INTRODUÇÃO O câncer é uma das principais causas de morte no mundo, sendo responsável por cerca de 8 milhões de mortes por ano, segundo dados da OMS. As mortes por câncer são provocadas por tumores que se originam em órgãos como pulmão, fígado, estômago, intestino, mama e esôfago. As células-tronco mesenquimais (CTM) foram identificadas em vários órgãos e estudos da sua interação com células tumorais têm apresentado resultados indicando ação inibitória sobre alguns tipos de tumores. Para explorar essa questão foram analisados os efeitos sobre células tumorais de carcinoma hepatocelular humano (HepG-2) do meio condicionado (MC) obtido do cultivo de CTM isoladas de tecido adiposo (TA), líquido amniótico (LA) e geleia de Wharton (GW). MÉTODOS Os MCs foram coletados após 24 horas de incubação das CTM sub-confluentes com ?-MEM contendo 20% de soro fetal bovino (SFB). Os MCs foram centrifugados e passados através de filtros de 0,22 ?M e armazenadas a -20 °C. O MC da própria célula HepG-2 foi utilizado como controle. Os efeitos dos MCs sobre a proliferação de células HepG-2 foram testados por ensaio MTT, em várias concentrações após 24 h de incubação. O ciclo celular de células HepG-2 tratadas com MC a 25%, 50% ou 75% foi analisado por citometria de fluxo (coloração IP) utilizando o software Modfit LT. A expressão dos genes bcl-2, bcl-6, CCND1 foi analisada por RT-PCR. A proliferação celular foi avaliada pela expressão das proteínas survivina, Bcl-2, PCNA e Ki-67 e pela quantificação de mitocôndrias com corante MitoTracker, assim como pelo potencial de membrana mitocondrial por corante JC-1 Mitoscreen utilizando equipamento de high content analysis. RESULTADOS Os meios condicionados de células-tronco de tecido adiposo (MC-TA) não alteraram a proliferação de células tumorais HepG-2 e os meios condicionados de células-tronco de líquido amniótico (MC-LA) e de geleia de Wharton (MC-GW) provocam aumento da proliferação, confirmada pela contagem de células com núcleos corados com Hoescht 33342. A análise de alterações do ciclo celular demonstrou que a exposição de células HepG-2 aos meios MC-LA diminuem as células na fase G0/G1 e aumentam na fase G2/M do ciclo celular. A expressão dos genes CCND1, Bcl2 e Bcl6 que estão relacionados à proliferação e morte celular não apresentaram alteração. A quantificação das proteínas PCNA e survivina não apresentou alteração sob efeito dos MC, porém a comparação direta entre células tratadas com MC-LA e MC-TA indicou a tendência das células tratadas com MC-LA proliferarem. O percentual de células HepG-2 expressando a proteína Ki-67 foi significativamente menor em relação ao controle quando tratadas com MC-TA, não apresentando diferenças quando tratadas com MC-LA e MC-GW. A contagem de mitocôndrias evidenciou aumento de mitocôndrias nas células HepG-2 tratadas com MC-LA e efeito não significativo dos tratamentos com MC-TA e MC-GW. A diferença do potencial de membrana mitocondrial por JC-1 apresentou aumento da polarização nas células HepG-2 cultivadas com MC-TA. CONCLUSÃO Os resultados confirmam que as células-tronco mesenquimais diferem de acordo com a sua origem tecidual em sua ação na proliferação das células HepG-2. Mais estudos são necessários para estabelecer a causa destas ações, que não parecem ser devido a mediadores mais comuns na proliferação e morte celular / INTRODUCTION Cancer is a leading cause of death worldwide, accounting for about 8 million deaths per year, according to WHO data. Cancer deaths are caused by tumors that originate in organs such as lung, liver, stomach, bowel, breast and esophagus. The mesenchymal stem cells (MSCs) have been identified in many organs and studies of their interaction with tumor cells have shown results indicating an inhibitory effect on some types of tumors. To explore this question the effects of the conditioned medium (CM) obtained from mesenchymal stem cell isolated from adipose tissue (AT), amniotic fluid (AF) and Wharton jelly (WJ) on tumor cells of human hepatocellular carcinoma (HepG-2) were analyzed. METHODS The MSC CM was collected after 24 hours incubation of sub confluent MSC with ?