações contendo probióticos em vacas em lactação. Para tanto, 6 cepas de Lactobacillus, na forma isolada e na forma de pool foram avaliadas quanto à capacidade inibitória sobre Streptococcus agalactiae (cepas 1 e 2) por diferentes técnicas de difusão em ágar e co-cultura em meio líquido. A inibição pela técnica de co-cultura foi avaliada mediante determinação de células viáveis das cepas patogênicas por reação em cadeia da polimerase quantitativa em tempo real (RT-qPCR). De acordo com os resultados observados no estudo de inibição in vitro, foram preparadas formulações probióticas utilizando dois veículos diferentes, sendo uma emulsão (Formulação A) e outra utilizando um veículo de um medicamento comercial (Formulação B) adicionadas de células de Lactobacillus na forma isolada e na forma de pool. Estas formulações foram avaliadas quanto à inocuidade em 17 vacas separadas em grupos sob regime de 1 ordenha/dia (A e B1) e 2 ordenhas/dia (B2), mediante a aplicação das formulações A e B contendo 109 ou 106 células/dose. Ao longo do cada tratamento, foram avaliados parâmetros fisiológicos como temperatura do úbere, presença de hiperemia, inchaço e manifestação de dor, contagem de células somáticas (CCS), California Mastitis Test (CMT), bem como condutividade elétrica e aspecto do leite e avaliação microbiológica. O estudo de inibição em co-cultura mostrou que as cepas de Lactobacillus avaliadas inibiram o crescimento das cepas patogênicas, em níveis superiores a 75% após 72 horas de ensaio. Após 24 horas, os maiores níveis de inibição sobre S. agalactiae cepa 1 foram exercidos pelas cepas L. acidophilus ATCC 4356, L. fermentum ATCC 9338, com índices de inibição de 99,79% e 99,91%, respectivamente. Nas mesmas condições a inibição de S. agalactiae cepa 2 por L. acidophilus ATCC 4356 e L. delbrueckii UFV H2B20 foi de 86,7% e 79,5%, respectivamente. Estes resultados indicam o potencial de inibição das cepas de Lactobacillus estudadas sobre S. agalactiae causadora de mastite. Estudos de inocuidade demonstraram que as formulações probióticas (A e B) induziram reação inflamatória no úbere dos animais, confirmado pelo aumento significativo da condutividade elétrica do leite (CEL), CCS (p < 0,05), bem como do escore de CMT. As formulações testadas no presente estudo não se mostraram adequadas ao emprego terapêutico na cura da mastite, uma vez que no teste de inocuidade provocaram processos inflamatórios nas glândulas mamárias dos animais testados. / Bovine mastitis is a common disease in dairy farms, usually observed during lactation period in dairy cattle, whose main etiological agents are Staphylococcus aureus, Streptococcus sp. and coliform species. Current protocols of mastitis therapy include the use of antibiotics, which may represent serious risks for both animal and human health. Depending on the pathogen specie, this strategy is often considered ineffective and highly expensive, what stimulates scientists to search for alternative treatments, including homeopathic or phytotherapic drugs or probiotic microorganisms, which may be a good alternative to chemotherapeutic drugs. Formulations containing probiotic bacteria may represent a low-cost alternative for mastitis treatment. The present study aimed to assess in vitro ability of Lactobacillus strains to inhibit mastitis pathogens growth, as well as in vivo assessment of the safety of formulations containing probiotics in cows with predisposition or affected by mastitis. Thus, six Lactobacillus strains were evaluated on their inhibitory ability over Streptococcus agalactiae (strains 1 and 2) by techniques of agar diffusion and co-culture in liquid medium. The effectiveness of the co-culture was evaluated by enumerating viable pathogen cells through quantitative polymerase chain reaction (qPCR). According to the results of in vitro study, two formulations were prepared based on a probiotic emulsion (formula A) and a commercial matrix (formula B) containing Lactobacillus cells (isolated or pool). Safety tests for the formulations were performed in 17 cows, which were separated into two groups under 1 milking/day (A and B1) and another group submitted to 2 milkings/day (B2), through the application of preparation A or preparation B containing 109 or 106 cells/dose. In each treatment, every cow was assessed on physiological parameters including temperature, presence of hyperemia, swelling and pain, somatic cell count (SCC), electrical conductivity and aspect of milk (color and clots/lumps formation) and microbiological evaluation. The results of the inhibition studies in co-culture showed that all Lactobacillus strains inhibited the growth of pathogenic strains, in at least 75% after 72 h of test. The highest levels of inhibition of S. agalactiae strain 1 were performed by strains L. acidophilus ATCC 4356 and L. fermentum ATCC 9338, at level of 99.79% and 96.70% after 24h, respectively. For the same period, the inhibition of S. agalactiae strain 2 by L. acidophilus ATCC 4356 and L delbrueckii UFV H2B20 was 86.7 % and 79.5%, respectively. These results showed the potential of Lactobacillus strains studied concerning to the inhibition of mastitis caused by Streptococcus agalactiae. Safety studies showed that both formulations evaluated induced inflammatory response in the udder of the animals, what was confirmed by significant raise on electric conductivity and SCC (p < 0,05) and CMT scores on milk. All formulations were considered inappropriate to be used in mastitis therapeutics, once they failed at safety tests, inducing mastitis on tested animals.

