This study set out to express, purify and characterize twelve ammonia lyase enzymes for potential application as a supplement to a treatment of an inborn error of metabolism disease. The DNA sequence for two wild-type ammonia lyases, three modified ammonia lyases and seven resurrected ancestral ammonia lyases had been synthesized and cloned in vectors. These were transformed into Escherichia coli, expressed, purified using immobilized metal affinity chromatography and size exclusion chromatography and characterized. Ten of the enzymes were successfully expressed and purified. All enzymes had a higher turnover number with substrate 1 than with substrate 2. The wild-types showed the highest catalytic turnover and one of them displayed substrate cooperativity. The modified enzymes were inactive. Some ancestral enzymes were active and had decreasing kcat with age. A promising ancestral enzymes was found that showed a kcat of 2,85 s-1 with substrate 1 and 1,82 s-1 with substrate 2. The ancestral enzymes had a lower Km with substrate 2 compared to substrate 1, while one of the wild-types had a higher Km with substrate 2 than with substrate 1, indicating that the substrate affinity has switched. The ancestral enzymes had increased thermostability compared to the wild-types which increased with age. Ranging from a +7C increase in melting temperature with the youngest ancestral enzyme to +10,7C with the oldest tested enzyme, comparing with one of the wild-types. The promising ancestral enzyme displayed a higher stability than the wild-types during long term incubation in 37_C and 25_C, since it did not become prone to aggregation,it did not show visible degradation on SDS-PAGE and it retained the highest activity following incubation. It was also demonstrated that neither wild-types nor the promising ancestral enzyme were stable in a simulated gut environment. The promising ancestral enzyme and one of the wild-types degraded substrate 1 and 2 in serum. Using the resurrection of ancestral sequences a promising enzyme has been produced and characterized, displaying properties that are desired in therapeutic enzymes. The enzyme did not aggregate or become prone to aggregation over time, it was thermostable, it was active in serum and had acceptable catalytic properties. For therapeutic application of the ancestral enzyme, immunogenicty should be analyzed in silico and in vitro followed by further investigation in vivo. / Målet med denna studie var att uttrycka, rena och karaktärisera tolv ammonia lyase enzymer, för potentiell användning som komplement till en behandling utav en sjukdom, som tillhör sjukdomsgruppen medfödda ämnesomsättningsrubbningar. DNA sekvensen för två vild-typammonia lyaser, tre modifierade ammonia lyaser och sju återuppväckta ammonia lyaser hade blivit syntetiserade och klonade i vektorer. E.coli celler blev transformerade med vektorerna, vilka uttryckte enzymerna, som renades med hjälp av immobilized metal affinity chromatography och gelfiltrering och karaktäriserades. Tio utav enzymerna kunde uttryckas och renas. Alla enzymer hade högre katalytisk omsättning av substrat 1 än substrat 2. Vildtyperna hade högst kcat med båda substrat och en utav dem uppvisade substratsammarbete. De modifierade enzymerna var inaktiva. Några av de återuppväckta ammonia lyaserna var aktiva och kcat minskade med ålder. Ett av de återuppväckta enzymerna var lovande och hade ett kcat värde av 2,85 s-1 med substrat 1 och 1,82 s-1 med substrat 2. De återuppväckta enzymerna hade ett lägre Km värde för substrat 2 än substrat 1, jämfört med en utav vildtyperna som hade ett högre Km värde för substrat 2 än substrat 1, vilket indikerar ett skifte i substrataffinitet. De återuppväckta enzymerna var mer termostabilia än vild-typerna och termostabiliteten ökar med ålder. Ökningen i smälttemperatur låg i spannet av +7C för de yngsta återuppväckta enzymerna till + 10,7C för det äldsta testade återuppväckta enzymet, vid jämförelse med en utav vild-typerna. Det lovande återuppväckta enzymet demonstrerade även en högre stabilitet än vild-typerna under långtidsinkubering, eftersom den inte blev benägen att aggregera, den uppvisade ingen nedbrytning på SDS-PAGE och den behöll högst aktivitet efter inkubering. Det bevisades även att varken vild-typerna eller det lovande återuppväckta enzymet var stabila i en simulerad magsäcksmiljö. Både det lovande återuppväckta enzymet och en av vild-typerna bröt ner substrat 1 och 2 i serum. Genom att återuppväcka sekvenser kunde ett lovande enzym produceras och karaktäriseras, vilket uppvisade egenskaper som är eftertraktade i terapeutiska enzymer. Enzymet aggregerade ej, det blev inte benäget att aggregera över tid, det var termostabilt, det var aktivt i serum och hade acceptabla katalytiska egenskaper. För terapeutisk applikation av det återuppväckta enzymet, borde analys av dess immunogenicitet utföras in silico och in vitro följt av vidare undersökning in vivo.