-MEM containing 20% fetal bovine serum (FBS). The MSC CM were centrifuged and passed through 0.22 ?M filter and stored at -20° C. The CM of HepG-2 cell itself was used as control. The effects of contrast media on proliferation of HepG-2 cells were tested by MTT assay at various concentrations after 24 h of incubation. The cell cycle HepG-2 cells treated with CM at 25%, 50% or 75% was analyzed by flow cytometry (PI staining) using Modfit software LT. The expression of the genes Bcl-2, Bcl-6, CCND1 was analyzed by RT-PCR. Cell proliferation was assessed by the expression of survivin, Bcl-2, Ki-67 and PCNA proteins, and the quantization of mitochondrial by MitoTracker dye, as well as the mitochondrial membrane potential by JC-1 Mitoscreen dye using high content analysis equipment. RESULTS The conditioned media of mesenchymal stem cells (MSC) from adipose tissue (AT-CM) did not alter the proliferation of tumor HepG-2 cells and conditioned media of MSC cells from amniotic fluid (AF-CM) and Wharton jelly (WJ-CM) caused increased proliferation, confirmed by counting cells with nuclei stained with Hoechst 33342. The cell cycle analysis showed that exposure of HepG-2 cells to AF-CM means decrease the cells in G0 / G1 cell cycle phase and increase in phase G2 / M. The expression of Bcl2, Bcl6 and CCND1 genes that are related to proliferation and cell death did not change. The quantization of PCNA and survivin protein did not change under the effect of conditioned media, but a direct comparison between cells treated with AF-CM and AT-CM indicated the tendency of cells treated with AF-CM proliferate. The percentage of HepG-2 cells expressing the protein Ki-67 was significantly lower than the control when treated with AT-CM and no differences when treated with AF-CM and WJ-CM. The counting of mitochondria showed increased mitochondria in HepG-2 cells treated with AF-CM and no significant effect of treatment with WJ-CM and AT-CM. The difference in mitochondrial membrane potential by JC-1 showed an increase in polarization in HepG-2 cells cultured with AT-CM. CONCLUSION The results confirm that mesenchymal stem cells differ according to their tissue origin in its action on the proliferation of HepG-2 cells. More studies are needed to establish the cause of these actions, which seem to be not related to the most common mediators in cell proliferation and death

INTRODUÇÃO O câncer é uma das principais causas de morte no mundo, sendo responsável por cerca de 8 milhões de mortes por ano, segundo dados da OMS. As mortes por câncer são provocadas por tumores que se originam em órgãos como pulmão, fígado, estômago, intestino, mama e esôfago. As células-tronco mesenquimais (CTM) foram identificadas em vários órgãos e estudos da sua interação com células tumorais têm apresentado resultados indicando ação inibitória sobre alguns tipos de tumores. Para explorar essa questão foram analisados os efeitos sobre células tumorais de carcinoma hepatocelular humano (HepG-2) do meio condicionado (MC) obtido do cultivo de CTM isoladas de tecido adiposo (TA), líquido amniótico (LA) e geleia de Wharton (GW). MÉTODOS Os MCs foram coletados após 24 horas de incubação das CTM sub-confluentes com ?