Orientador: Márcio Garcia Ribeiro / Banca: Antônio Carlos Paes / Banca: Helio Langoni / Banca: Geraldo de Nardi Junior / Banca: Rogério Giuffrida / Resumo: O presente estudo investigou a eficácia do ceftiofur intramamário no tratamento estendido com dez aplicações, a cada 12 horas, na mastite subclínica por estafilococos em primíparas bovinas. Foram utilizados 60 animais da raça holandesa, divididos em quadro grupos: G1 = Grupo negativo ou sem infecção estafilocócica, CMT negativo e CCS < 200.000 células/mL; G2 = Grupo com infecção estafilocócica não tratado, CMT positivo (2+ ou 3+) e CSS > 200.000 células/mL; G3 = Grupo com infecção tratado no início da lactação (entre 15 e 100 dias de lactação), CMT positivo (2+ ou 3+) e CCS > 200.000 células/mL e G4 = Grupo tratado final da lactação (entre 101 e 200 dias de lactação), CMT positivo (2+ ou 3+) e CCS > 200.000 células/mL. As amostras de leite foram coletadas em cinco momentos: M0 ou dia zero (diagnóstico da mastite subclínica), M1 = 7 dias após o diagnóstico da mastite subclínica e início da terapia estendida, M2 = 2 dias após o término do tratamento estendido (dia 14 após o diagnóstico da mastite subclínica), M3 = 7 dias após M2 (dia 21 após o diagnóstico da mastite ou 9 dias após o final do tratamento), M4 = 7 dias após M3 (dia 28 após o diagnóstico da mastite ou 16 dias após o final do tratamento). Nos grupos tratados com ceftiofur intramamário, foi evidenciada a cura microbiológica com redução na CCS em 73,34% no G3 e 46,66% no G4. Assim, nos grupos tratados (G3 + G4) e não tratado (G2), as taxas de cura foram, respectivamente, 60,00% e 26,66% (p<0,05). Foram isoladas 45 linhagens de Staphylococcus spp., das quais foram identificados principalmente S. aureus (51,12%), S. intermedius (40,0%) e S. epidermidis (8,88%). O perfil de sensibilidade microbiana "in vitro" dos isolados apresentou maiores índices de sensibilidade para oxacilina (80,00%), ceftiofur (77,78%) e cefalexina (77,78%), seguidos do ciprofloxacino (66,66%) e gentamicina (60,00%). Em contraste... / Abstract: This study investigated the efficacy of extended ceftiofur intramammary therapy using 10 applications by five days in primiparous heifers infected by staphylococcal subclinical mastitis. Sixty Holstein cows were divided in four groups: G1 = negative group or without staphylococcal infection, CMT-negative and SCC<200.000 cells/mL; G2 = untreated group with staphylococcal infection, CMT-positive and SCC>200.000 cells/mL; G3 = treated early lactation group (15-100 days of lactation) with staphylococcal infection, CMT-positive and SCC>200.000 cells/mL, G4 = treated late of lactation group (101-200 days of lactation) with staphylococcal infection, CMT-positive and SCC>200.000 cells/mL. The milk samples were collected at five moments: M0 or day zero (diagnosis of subclinical mastitis), M1 = 7 days after diagnosis of subclinical mastitis and early extended therapy, M2 = 2 days after the end of the extended treatment (day 14 after the diagnosis of subclinical mastitis), M3 = 21 days after diagnosis of mastitis (9 days after the end of treatment), M4 = 28 days after diagnosis of mastitis (16 days after the end of treatment). In the groups treated with intramammary ceftiofur, microbiological cure was observed with reduction in SCC in 73.34% and 46.66% of animals for G3 and G4, respectively. Thus, in the treated (G3 + G4) and untreated (G2) groups, microbiological cure rates were 60.00% and 26.66% (p<0.05), respectively. Forty-five Staphylococcus spp. strains were isolated. From these, S. aureus (51.12%), S. intermedius (40.0%), and S. epidermidis (8.88%) were the most common species. In vitro antimicrobial susceptibility profile of isolates showed that the most effective drugs were oxacillin (80.0%), ceftiofur (77.78%), and cephalexin (77.78%), followed by ceftriaxone (69.0%), ciprofloxacin (66.66%) and gentamicin (60,0%). In contrast, high-resistance rates of isolates were founded to cloxacillin (24.44%), penicillin... / Doutor