This project aimed at exploring new hybrid materials to be used for acoustophoresis applications. Acoustophoresis can be used to manipulate particles inside a microfluidic channel by creating ultrasound standing waves within the channel [1]. This can be used for cell separation [2] or trapping of particles [3]. The intent of this project was to create materials for use in microfluidic channels that would be cheaper and easier to manufacture than those traditionally used, while still having adequate acoustic properties to allow for use in acoustopheresis. This was done by investigating whether the addition of glass-beads or glass-bubbles could increase the acoustic properties of an off-stoichiometry-thiol-enes (OSTE) based polymer. Hybrid samples with different volume fractions of glass-beads or glass-bubbles added to the OSTE polymer were manufactured and characterised according to their acoustic properties using the pulse-echo buffer-rod method. The acoustic properties measured were the density, attenuation, acoustic impedance and the reflection coefficient between water and the material. The addition of glass-beads was found to increase the acoustic impedance while the inverse was found for the addition of glass-bubbles. Both the addition of glass-beads and glass-bubbles were found to increase the attenuation. The hybrid material that was found to have the most suitable acoustic properties was OSTE/Glass-beads 40%, whose acoustic impedance had been increased ∼60% compared to pure OSTE. Consequently, the OSTE/Glass-beads 40% material was used to manufacture a microfluidic channel. A particle trapping experiment showed that the OSTE/Glass-beads 40% microfluidic channel was able to obtain bead trapping. This means that a standing wave was able to be generated within the channel and that it was strong enough to trap particles in the centre of the channel. However, evaluation of the particle trapping efficiency of the channel showed that it was not as effective as those using traditional materials. Therefore, future work is recommended to optimise a channel design for the OSTE/Glass-beads 40% material to increase the particle trapping efficiency. / I detta projekt undersöktes ett nytt hybridmaterial för användning i applikationer inom akustofores. Akustofores kan användas till att manipulera partiklar inuti mikrofluidkkanaler genom att generera ståendevågor i kanalen med hjälpav ultraljud [1]. Detta kan användas till cellseparation [2] eller till att fånga partiklar [3]. Målet i detta projekt var att skapa material som skulle bli billigare och möjliggöra enklare fabricering av kanalerna som används inom akustofores än de material som traditionellt används, med bibehållande av tillräckliga akustiskaegenskaper. Detta genomfördes genom att undersöka om tillsättning av glaspärlor eller glasbubblor kunde förbättra de akustiska egenskaperna av en off-stoichiometry-thiol-enes (OSTE) baserad polymer. Hybridprover gjorda på OSTE-polymeren med olika volymandelar av glaspärloroch glasbubblor tillverkades och kategoriserades med avseende på deras akustiska egenskaper med hjälp av pulseeko buffertstång metoden. De akustiska egenskaperna som uppmättes var densitet, attenuering, akustisk impedans och reflektions koefficienten mellan vatten och materialet. Resultatet av projektet visade att tillsättning av glaspärlor ökade den akustiska impedansen  i motsatts till glasbubblorna som visade sig minska den. Vidare visade det sig att både tillsättningen av glaspärlor och glasbubblor ökade attenueringen. Det hybridmaterial som visade sig ha de mest lämpliga akustiska egenskaperna var OSTE/glaspärlor med en 40% volymandel av glaspärlor. Den akustiska impedansen hade förhöjts med cirka 60% jämfört med vanlig OSTE. Därför valdes det hybrid-materialet till att tillverka en mikrofluidikkanal. Därefter genomfördes ett partikelfångstexperiment som visade att, OSTE/glaspärlor med en 40% volymandel av glaspärlor, kunde erhålla partikelfångst i kanalen. Detta innebär att en stående våg kunde genereras i kanalen och att den var tillräckligt stark för att kunna fånga partiklarna i mitten av kanalen. Däremot visade utvärdering av kanalens partikelfångsteffektivitet att den inte var lika effektiv som kanaler gjorda av traditionellt använda material. Därför rekommenderas framtida arbete till att designa en optimerad kanaldesign med OSTE/Glas-pärlor 40% materialets egenskaper i åtanke för att förhoppningsvis kunna öka partikelfångst effektivitet.