-MEM contendo 20% de soro fetal bovino (SFB). Os MCs foram centrifugados e passados através de filtros de 0,22 ?M e armazenadas a -20 °C. O MC da própria célula HepG-2 foi utilizado como controle. Os efeitos dos MCs sobre a proliferação de células HepG-2 foram testados por ensaio MTT, em várias concentrações após 24 h de incubação. O ciclo celular de células HepG-2 tratadas com MC a 25%, 50% ou 75% foi analisado por citometria de fluxo (coloração IP) utilizando o software Modfit LT. A expressão dos genes bcl-2, bcl-6, CCND1 foi analisada por RT-PCR. A proliferação celular foi avaliada pela expressão das proteínas survivina, Bcl-2, PCNA e Ki-67 e pela quantificação de mitocôndrias com corante MitoTracker, assim como pelo potencial de membrana mitocondrial por corante JC-1 Mitoscreen utilizando equipamento de high content analysis. RESULTADOS Os meios condicionados de células-tronco de tecido adiposo (MC-TA) não alteraram a proliferação de células tumorais HepG-2 e os meios condicionados de células-tronco de líquido amniótico (MC-LA) e de geleia de Wharton (MC-GW) provocam aumento da proliferação, confirmada pela contagem de células com núcleos corados com Hoescht 33342. A análise de alterações do ciclo celular demonstrou que a exposição de células HepG-2 aos meios MC-LA diminuem as células na fase G0/G1 e aumentam na fase G2/M do ciclo celular. A expressão dos genes CCND1, Bcl2 e Bcl6 que estão relacionados à proliferação e morte celular não apresentaram alteração. A quantificação das proteínas PCNA e survivina não apresentou alteração sob efeito dos MC, porém a comparação direta entre células tratadas com MC-LA e MC-TA indicou a tendência das células tratadas com MC-LA proliferarem. O percentual de células HepG-2 expressando a proteína Ki-67 foi significativamente menor em relação ao controle quando tratadas com MC-TA, não apresentando diferenças quando tratadas com MC-LA e MC-GW. A contagem de mitocôndrias evidenciou aumento de mitocôndrias nas células HepG-2 tratadas com MC-LA e efeito não significativo dos tratamentos com MC-TA e MC-GW. A diferença do potencial de membrana mitocondrial por JC-1 apresentou aumento da polarização nas células HepG-2 cultivadas com MC-TA. CONCLUSÃO Os resultados confirmam que as células-tronco mesenquimais diferem de acordo com a sua origem tecidual em sua ação na proliferação das células HepG-2. Mais estudos são necessários para estabelecer a causa destas ações, que não parecem ser devido a mediadores mais comuns na proliferação e morte celular / INTRODUCTION Cancer is a leading cause of death worldwide, accounting for about 8 million deaths per year, according to WHO data. Cancer deaths are caused by tumors that originate in organs such as lung, liver, stomach, bowel, breast and esophagus. The mesenchymal stem cells (MSCs) have been identified in many organs and studies of their interaction with tumor cells have shown results indicating an inhibitory effect on some types of tumors. To explore this question the effects of the conditioned medium (CM) obtained from mesenchymal stem cell isolated from adipose tissue (AT), amniotic fluid (AF) and Wharton jelly (WJ) on tumor cells of human hepatocellular carcinoma (HepG-2) were analyzed. METHODS The MSC CM was collected after 24 hours incubation of sub confluent MSC with ?-MEM containing 20% fetal bovine serum (FBS). The MSC CM were centrifuged and passed through 0.22 ?M filter and stored at -20° C. The CM of HepG-2 cell itself was used as control. The effects of contrast media on proliferation of HepG-2 cells were tested by MTT assay at various concentrations after 24 h of incubation. The cell cycle HepG-2 cells treated with CM at 25%, 50% or 75% was analyzed by flow cytometry (PI staining) using Modfit software LT. The expression of the genes Bcl-2, Bcl-6, CCND1 was analyzed by RT-PCR. Cell proliferation was assessed by the expression of survivin, Bcl-2, Ki-67 and PCNA proteins, and the quantization of mitochondrial by MitoTracker dye, as well as the mitochondrial membrane potential by JC-1 Mitoscreen dye using high content analysis equipment. RESULTS The conditioned media of mesenchymal stem