Matrix Extracellular Phosphoglycoprotein (MEPE) is a member of a family of proteins called small integrin-binding ligand, N-linked glycoproteins (SIBLINGs) which play key roles in biomineralisation. Altered MEPE expression is associated with several phosphate and bone-mineral metabolic disorders such as oncogenic osteomalacia and hypophosphatemic rickets. Despite this, it remains undetermined what impact MEPE has on the growth plate; the cartilage anlagen from which endochondral ossification, the process responsible for linear bone growth, occurs. The work of this thesis has characterised the ATDC5 cell line and the metatarsal organ culture as useful in vitro models of endochondral ossification. These will prove vital in the pursuit of underpinning the molecular mechanisms involved in endochondral bone growth. These models form the basis of the further studies in this thesis examining the role of MEPE within this highly orchestrated process. Before such role can be defined, this thesis details the spatial and temporal localisation patterns of MEPE in 10-day- and 4-week-old murine growth plates. More specifically, MEPE protein and mRNA were preferentially expressed by the hypertrophic chondrocytes as shown by immunohistochemistry and in situ hybridisation respectively. Microdissection of the murine growth plate confirmed this. Localisation of the cleavage product of MEPE, a 2.2kDa acidic serine- and aspirate-rich motif (ASARM) peptide, followed a similar pattern of expression. The localisation of MEPE to sites of mineralisation serves to strengthen its potential role in chondrocyte matrix mineralisation. This thesis identified this role in both mineralising ATDC5 cells and the metatarsal organ culture. The ASARM peptide was found to be the functional component of MEPE and this function was dependent upon its post-translational phosphorylation. Phosphorylated (p)ASARM peptides significantly inhibited chondrocyte matrix mineralisation without altering the proliferation or differentiation of the chondrocyte cells, or their ability to produce an extracellular matrix. mRNA analysis by qPCR indicted a feedback system by which the pASARM peptide functions to allow the release of further ASARM peptides. Moreover, the pASARM peptide inhibited mRNA expression of markers of vascular angiogenesis highlighting a novel mechanism by which they may inhibit chondrocyte matrix mineralisation. This thesis also determines the regulatory cross-talk between the chondrocytes of the murine growth plate, with the most abundant bone cell type, the osteocyte. This cross-talk inhibits chondrocyte matrix mineralisation and is attributed to sclerostin, an osteocyte-specific secretory protein. Furthermore, it is shown that sclerostin acts through the MEPE-ASARM axis to regulate chondrocyte matrix mineralisation and thus endochondral ossification. The work described herein has characterised and validated in vitro models of growth plate chondrocyte matrix mineralisation and has used these to identify the role of MEPE within chondrocyte matrix mineralisation.

Orientador: Sergio R. Peres Line / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Odontologia de Piracicaba / Made available in DSpace on 2018-07-21T06:53:38Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Zaia_AlexandreAugusto_D.pdf: 2456850 bytes, checksum: d1b3ef837bc68e43f27ecb9248a2d266 (MD5) Previous issue date: 1996 / Resumo: Atrofia obstrutiva de glândulas salivares é uma alteração comum que pode ser causada pela presença de cálculos, infecções ou processos neoplásicos. No presente estudo utilizamos microscopia eletrônica de transmissão e métodos bioquímicos para estudar alterações que ocorrem na matriz extracelular durante atrofia experimental de glândulas submandibulares de ratos. Estudos imunohistoquímicos da laminina e do colágeno IV mostraram distribuição irregular dessas proteínas ao redor das estruturas ductais e acinares atróficas. Análise em "Western blot" mostrou que glândulas submandibulares de ratos expressam laminina contendo apenas cadeias S, enquanto a cadeia A é presente em pequena quantidade. Isso foi observado tanto em glândulas normais como atróficas. Investigação da expressão da colagenase fibroblástica (MMP-1) por