In 2014 SÖRAB constructed a continuous biological treatment system (KBR) to handle leachate waterfrom the landfill at the facility in Löt, north of Stockholm. The KBR is mainly focused on removal ofammonium nitrogen which would otherwise be released in to the recipient and contribute toeutrophication and damage to the environment. This project has focused on replacing the currentcarbon source in the process Brenntaplus VP1 and evaluating the efficiency of denitrification andeconomy of transitioning to a new carbon source. The carbon sources glycerol and ethanol wereevaluated and compared to Brenntaplus VP1 for the denitrification efficiency and microbial profile.The experiments were performed in laboratory conditions and in pilot scale using leachate water fromLöt. The reduction of ammonia was evaluated by chemical precipitation, addition of carbon sources bymeasuring ammonia-N and nitrate-N under aerobic (nitrification) and anaerobic (denitrification)conditions. The combination of ethanol and glycerol showed an enhanced denitrification and increasedmicrobial community both in lab and pilot scale studies with reduced hydraulic retention time. Therate of nitrate reduction was 0.23 mgNO3-N 1 -1 h -1 for ethanol/glycerol compared to 0.12-0.17mgNO 3- -N 1 -1 h -1 for Brenntaplus VP1 in pilot scale. The results indicate that using ethanol, glycerolor a mix of the two as a substitute for Brenntaplus VP1 is viable. This has been based on laboratoryand pilot scale studies. Each of the carbon sources examined during this project have showed a uniqueimpact on the process and its parameters such as: denitrification rate, microbial density and microbialcomposition. The carbon sources had an impact with temperature fluctuation and faster denitrificationcompared to the conventional KBR system. This implies that the carbon sources tested in this projectcan be advantageous and beneficial for Sörab depending on the carbon source availability and theseasonal variations. / Under 2014 konstruerade SÖRAB ett kontinuerligt biologiskt reningsverk (KBR) för att hanteralakvatten från deponin för ickefarligt avfall vid anläggningen i Löt, norr om Stockholm. KBR ärfrämst konstruerad för rening av ammoniumkväve som annars skulle släppas ut till recipienten ochbidra till övergödning och skador på miljön i området. Detta projekt har fokuserat på att ersätta dennuvarande kolkällan Brenntaplus VP1 som används i processen och utvärdera effektiviteten idenitrifieringen samt ekonomin vid övergång till en ny kolkälla. Kolkällorna glycerol och etanol varde kolkällor som valdes för utvärdering i detta projekt, dessa jämfördes med Brenntaplus VP1 i desseffekt på denitrifikationseffektivitet och mikrobiell sammansättning under laboratorieförhållanden ochi pilotskala. Möjligheten att reducera ammoniumkoncentrationen i lakvattnet utvärderades genomkemisk fällning och genom mätning av ammoniumkväve och nitratkväve under aeroba (nitrifikation)och anaeroba (denitrifikation) förhållanden. Kombinationen av etanol och glycerol indikerade enförbättrad denitrifikation och ökad mikrobiell densitet både i laboratorie- och pilotskala med reduceradhydraulisk retentionstid. Nitratreduktionshastigheten var 0,23 mgNO 3- -N 1 -1 h -1 för blandningen avetanol/glycerol jämfört med 0,12 - 0,17 mgNO 3- -N 1 -1 h -1 för Brenntaplus VP1 i pilotskala. Resultatenindikerar att användning av etanol, glycerol eller en blandning av de två har goda förutsättningar föratt ersätta Brenntaplus VP1. Var och en av de tre kolkällorna som undersöktes under detta projekt harvisat en unik inverkan på processen och dess parametrar såsom: denitrifikationshastighet, mikrobielldensitet och mikrobiell sammansättning. Genom att byta kolkälla i KBR kan prestandan ökas genomatt minska den hydrauliska retentionstiden samtidigt som systemet tycks bli mindre känsligt förtemperatursvängningar. Kolkällorna som utvärderats i detta projekt kan därför vara fördelaktiga för SÖRAB beroende på dess tillgänglighet och pris.