cells (MSC) from adipose tissue (AT-CM) did not alter the proliferation of tumor HepG-2 cells and conditioned media of MSC cells from amniotic fluid (AF-CM) and Wharton jelly (WJ-CM) caused increased proliferation, confirmed by counting cells with nuclei stained with Hoechst 33342. The cell cycle analysis showed that exposure of HepG-2 cells to AF-CM means decrease the cells in G0 / G1 cell cycle phase and increase in phase G2 / M. The expression of Bcl2, Bcl6 and CCND1 genes that are related to proliferation and cell death did not change. The quantization of PCNA and survivin protein did not change under the effect of conditioned media, but a direct comparison between cells treated with AF-CM and AT-CM indicated the tendency of cells treated with AF-CM proliferate. The percentage of HepG-2 cells expressing the protein Ki-67 was significantly lower than the control when treated with AT-CM and no differences when treated with AF-CM and WJ-CM. The counting of mitochondria showed increased mitochondria in HepG-2 cells treated with AF-CM and no significant effect of treatment with WJ-CM and AT-CM. The difference in mitochondrial membrane potential by JC-1 showed an increase in polarization in HepG-2 cells cultured with AT-CM. CONCLUSION The results confirm that mesenchymal stem cells differ according to their tissue origin in its action on the proliferation of HepG-2 cells. More studies are needed to establish the cause of these actions, which seem to be not related to the most common mediators in cell proliferation and death

Objetivo:Comparar a eficácia dos meios de cultivo HTF (Human Tubal Fluid) e TCM 199 (Tissue Culture Medium) na maturação in vitro. Métodos:Estudo experimental controlado e randomizado no qual foram avaliadas as taxas de maturação oocitária, fertilização, clivagem e produção de embriões de boa qualidade em 23 ciclos não estimulados de maturação oocitária, com 119 oócitos coletados, de 13 mulheres com Síndrome dos Ovários Policísticos. Os oócitos de cada paciente foram transferidos randomicamente para cada um dos meios de cultivo sendo que, 61 (51%) foram colocados no meio TCM 199 e 58 (49%) no meio HTF. Os dois meios de cultivo receberam suplementação hormonal. Resultados:Diferenças significativas foram encontradas entre os meios de cultivo TCM 199 e HTF em relação à taxa de maturação oocitária (82% vs. 56.9%, p = 0.005), taxa de fertilização (70% vs. 39.4%, p = 0.007) e taxade produção de embriões de boa qualidade (81.3% vs. 41.7%, p= 0.023). Conclusão:O meio de cultivo HTF embora seja utilizado para manutenção de embriões em técnicas de fertilização assistida e em procedimentos de maturação in vitrocom ciclos estimulados, não é o meio mais apropriado paramaturação de oócitos obtidos de mulheres com Síndrome dos Ovários policísticosem ciclos não estimulados. / Objective:Compare oocytes human culture in human tubal fluid (HTF) and Tissue Culture Medium (TCM 199) invitromaturation cycles. Methods:Randomized controlled trial which oocyte maturation, fertilization, cleavage rates and embryo quality in 23 in vitromaturation cycles no stimulation were evaluated, resulting in 119 oocytes retrieved from 13 patients withpolycystic ovarian syndrome. The oocytes from each patient were assigned randomly to the two culture media, 61 (51%) to the TCM 199 and 58 (49%) to the HTF using the same hormonal supplementation. Results:Significant differences were observed between TCM 199 and HTF regarding maturation rate (82% vs. 56.9%, p = 0.005), fertilization rate (70% vs. 39.4%, p = 0.007) rates and embryo quality (81.3% vs. 41.7%, p= 0.023). Conclusion:The HTF medium, although widely employed for oocyte fertilization and embryo maintenance in IVF techniques, is not an appropriated medium to maturation oocytes obtained from PCOS patients innon - stimulated cycles.