técnica zimográfica mostrou altos níveis desta enzima após 5 dias de atrofia. Com a evolução da atrofia, a atividade gelatinolítica regrediu gradativamente até 30 dias de atrofia. Microscopia eletrônica mostrou extensivas alterações morfológicas nas células glandulares. Células mioepiteliais de glândulas atróficas mostraram áreas com espessamento da membrana basal. A atrofia experimental de glândulas salivares pode ser usada como modelo in vivo para estudar eventos moleculares que ocorrem durante remodelação da matriz extracelular / Abstract: Obstructive atrophy of salivary glands is a common disease. It may occur by ductal obstruction caused by calculus, infection or neoplastic processes. In the present work we have used electron microscopy and biochemical methods to study the changes that occur in the expression laminin, type IV collagen and metaloproteinases during the experimental atrophy of the submandibular gland in rats. Immunohistochemical studies of laminin and type IV collagen showed an irregular distribution of there proteins around atrophies ducts and acini. The composition of laminin chains was not altered during glandular atrophy. Western blot analysis showed that rat submandibular gland laminin contain B chains, while A chain seems to be present only in small amounts. Investigation of the expression of fibroblast collagenase (MMP1), by zimographic analysis showed. high levels of this enzyme after 5, days of ligation. Gelatinolytic activity decrease progressively until 30 days of atrophy. Electron microscopy showed extensive morphologic changes in glandular cells. Myoepithelial cells showed "wrinkling" of outer plasma membrane leading to a thickening of the associated basement membrane. We conclude that the atrophy of salivary gland is an useful in vivo model to study the molecular events that take part in the remodeling of the extracellular matrix / Doutorado / Biologia e Patologia Buco-Dental / Doutor em Odontologia

Diss. (sammanfattning) Stockholm : Karol. inst., 2004. / Härtill 4 uppsatser.

Diss. (sammanfattning) Stockholm : Karolinska institutet, 2005. / Härtill 4 uppsatser.

Orientadores: Paulo Pinto Joazeiro, Cláudio Chrysostomo Werneck / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-18T04:27:14Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Consonni_SilvioRoberto_M.pdf: 3398352 bytes, checksum: 7a1238aba907982b903dec23fbc0470d (MD5) Previous issue date: 2011 / Resumo: A organização das fibras elásticas envolve a síntese e a deposição de moléculas em uma sequência altamente regulada para assegurar as características elásticas nos estágios iniciais do desenvolvimento. Durante e prenhez, os tecidos pélvicos ricos em fibras elásticas se alteram para permitir um parto seguro e essa remodelação é essencial para o parto normal. A sínfise púbica de camundongos também remodela em um processo controlado por hormônios. Este fenômeno compreende a "transformação" da fibrocartilagem em um ligamento interpúbico (LIp) seguido por seu relaxamento antes do parto. Após o primeiro parto, o processo de retorno ocorre e assegura a homeostase dos tecidos pélvicos. Ainda, alterações no suporte dos órgãos pélvicos foram descritas em animais geneticamente modificados para proteínas envolvidas na elastogênese como a lysyl oxidase-like 1 (LOXL1), fibulina-3 e 5. Como ligamentos são as principais estruturas de suporte dos órgãos pélvicos, o objetivo deste estudo foi avaliar a elastogênse no desenvolvimento do LIp durante a prenhez de camundongos. Assim, camundongos selvagens C57Bl/06 e deficientes em fibrilina-1 virgens, prênhes e no pós-parto foram estudados usando microscopia de luz convencional, microscopia confocal a laser, microscopia eletrônica de transmissão, western blotting e real-time PCR. Ambos os animais selvagens e deficientes em fibrilina-1 apresentaram classicamente a separação dos ossos púbicos, a formação e relaxamento do LIp e a involução deste no pós-parto. Esses processos sugeriram um padrão no qual as células controlam a remodelação da matriz extracelular sob sinalização hormonal e molecular. A ultra-estrutura dos tecidos fibrocartilaginosos apresentou delgadas microfibrilas aleatoriamente distribuídas entre os fibrocondrócitos. Na formação do LIp, foram