Groundwater (GW) accounting for most of the freshwater available around the World, finding sustainable techniques to depollute it is of crucial importance for safe drinking water supply. The extensive use of fertilizers in the agriculture, as well as other anthropogenic activities, are contributing to the excessive nitrate levels in some aquifers. These levels need to be reduced to obtain potable water. Bioelectrochemical systems (BES), using microorganisms to catalyze a desired electrochemical reaction, recently proved to be a very promising technology for water remediation. Groundwater denitrification using Microbial Electrolysis Cell (MEC) needs to be improved for further scaled-up on-site system. The advantages conferred by fluidized bed reactor (FBR), as well as the outstanding electrochemical properties of reduced graphene oxide (rGO), are two potential enhancements of such bioelectrochemical denitrification system that were investigated in this thesis. Some essential parameters could be determined during the preliminary steps' experiments. The fluidization trials gave us a clear insight that Coconut-based Activated Carbon (CAC) particles were resistant carrier particles, nicely fluidized within a 39.27cm3 circular cathodic chamber for a flow rate ranging between 450ml/min to 590ml/min. For the same flow rate of 500ml/min, we could obtain CAC particles fluidization for the upstream fluidized configuration, and still bed particles for the fixed bed downstream configuration, which would be very useful for later unbiased comparison. The denitrifying bacteria showed during their enrichment, a nitrate removal rate of up to 1.986ppm NO3-N/h in serum bottles, with an average of 0.38ppm NO2-N/h accumulation. The parallel running of fixed bed versus fluidized bed denitrifying reactor in order to compare their denitrification performances, was planned, but could not be performed due to COVID-19. The graphene oxide (GO) batch experiments showed a good biocompatibility between GO/rGO and our autotrophic denitrifying bacteria. A change of morphology within about 20 hours was observed, probably suggesting the reduction of GO to rGO by the bacteria. During a first test, the presence of GO led to a 2.7 folds less efficient denitrification performance as compared with the GO/rGO-free condition, likely due to the competition between nitrate and GO for being reduced. However, the denitrification rate in presence of GO/rGO increased up to 1.873ppm NO3-N/h after the second pulse of groundwater and flush with H2/CO2 gas, which is almost 2.3 folds higher than initially in the same condition. This suggests that GO needs some time to get fully reduced to rGO, and the denitrification rate might reach the same or higher levels as in the GO/rGO-free conditions, when GO is fully reduced. Improved denitrification would indicate that rGO facilitates the electron transfer between bacteria and nitrate, as it can be expected from its electrochemical properties previously studied. This would be worth being investigated in the scope of a longer experience. / Grundvatten (GW) som står för det mesta av det sötvatten som finns tillgängligt runt om i världen och att hitta hållbara tekniker för att förorena det är av avgörande betydelse för en trygg dricksvattenförsörjning. Den omfattande användningen av gödselmedel i jordbruket, liksom andra antropogena aktiviteter, bidrar till de överdrivna nitratnivåerna i vissa vattenfiskare. Dessa nivåer måste sänkas för att erhålla dricksvatten. Bioelektrokemiska system (BES), med användning av mikroorganismer för att katalysera en önskad elektrokemisk reaktion, visade sig nyligen vara en mycket lovande teknik för sanering av vatten. Grundvatten denitrifikation med hjälp av Microbial Electrolysis Cell (MEC) måste förbättras för att ytterligare skala upp systemet på plats. Fördelarna med fluidiserad bäddreaktor (FBR) såväl som de enastående elektrokemiska egenskaperna hos reducerad grafenoxid (rGO) är två potentiella förbättringar av ett sådant bioelektrokemiskt denitrifikationssystem som undersöktes i denna avhandling. Vissa väsentliga parametrar kan bestämmas under de preliminära stegens experiment. Fluidiseringsstudierna gav oss en klar insikt om att