Objetivo:Comparar a eficácia dos meios de cultivo HTF (Human Tubal Fluid) e TCM 199 (Tissue Culture Medium) na maturação in vitro. Métodos:Estudo experimental controlado e randomizado no qual foram avaliadas as taxas de maturação oocitária, fertilização, clivagem e produção de embriões de boa qualidade em 23 ciclos não estimulados de maturação oocitária, com 119 oócitos coletados, de 13 mulheres com Síndrome dos Ovários Policísticos. Os oócitos de cada paciente foram transferidos randomicamente para cada um dos meios de cultivo sendo que, 61 (51%) foram colocados no meio TCM 199 e 58 (49%) no meio HTF. Os dois meios de cultivo receberam suplementação hormonal. Resultados:Diferenças significativas foram encontradas entre os meios de cultivo TCM 199 e HTF em relação à taxa de maturação oocitária (82% vs. 56.9%, p = 0.005), taxa de fertilização (70% vs. 39.4%, p = 0.007) e taxade produção de embriões de boa qualidade (81.3% vs. 41.7%, p= 0.023). Conclusão:O meio de cultivo HTF embora seja utilizado para manutenção de embriões em técnicas de fertilização assistida e em procedimentos de maturação in vitrocom ciclos estimulados, não é o meio mais apropriado paramaturação de oócitos obtidos de mulheres com Síndrome dos Ovários policísticosem ciclos não estimulados. / Objective:Compare oocytes human culture in human tubal fluid (HTF) and Tissue Culture Medium (TCM 199) invitromaturation cycles. Methods:Randomized controlled trial which oocyte maturation, fertilization, cleavage rates and embryo quality in 23 in vitromaturation cycles no stimulation were evaluated, resulting in 119 oocytes retrieved from 13 patients withpolycystic ovarian syndrome. The oocytes from each patient were assigned randomly to the two culture media, 61 (51%) to the TCM 199 and 58 (49%) to the HTF using the same hormonal supplementation. Results:Significant differences were observed between TCM 199 and HTF regarding maturation rate (82% vs. 56.9%, p = 0.005), fertilization rate (70% vs. 39.4%, p = 0.007) rates and embryo quality (81.3% vs. 41.7%, p= 0.023). Conclusion:The HTF medium, although widely employed for oocyte fertilization and embryo maintenance in IVF techniques, is not an appropriated medium to maturation oocytes obtained from PCOS patients innon - stimulated cycles.

Submitted by Priscila Nascimento (pnascimento@icict.fiocruz.br) on 2012-11-19T11:45:26Z No. of bitstreams: 1 aline-stelling-zanatta.pdf: 2385669 bytes, checksum: 6f759289878ca2d698465044b392ae3f (MD5) / Made available in DSpace on 2012-11-19T11:45:26Z (GMT). No. of bitstreams: 1 aline-stelling-zanatta.pdf: 2385669 bytes, checksum: 6f759289878ca2d698465044b392ae3f (MD5) Previous issue date: 2009 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto de Tecnologia em Imunobiológicos. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil. / Desde o trabalho de Köhler e Milstein (1975), hibridomas tem sido cultivados para obtenção de anticorpos monoclonais com finalidade de uso em pesquisa, diagnóstico e terapia. O método tradicional de obtenção de anticorpos monoclonais em altas concentrações é através de indução de ascite em camundongos. Estatécnica vem sendo substituída por cultivos de hibridomas em altas concentrações celulares. Neste trabalho, foram cultivados hibridomas secretores de anticorpos monoclonais anti-dengue tipo 2 em frascos T, garrafas rotatórias (roller) e frascos do tipo spinner, utilizando-se o meio DMEM, suplementado com soro fetal bovino a 10%, e o meio comercial livre de soro animal Ex-Cell® TiterHigh TM (Sigma). Ao longo dos diferentes cultivos, foram avaliadas a concentração celular, viabilidade celular e as concentrações de nutrientes (glicose eglutamina), metabólitos (lactato e amônio) e produto (IgG). A partir dos resultados obtidos, foram calculadas as grandezas representativas do metabolismo celular: concentração máxima de células (X máx), taxa específica de crescimento celular (µexp), tempo de duplicação (td) e coeficientes de rendimento de glicose em células (YX/glc), glutamina em células (Y X/gln), células em produto (YP/X), glutamina em amônio (YNH4/gln), glicose em lactato (Ylac/glc), glicose em produto (YP/glc) e