observadas fibras elásticas com conglomerados de material amorfo distribuídos entre as microfibrilas. O LIp mostrou fibras elásticas e todos os componentes teciduais alinhados na direção da abertura da articulação interpúbica antes do parto. O estudo imuno-histoquímico e de expressão gênica relativa quantitativa indicou que durante o desenvolvimento do LIp em camundongos selvagens, elastina/tropoelastina, fibrilina-1 e 2, LOXL1, fibulina-5 e TGF-? foram regulados espacial e temporalmente, e estas moléculas poderiam contribuir para a síntese de novas fibras elásticas que asseguram a elasticidade necessária para a cintura pélvica durante o preparo para o parto e também no fechamento da articulação no pós-parto. Entretanto, se comparados com o animal selvagem, a análise indicou alteração na expressão gênica relativa da tropoelastina, fibrilina-1, LOXL1, fibulina-5 e TGF-?, diferentemente da morfologia muito similar observada em camundongos selvagens. Neste estudo, o camundongo deficiente em fibrilina-1 não apresentou prolapso de órgãos pélvicos após o primeiro parto como o deficiente em LOXL1 (Liu et al., 2004), nem modificações morfológicas que poderiam ser relacionadas ao enfraquecimento dos tecidos pélvicos. No entanto, este é o primeiro estudo que relata disfunções pélvicas nos camundongos deficientes em fibrilina-1 multíparos, usados como matrizes reprodutivas. Em conclusão, a formação das fibras elásticas que ocorreu na sínfise púbica de camundongos durante a vida adulta possui características únicas de um modelo que pode ser usado para compreensão dos processos normais e patológicos, principalmente aqueles relacionados aos animais geneticamente modificados para proteínas envolvidas na elastogênese. Assim, este trabalho traz à luz as evidências das profundas modificações que a sínfise púbica de camundongos passa durante a prenhez com a síntese de novas fibras elásticas, o que pode contribuir na compreensão dos mecanismos biológicos para formação das fibras elásticas / Abstract: The organization of elastic fibers involves the synthesis and the deposition of molecules in a high regulated sequence to ensure the elastic characteristics in the early stages of development. During pregnancy, elastic fibers-enriched pelvic tissues change to allow safe delivery and this remodeling is essential to the vaginal delivery. The mouse pubic symphysis articulation also remodels in a controlled hormonal process. This phenomenon comprises the "transformation" of the fibrocartilage into an interpubic ligament (IpL) followed by its relaxation before parturition. After the first parturition, recovery process occurs to ensure the pelvic tissue homeostasis. Adding to that, pelvic organ support impairment had been described in genetically modified mouse for the proteins involved in the elastogenesis such as lysyl oxidase-like 1 (LOXL-1), fibulin-3 and -5. Since, ligaments are the main supportive structures of pelvic organs, the aim of this study was to evaluate the elastogenesis in the IpL development during mouse pregnancy. Thus virgin, pregnant and postpartum C57Bl/06 wild-type and fibrillin-1mg?/+ female mice were studied using light, confocal, transmission electron microscopy, western blotting and real-time PCR. Both, wild-type and fibrillin-1mg?/+ female mice showed classically the separation of the pubic bones, the formation and relaxation of the IpL and the recovery at postpartum. These processes suggested a pattern which cells control the extracellular matrix remodeling under hormonal and molecular signaling. The ultra-structure of the fibrocartilaginous tissue had slender bundles of microfibrils randomly distributed among the fibrochondrocytes. By the time IpL is formed, there were seen elastic fibers, which consist of small conglomerates of amorphous material, distributed among the bundles of microfibrils. The IpL showed elastic fibers and all tissue compounds aligned to the opening axis of the articulation before parturition. The immunohistochemical study and quantitative gene expression indicated that during IpL development in wild-type mice, tropoelastin/elastin, fibrillin-1, fibrillin-2, LOXL-1, fibulin-5 and TGF-? were spatial and temporal regulated, and these molecules might contribute to the synthesis of new elastic fibers that assure the elasticity that is needed to the pelvic girdle during preparation for parturition and also the recovery at postpartum. However, compared to wild-type mice, alterations were found in the quantitative gene expression of elastin, fibrillin-1, LOXL-1, fibulin-5 and TGF- ?, different from the morphology that was very similar to the one that was observed in wild-type mice. In this study, the fibrillinmg?