kokosnötbaserade aktiverade kolpartiklar (CAC) -partiklar var resistenta bärarpartiklar, trevligt fluidiserade i en cirkulär katodisk kammare på 39,27 cm3 för en flödeshastighet mellan 450ml/min till 590ml/min. För samma flödeshastighet på 500ml/min kunde vi få CAC-partikelfluidisering för uppströms fluidiserad konfiguration och stillbäddspartiklar för den fixerade bädden nedströms konfiguration, vilket skulle vara mycket användbart för senare opartisk jämförelse. De denriffriserande bakterierna visade under deras anrikning en nitratborttagningshastighet av upp till 1,986 ppm NO3-N/h i serumflaskor, med ett genomsnitt på 0,38 ppm NO2-N / h ackumulering. Den parallella körningen av denitrifierande reaktorn med fast bädd kontra fluidiserad bädd för att jämföra deras denitrifikationsprestanda planerades, men kunde inte utföras på grund av COVID-19. Diagramexperimenten av grafenoxid (GO) visade en god biokompatibilitet mellan GO/rGO och våra autotrofiska denitrifierande bakterier. En förändring av morfologin inom cirka 20 timmar observerades, vilket antagligen antydde att bakterierna minskade GO till rGO. Under ett första test ledde närvaron av GO till 2,7 gånger mindre effektiv denitrifikationsprestanda jämfört med GO/rGO-fritt tillstånd, troligtvis på grund av konkurrensen mellan nitrat och GO för att ha minskat. Denitrifikationsgraden i närvaro av GO/rGO ökade emellertid upp till 1,873 ppm NO3-N/h efter den andra grundvattenspulsen och spolades med H2/CO2-gas, vilket är nästan 2,3 gånger högre än ursprungligen i samma tillstånd. Detta antyder att GO behöver lite tid för att helt reduceras till rGO, och denitrifikationsgraden kan nå samma eller högre nivåer som i GO/rGO-fria förhållanden, när GO är helt reducerad. Förbättrad denitrifikation skulle indikera att rGO underlättar elektronöverföring mellan bakterier och nitrat, som det kan förväntas av dess elektrokemiska egenskaper som tidigare studerats. Detta skulle vara värt att undersökas inom ramen för en längre upplevelse.

The rapid growth of the biopharmaceutical industry has led to increasing demands on the protein production process. An important aspect is the yield of functional protein, which can be greatly affected by the choice of downstream purification. Purification based on acidic elution can be an issue for pH-sensitive proteins, since dramatic changes in pH can lead to protein aggregation and loss of function. The harsh, acidic elution conditions used in conventional purification of antibodies by Protein A affinity chromatography can thus be problematic. To address this, a calcium-dependent protein domain, called ZCa, has previously been developed for mild purification of antibodies, with elution close to physiological pH. Presented here are engineered variants of ZCa with novel affinity towards other biotherapeutics, which could also benefit from mild purification. Phage display selection, using a ZCa-based library, was applied to isolate promising ZCa-based binders against antigen-binding fragments, tissue plasminogen activator, and granulocyte colony stimulating factor, yet to be characterized. Additionally, three ZCa-based variants from a previous selection, with affinity for single-chain variable fragments (scFvs), have been identified and characterized. In a purification setup, they were shown to elute the scFv protein at neutral pH in a calcium-dependent manner. The reported results demonstrate that novel affinity can be introduced to the ZCa domain, while maintaining the calcium-dependent behavior that enables gentle purification. This offers a strategy for broadening the range of proteins that can be purified under mild conditions, with the benefit of reducing protein aggregation and thus increasing the yield of functional protein. / Den snabba tillväxten inom bioläkemedelsindustrin har lett till ökade krav på processen för proteinproduktion. En viktig aspekt är utbytet av funktionellt protein, där valet av reningsmetod kan ha stor påverkan. Proteinrening med syraeluering kan utgöra ett problem för pH-känsliga proteiner, då stora förändringar i pH kan leda till aggregering och försämrad funktionalitet. Det låga pH som används för eluering i den traditionella reningen av antikroppar med Protein