glutamina em produto (YP/gln). O meio livre de soro mostrou ser capaz de fornecer melhores condições para o crescimento celular (alcançando 4 x 106 céls/mL), mantendo a viabilidade por um período maior de tempo, nos três sistemas decultivo testados. Quanto à formação de produto, no meio livre de soro, os hibridomas também secretaram altas concentrações de IgG, alcançando níveis de 3 µg/mL. Os melhores resultados de crescimento e viabilidade celular foram observados em garrafas rollera 40 rpm (após adaptação a rotações inferiores) e a produção de IgG foi maior em garrafas rollera 16 rpm (também após adaptação a rotações inferiores) e em frascos do tipo spinner a 50 rpm (após adaptação a rotações inferiores em garrafas rolleraté 40 rpm). Quando foram comparadas as concentrações de IgG entre os sobrenadantes de cultivo e três amostras de fluido ascítico do mesmo hibridoma, foi observado que o fluido ascítico continha concentrações 10 a 20 vezes maiores que as obtidas nos sobrenadantes de cultivo. Entretanto, como os volumes de sobrenadantes de cultivo são significativamente maiores do que os de fluido ascítico de camundongos, infere-se que é viável a substituição da produção in vivopela obtenção do anticorpo monoclonal estudado neste trabalho em sistemas agitados, utilizando-se meio livre de soro animal. Contudo, sugere-se a condução de experimentos adicionais para confirmação da total viabilidade da obtenção de anticorpos monoclonais anti-dengue tipo2 in vitroutilizando o processo proposto no presente trabalho. / Since Köhler and Milstein’s work (1975), hybridoma cells have been cultured to obtain monoclonal antibodies for research, diagnostic and therapeutic purposes. The traditional method to obtain high concentrations (5 to 10 mg/mL) of the monoclonal antibodies is the induction of ascite in mice. This technique is being replaced by high cell density cultivations. In this work, hybridoma secreting anti-dengue type 2 monoclonal antibodies were cultivated in T flasks, roller bottles and spinner flasks, using DMEM medium supplemented with fetal bovine serum at 10%, and the commercial serum-free medium Ex-Cell® TiterHigh TM (Sigma). Cell concentration, cell viability, as well as concentration of nutrients (glucose and glutamine), metabolites (lactate and amonium) and product (IgG) were evaluated along culture time in the different media and culture systems. Based on these data, variables that reflect the cell metabolism were calculated: maximum cell concentration (Xmáx), specific cell growth rate (µexp), duplication time (td), as well as the yield coefficients of glucose to cells (YX/glc), glutamine to cells (YX/gln), cells to product (YP/X), glutamine to ammonium (Y NH4/gln), glucose to lactate (Ylac/glc), glucose to product (YP/glc) and glutamine to product (YP/gln). Among the culture media, the serum-free medium showed to provide better conditions for cell growth (reaching 4 x 106 cells/mL), keeping high cell viabilities for a longer period, in all three tested culture systems. Concerning product formation, hybridoma also released high IgG concentrations (3 µg/mL) in the serum-free medium. Among the culture systems, the best results for cell growth and viability were found inroller bottles at 40 rpm (after adaptation under lower rotation rates) and IgG production was higher in roller bottles at 16 rpm (after adaptation under lower rotation rates) and in spinner flasks at 50 rpm (after adaptation under lower rotation rates in roller bottles, up to 40 rpm). The IgG concentrations ascitic fluid presented concentrations 10 to 20 times higher thanthose obtained in culture supernatants. However, since the volumes of culture supernatant obtained in relatively simple, small-scale culture systems are significantly higher than thoseof mice ascitic fluids, the replacement of in vivoproduction for in vitroIgG production in stirred systems, using serum-free media, seems to be feasible. Nevertheless, additional experiments should be carried out to confirm the feasibility of switching the production of anti-dengue type 2 monoclonal antibodies for in vitrosystems, using the process proposed in this work.