/+ mice did not show pelvic organ prolapse after the first parturition as LOXL1-/- did (Liu et al., 2004), neither morphological modifications that could be related to the weakness of pelvic tissue. However, this is the first work about pelvic dysfunctions in multiparous fibrillin-1mg?/+ mice used as reproductive matrices. In conclusion, the elastic fiber assembly that occurred in the mouse pubic symphysis during the adult life has characteristics of a model that could be used to understand normal and pathological processes, mainly those related to genetically modified mice for the proteins involved in the elastogenesis. Then, this work may bring readers up-to-date with accumulating evidence that the mouse pubic symphysis undergoes remarkable modifications during pregnancy with new synthesized elastic fibers and may contribute to our understanding of the biological mechanisms about elastic fiber assembly / Mestrado / Histologia / Mestre em Biologia Celular e Estrutural

A sintomatologia dolorosa é um dos principais estímulos capaz de caracterizar ações nocivas e, portanto, é um importante mecanismo de defesa. No estudo da dor orofacial, as alterações musculoesqueléticas de cabeça, pescoço e face caracterizam um grupo de sintomatologia dolorosa, denominadas de Disfunções Temporomandibulares (DTMs). As DTMs possuem etiologia multifatorial, incluindo alterações estruturais, sensoriais e influências emocionais-motivacionais, atingindo cada vez mais indivíduos na sociedade atual. Para o tratamento desta patologia é necessário o conhecimento detalhado dos mecanismos moleculares e fisiológicos envolvidos, os quais têm sido objetivo de alguns pesquisadores nos últimos anos. Entretanto, ainda se faz necessário a continuidade deste estudo para caracterização minuciosa das DTMs, com novas possibilidades de intervenção e tratamento da sintomatologia dolorosa. Como principais fatores associados à DTM, a inflamação e as alterações estruturais e moleculares da articulação temporomandibular (ATM) desempenham importante papel nesta patologia. Ainda, sabe-se que a dor, em particular a dor inflamatória, promove a ativação de mecanismos locais e sistêmicos, os quais liberam mensageiros fundamentais para a modulação da resposta do organismo, como proteínas e citocinas inflamatórias gerando a inflamação propriamente dita. Segundo a literatura, durante o estabelecimento da resposta inflamatória, muitas proteínas, principalmente as denominadas, metaloproteinases da matriz extracelular (MMPs), são responsáveis pela reabsorção de colágeno, e de outras macromoléculas estão intimamente envolvidas neste processo. Além disso, as MMPs também participam da reorganização no sistema nervoso que ocorre juntamente com os processos inflamatórios persistentes. Desde meados da década de 90, tem sido utilizado com considerável sucesso a laserterapia de baixa intensidade para o tratamento das DTMs na clínica odontológica. Dentro desta perspectiva, estudos demonstraram que este método de tratamento possui atividade antiinflamatória e colaboram no reparo tecidual. Estudo recente demonstrou que o desenvolvimento da inflamação bilateral das ATMs promoveu alteração das MMPs no gânglio trigeminal, bem como desencadeou um processo de alodinia mecânica e hiperalgesia orofacial. Desta forma, o presente projeto teve como objetivo, verificar se o uso da laserterapia de baixa intensidade (LLLT) altera a expressão das MMPs no gânglio trigeminal, nas diferentes fases de desenvolvimento da inflamação intraarticular, (1, 3, 5, 7 e 10 dias) bem como na alodinia mecânica e da hiperalgesia orofacial em ratos. Os resultados obtidos neste trabalho mostraram que a LLLT em ratos inflamação persistente das ATMs, induzida por administração de Adjuvante Completo de Freund, reduziu a