A-baserad affinitetskromatografi kan därmed vara problematiskt. Som ett svar på detta har en kalciumberoende proteindomän, vid namn ZCa, tidigare utvecklats för mild rening av antikroppar med eluering nära fysiologiskt pH. I det här arbetet presenteras nya varianter av ZCa som modifierats för att binda till andra bioläkemedel, vilka också skulle kunna gynnas av mild proteinrening. Fagdisplay av ett ZCa-baserat bibliotek har applicerats för att isolera lovande ZCa-baserade bindare mot antikroppsfragment (Fab), vävnadsplasminogenaktivator och granulocytkolonistimulerande faktor, vilka ännu inte karaktäriserats. Utöver detta identifierades och karaktäriserades tre ZCa-baserade varianter från en tidigare selektion, med affinitet för enkelkedjiga antikroppsfragment (scFv). Då dessa varianter utvärderades för rening visade alla på kalciumberoende eluering av scFv vid neutralt pH. Det här demonstrerar att ny affinitet kan introduceras till ZCa-domänen, där det kalciumberoende beteende som möjliggör mild proteinrening bevaras. Detta erbjuder en strategi för att utöka antalet proteiner som kan renas under milda kalciumberoende förhållanden, vilket med fördel kan minska aggregering och därmed öka utbytet av funktionellt protein.

Cancer is a complex disease and presents one of the greatest challenges in modern medicine. Despite remarkable advances in treatment of several cancer types, relapse and resistance to therapy remain recurring outcomes in patients, which underscores a need for personalized treatment approaches. These complications have been related to the high genetic diversity observed within tumors, termed intratumor heterogeneity (ITH). While specific mutational profiles have been associated with the development of heterogeneous tumors, the relationship between ITH and phenotype could unveil features that undergo selection and convey fitness. Features presented in the transcriptome, as markers of heterogeneity, might therefore be valuable biomarkers. In this project, these features are explored by assuming a linear relationship between genetic ITH measures and gene expression data from The Cancer Genome Atlas samples. By first reducing the number of variables among the transcriptome to the differentially expressed genes between low and high ITH samples, the association between specific gene expression profiles and ITH is sought with a linear model. By using two different methods for estimating ITH, called Expands and PhyloWGS, the association was modeled with each method. Interestingly, the model based on Expands captured the elevated expression of a chaperone gene DNAJC18 as being consistently associated with lower ITH in four cancer types. On the other hand, models based on PhyloWGS presented lower predictive power. These results demonstrate that the transcriptome can be used to predict genetic ITH, although this depends on the method used for characterizing ITH. / Cancer är en komplex sjukdom och en av de största utmaningarna i dagens medicin. Trots stora framsteg i behandlingen av flera cancerformer är återfall och terapiresistens återkommande problem vilket talar starkt för behov av individualiserad behandling. Dessa komplikationer har relaterats till den höga genetiska variabiliteten som observeras inom tumörer, även kallad intratumoral heterogenitet (ITH). Undersökning av relationen mellan ITH och fenotypisk data kan ta fram markörer som är involverade i cancerutvecklingen som bidragare till heterogenitet. Genom att modellera associationen mellan transcriptomen och ITH kan man även hitta kliniskt relevanta biomarkörer. I detta projekt undersöks relationen mellan genutryck och ITH genom att applicera linjär regression. Genom att först reducera antalet variabler i transkriptomen till de diferentiellt utryckta gener, används linjära modellen för att ta fram specifika gener vars utryck kan relateras till ändringar i ITH uppskattad för The Cancer Genome Atlas prover. ITH uppskattas med två algoritmiska metoder, kallade Expands och PhyloWGS. Resultaten visade att förhöjd uttryck an genen DNAJC18 är associerad med lägre ITH uppskattad med Expands bland fyra cancer typer. Trots detta visade inte genutryck och ITH uppskattat med PhyloWGS lika starkt linjärt samband.

State-of-the-art fluorescent imaging research is strictly limited to eight fluorophore labels duringthe study of intercellular interactions among organelles. The number of excited fluorophore colorsis restricted due to overlap in the narrow spectra of visual wavelength. However, this requires aconsiderable effort of analysis to be able to tell the overlapping signals apart. Significant overlapalready occurs with the use of more than four fluorophores and is leaving researchers limited to asmall number of labels and the hard decision to prioritize between cellular labels to use. Except for the physical limitations of fluorescent labeling, the labeling itself causes behavioralabnormalities due to sample perturbation. In addition to this, the labeling dye or dye-adjacentantibodies are potentially causing phototoxicity and photobleaching thus limiting the timescale oflive cell imaging. Nontoxic imaging modalities such as transmitted-light microscopes, such asbright-field and phase contrast methods, are available but not nearly achieving images of thespecificity as when using fluorophore labeling. An approach that could increase the number of organelles simultaneously studied withfluorophore labels, while being cost-effective and nontoxic as transmitted-light microscopes wouldbe an invaluable tool in the quest to enhance knowledge of cellular studies of organelles. Here wepresent a deep learning solution, using convolutional neural networks built to predict thefluorophore labeling effect on the nucleus, from a transmitted-light input. This solution renders afluorescent channel available for another marker and would eliminate the process of labeling thenucleus with dye or dye-conjugated antibodies by instead using deep convolutional neuralnetworks. / Allra senaste forskningen inom fluorescensmikroskopi är begränsat till upp till åtta fluoroforer förstudier av intracellulära kommunikationer mellan organeller. Antalet fluorescerande färger ärbegränsade till följd av spektralt överlapp i det synliga våglängdsområdet. Överlappande signalerbehöver matematiskt bearbetas vilket innebär ökad arbetsinsats och signifikant överlappning skerredan vid användning av fler än fyra fluoroforer. Denna begräsning innebär i slutändan att forskarehar ett litet antal fluoroforer att arbeta med och behöver därmed prioritera vilka cellulära strukturersom kan märkas samtidigt. Utöver de spektrala begräsningarna med fluorescensmikroskopi, så innebär även själva färgningenav cellulära komponenter en negativ cellulär påverkan i form av avvikande beteende.Fluorescerande färgämnen och märkta antikroppar orsakar potentiellt fototoxicitet ochljusblekning, vilket begränsar tidsrymden vid studier av levande celler. Ljusfältsmikroskop sombright-field and faskontrast har inte en toxisk påverkan men producerar inte i närheten likadetaljerade bilder som fluorescensmikroskop gör. Ett tillvägagångssätt som skulle kunna öka antalet organeller som simultant kan undersökas medfluoroforer, som samtidigt är kostnadseffektiv och inte har en toxisk påverkan somljusfältsmikroskop, skulle vara ett ovärderligt verktyg för utökad kunskap vid cellulära studier avorganeller. Här presenteras en maskininlärningsmetod byggd med artificiella neuronnät för attpredicera fluorescerande infärgningen av cellkärnan i fluorescensmikroskop, med bilder frånljusfältsmikroskop. Denna lösning frigör en fluorofor som kan användas till andra organellersamtidigt som arbetet med fluorescerande infärgning av cellkärnan inte längre är nödvändigt ochersätts med ett artificiellt neuronnät.

Proteases have a fundamental role in regulating diverse biological processes and are important in the biotechnological and medical fields. Therapeutic proteases have great potential but have been limited due to the lack of high throughput protein engineering methods. In this thesis, a method was developed for high throughput screening of protease libraries based on competitive growth in selective media. A proof-of-principle method using the Tobacco Etch Virus protease (TEVp) was developed. TEVp and the reporter consisting of an aggregation-prone peptide amyloidbeta42 (Aβ42) genetically fused to the antibiotic resistance enzyme chloramphenicol acetyltransferase (CAT), were co-expressed in Escherichia coli. The CAT enzyme makes the cells resistant to Chloramphenicol (Cml). Two different reporters containing different cleavage sites situated between the Aβ42 and CAT were used for which TEVp has distinguishable proteolysis efficiencies. Cleavage of the fusion protein would give the cell a growth advantage in media with Cml since the CAT enzyme would avoid misfolding due to Aβ42. The method demonstrates that cells with different substrates can be differentiated based on their survival. A 100-fold enrichment of clones expressing the efficient substrate was also demonstrated from a background of 1:1000 of clones expressing the inefficiently cleaved substrate. Moreover, a semi-rational TEVp library was successfully cloned and co-electroporated with the reporter into E. coli for future selection.