alodinia mecânica, avaliada pelo teste de von Frey, bem como a hiperalgesia orofacial no teste da formalina. Adicionalmente, observou-se redução do aumento da MMP-9 e da MMP-2, nos ratos tratados com LLLT. / Painful symptoms is one of the main stimuli that characterizing threatening situation and represent an important defense mechanism. In the study of orofacial pain, musculoskeletal abnormalities of the head, neck and face featuring a group of painful symptoms, which are known as Temporomandibular Disorders (TMD). The TMDs have a multifactorial etiology, including structural changes, sensory and emotional-motivational influences. For the treatment of this pathology is necessary detailed knowledge of the physiological and molecular mechanisms involved, which have been the goal of several researchers in the last few years. However, it is still necessary to continue this study for detailed characterization of TMDs, with new possibilities for intervention and treatment of painful symptom. It is noteworthy that inflammation, as well as molecular and structural changes of the temporomandibular joint (TMJ) play an important role in TMD. Also, it is known that pain, particularly inflammatory pain, promotes the activation of local and systemic mechanisms which release essential mediators, such as proteins and inflammatory cytokines generating inflammation itself. Furthermore, during the establishment of the inflammatory response, many proteins, in particular, the extracelular matrix metalloproteinases (MMPs) are responsible for the resorption of collagen and other macromolecules. Moreover, MMPs also participate in the reorganization that occurs in the nervous system during persistent inflammatory processes. Since the 90s, has been used with considerable success to low intensity laser therapy for the TMD treatment in clinical dentistry. In addtion, studies have shown that this therapy has antiinflammatory activity and collaborate in tissue repair. A recent study has demonstrated that the development of bilateral inflammation of TMJs promote alteration of MMPs expression in the trigeminal ganglion, and triggered a process of orofacial mechanical allodynia and hyperalgesia. Thus, this study aimed to determine whether the use of low intensity laser therapy (LLLT) alters the expression and activity of MMPs in the trigeminal ganglion, at different stages of development of intraarticular inflammation (1,3, 5, 7 and 10 days), as well as mechanical allodynia and hyperalgesia orofacial in rats. So, the results showed that LLLT, reduced mechanical allodynia (as measured by the von Frey test), and orofacial hyperalgesia (formalin test) in rats submmitted to persistent inflammation of TMJs induced by administration of Freund\'s Complete Adjuvant (CFA). Additionally, whereas CFA administration induced an increase of MMP-9 and MMP-2 expression in the trigeminal ganglion, LLLT reduce these effects.

1. Abstract Protein kinase C α (PKCα) is a serine/threonine protein kinase regulating many different signaling pathways. The aim of this study was to investigate the potential role of PKCα in amoeboid morphology and invasion of cancer cells. It was observed, that expression of PKCα as well as its phosphorylation on Thr497 remained unchanged upon amoeboid-mesenchymal transition of A375m2 cells (induced by inhibition of ROCK kinase) both in 3D and in 2D environment. However, activation of PKCα by PKC activator treatment resulted in mesenchymal- amoeboid transition of K2 and MDA-MB-231 mesenchymal cell lines, although it did not change overall invasivity ability of cells to invade 3D collagen. Notably, PKCα activation significantly reduced matrix degrading abilities of A375m2 cells. Conversely, inhibition of PKCα by PKCα inhibitor treatment caused amoeboid-mesenchymal transition of amoeboid A375m2 cells and it was associated with decreased invasiveness of all three cell lines used. PKCα inhibitor did not have any effect on gelatin degradation area of A375m2 cells. Consistently, specific siRNA mediated downregulation of PKCα lead to transition from amoeboid to mesenchymal morphology of A375m2 cells and reduced invasiveness of cells into 3D collagen. Moreover, gelatin degrading abilities of A375m2 cells were...