Syftet med denna studie var att tillverka och mäta koncentration, diameter och storleksfördelning för mikrodroppar under olika temperaturer och omrörningstider. Datainsamlingen kom från flera observationer vilket bidrog till en grundlig förståelse för dess egenskaper under olika omständigheter. Ett av de viktigaste resultaten var att temperaturen hade en viktig roll för koncentrationen av mikrodroppar. En minskning av koncentrationsnivåerna observerades vid lägre temperaturer. Vidare noterades att omrörningstiden också spelade en roll, betydande minskningar av det totala antalet mikrodroppar observerades under längre omrörningstider. Mikrodropparnas medeldiameter hade storlekar som låg inom acceptabla intervaller i alla prov. De medeldiametrar som observerades låg inom ett intervall på 3,98 μm till 8,18 μm men större enskilda mikrodroppar med diameter över 10 μm kunde också hittas. Resultaten gav vägledande faktorer för ytterligare undersökningar för att fastställa dess medicinska tillämpningar. Framtida studier bör fortsätta att analysera dessa parametrar för att ytterligare optimera mikrodroppar för användning inom områden som ultraljudsavbildning eller läkemedelsleverans. / The aim of this study was to fabricate and measure the concentration, diameter, size distribution of microdroplets under different temperatures and stirring times. The data collection came from several observations which provided a thorough understanding of its properties under different circumstances. One of the key findings was that the temperature had an important role in the concentration of microdroplets. A decrease in concentration levels was observed at lower temperatures. Furthermore, it was noted that stirring time also played a role, leading to significant reductions in the total number of microdroplets when observed for longer stirring times. The mean diameters of the microdroplets had sizes that were within acceptable ranges in all samples. The mean diameters observed ranged from sizes between 3.98 μm and 8.18 μm but single microdroplets with diameters greater than 10 μm could also be found and observed. The results provided guiding factors for further investigations to determine its medical applications. Future studies should continue to analyze these parameters to further optimize microdroplets for use in areas such as ultrasound imaging or drug delivery.

Dry powder inhalers (DPIs) are often used to deliver drugs to the lungs when treating respiratory diseases. Inhalation powders are often formulated as adhesive mixtures which is the main formulation type used for dry inhalation powders of pharmaceuticals. The fine particulate active pharmaceutical ingredient (API) of interest is mixed with a coarser carrier resulting in an adhesion of the API on to the surface of the larger sized carrier. The aim of this project was to investigate how mixing time and mixing rate influences the morphology and bulk properties of mixtures with different surface to coverage ratios (SCRs). Several analyses of bulk properties were made and a sieve analysis was also conducted to obtain information of the stability of randomly chosen samples. The results showed that mixing time and mixing rate influence the morphology and bulk properties of the adhesive mixtures in different ways. The bulk density and permeability decreased with higher SCR. The bulk density did not seem to be highly affected by mixing time or rate, while the permeability decreased with an increasing mixing rate (i.e. when increasing from 22 to 67 rpm). Regarding the Hausner ratio and compressibility, an increase in SCR increased the HR (with subsequent increase in compressibility). Comparing mixing rates 22 and 67 rpm, an increasing mixing rate appeared to produce mixtures which showed a more stable pattern over mixing time, i.e. less variation in values, in mixtures of SCR 0.5 and 2, while in mixtures of SCR 1, values appeared to fluctuate more. When analyzing the microscopy images, it was observed that SCR 1 with the mixing rate 22 rpm had the smallest agglomerates of all mixture times (when comparing with SCR 0.5 and SCR 2). The mixtures with the highest w/w% of agglomerates above 500 μm were of SCR 2 at both mixing rates and at all mixing times. These mixtures had lower permeability values which is understandable, as it is more difficult for air to get through the powder with large amount of agglomerates in the way. The w/w % for the particles between 90 μm < d < 500 μm was very close for SCR 0.5 and SCR 1. The patterns of the results from the conducted methods appears to be more alike for SCR 0.5 and 1, whereas SCR 2 is more deviant throughout the project.