A sintomatologia dolorosa é um dos principais estímulos capaz de caracterizar ações nocivas e, portanto, é um importante mecanismo de defesa. No estudo da dor orofacial, as alterações musculoesqueléticas de cabeça, pescoço e face caracterizam um grupo de sintomatologia dolorosa, denominadas de Disfunções Temporomandibulares (DTMs). As DTMs possuem etiologia multifatorial, incluindo alterações estruturais, sensoriais e influências emocionais-motivacionais, atingindo cada vez mais indivíduos na sociedade atual. Para o tratamento desta patologia é necessário o conhecimento detalhado dos mecanismos moleculares e fisiológicos envolvidos, os quais têm sido objetivo de alguns pesquisadores nos últimos anos. Entretanto, ainda se faz necessário a continuidade deste estudo para caracterização minuciosa das DTMs, com novas possibilidades de intervenção e tratamento da sintomatologia dolorosa. Como principais fatores associados à DTM, a inflamação e as alterações estruturais e moleculares da articulação temporomandibular (ATM) desempenham importante papel nesta patologia. Ainda, sabe-se que a dor, em particular a dor inflamatória, promove a ativação de mecanismos locais e sistêmicos, os quais liberam mensageiros fundamentais para a modulação da resposta do organismo, como proteínas e citocinas inflamatórias gerando a inflamação propriamente dita. Segundo a literatura, durante o estabelecimento da resposta inflamatória, muitas proteínas, principalmente as denominadas, metaloproteinases da matriz extracelular (MMPs), são responsáveis pela reabsorção de colágeno, e de outras macromoléculas estão intimamente envolvidas neste processo. Além disso, as MMPs também participam da reorganização no sistema nervoso que ocorre juntamente com os processos inflamatórios persistentes. Desde meados da década de 90, tem sido utilizado com considerável sucesso a laserterapia de baixa intensidade para o tratamento das DTMs na clínica odontológica. Dentro desta perspectiva, estudos demonstraram que este método de tratamento possui atividade antiinflamatória e colaboram no reparo tecidual. Estudo recente demonstrou que o desenvolvimento da inflamação bilateral das ATMs promoveu alteração das MMPs no gânglio trigeminal, bem como desencadeou um processo de alodinia mecânica e hiperalgesia orofacial. Desta forma, o presente projeto teve como objetivo, verificar se o uso da laserterapia de baixa intensidade (LLLT) altera a expressão das MMPs no gânglio trigeminal, nas diferentes fases de desenvolvimento da inflamação intraarticular, (1, 3, 5, 7 e 10 dias) bem como na alodinia mecânica e da hiperalgesia orofacial em ratos. Os resultados obtidos neste trabalho mostraram que a LLLT em ratos inflamação persistente das ATMs, induzida por administração de Adjuvante Completo de Freund, reduziu a alodinia mecânica, avaliada pelo teste de von Frey, bem como a hiperalgesia orofacial no teste da formalina. Adicionalmente, observou-se redução do aumento da MMP-9 e da MMP-2, nos ratos tratados com LLLT. / Painful symptoms is one of the main stimuli that characterizing threatening situation and represent an important defense mechanism. In the study of orofacial pain, musculoskeletal abnormalities of the head, neck and face featuring a group of painful symptoms, which are known as Temporomandibular Disorders (TMD). The TMDs have a multifactorial etiology, including structural changes, sensory and emotional-motivational influences. For the treatment of this pathology is necessary detailed knowledge of the physiological and molecular mechanisms involved, which have been the goal of several researchers in the last few years. However, it is still necessary to continue this study for detailed characterization of TMDs, with new possibilities for intervention and treatment of painful symptom. It is noteworthy that inflammation, as well as molecular and structural changes of the temporomandibular joint (TMJ) play an important role in TMD. Also, it is known that pain, particularly inflammatory pain, promotes the activation of local and systemic mechanisms which release essential mediators, such as proteins and inflammatory cytokines generating inflammation itself. Furthermore, during the establishment of the inflammatory response, many proteins, in particular, the extracelular matrix metalloproteinases (MMPs) are responsible for the resorption of collagen and other macromolecules. Moreover, MMPs also participate in the reorganization that occurs in the nervous system during persistent inflammatory processes. Since the 90s, has been used with considerable success to low intensity laser therapy for the TMD treatment in clinical dentistry. In addtion, studies have shown that this therapy has antiinflammatory activity and collaborate in tissue repair. A recent study has demonstrated that the development of bilateral inflammation of TMJs promote alteration of MMPs expression in the trigeminal ganglion, and triggered a process of orofacial mechanical allodynia and hyperalgesia. Thus, this study aimed to determine whether the use of low intensity laser therapy (LLLT) alters the expression and activity of MMPs in the trigeminal ganglion, at different stages of development of intraarticular inflammation (1,3, 5, 7 and 10 days), as well as mechanical allodynia and hyperalgesia orofacial in rats. So, the results showed that LLLT, reduced mechanical allodynia (as measured by the von Frey test), and orofacial hyperalgesia (formalin test) in rats submmitted to persistent inflammation of TMJs induced by administration of Freund\'s Complete Adjuvant (CFA). Additionally, whereas CFA administration induced an increase of MMP-9 and MMP-2 expression in the trigeminal ganglion, LLLT reduce these effects.