Thesis (Ph.D.). / Written for the Dept. of Biology. Title from title page of PDF (viewed 2008/02/12). Includes bibliographical references.

Thesis (Ph. D.)--University of Washington, 2000. / Vita. Includes bibliographical references (leaves 132-146).

Thesis (Ph. D.)--University of Washington, 1996. / Vita. Includes bibliographical references (leaves [85]-96).

Thesis (Ph. D.)--University of Washington, 2005. / Vita. Includes bibliographical references (leaves 110-123).

Thesis (doctoral)--Ludwig-Maximilians-Universität München, 2006. / Title from PDF t.p. (viewed on May 13, 2006). Includes bibliographical references.

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Mercury (Hg) consists in a heavy metal with toxicological relevance whose contamination is mainly attributed to anthropogenic activities, leading to environmental contamination. It is known that an induction in oxidative stress caused by increased production of reactive oxygen species and/or decrease in antioxidant enzymes activity and a modulation of phosphorylation of proteins that participate in processes of cellular signaling transduction, as Mitogen-Activated Protein Kinases (MAPKs) represent molecular mechanisms implicated in Hg toxicity in rodents and other vertebrates. Studies from the literature have been pointing Drosophila melanogaster as an organism with considerable potential to be used as a bio indicator organism to monitoring the presence of environmental contaminants, presenting biochemical and behavioral effects in response to contaminants similarly to those observed in mammals. Thus, our results showed that HgCl2, when incorporated through the diet with sucrose in D. melanogaster, causes a significant decrease in viability of flies from 24h in a concentration dependent manner. Moreover, after 48h of exposure, the flies treated with Hg 100μM presented deficits in locomotor performance, decrease in the activity of enzymes: acetylcholinesterase (AChE), glutathione peroxidase (GPx) and Superoxide dismutase (SOD), without alteration in catalase activity (CAT). In this study, gene expression of D. melanogaster was evaluated by the method of Real-Time PCR. It was observed that mRNA levels of SOD, CAT and NF-E2-associated factor 2 (Nrf2) were not altered by Hg (II) treatment when compared to the control group, however, Hsp83 expression was10 times increased. Additionally, from 6h of treatment with Hg (II) 100 μM it was verified an induction of lipid peroxidation and oxidative stress, these effects persisted until 48 h of treatment. In the present study, the amount of Hg in the treated and control flies was measured and expressed in μg Hg / g tissue. It was observed that the flies treated for 48h with HgCl2 (100 μM) presented higher levels of Hg than the control group (100 times increase). With regard to the modulation of signaling pathways by Hg (II) treatment, the metal caused an increase in phosphorylation levels of ERK and JNK without altering phosphorylation of p38 as well as the total content of these proteins. Hg (II) exposure caused an induction of PARP cleavage, indicating an induction of apoptotic cell death. In conclusion, the data obtained over this work draw attention to the Hg (II) toxicity and help to extend the knowledge about the mechanisms involved in the toxicity of this metal in invertebrates. In addition, this study points the antioxidant system and modulation of specific signaling transduction pathways as common mechanisms mediating the toxicity of Hg (II) in vertebrates and invertebrates. / O Mercúrio (Hg) é em um metal pesado de relevância toxicológica cuja contaminação ambiental decorre principalmente de atividades antropogênicas. Dentre os mecanismos moleculares envolvidos na toxicidade do Hg estão um aumento na produção de espécies reativas de oxigênio, diminuição na atividade de enzimas antioxidantes e modulação da fosforilação de proteínas que participam de vias de transdução de sinal celular, entre estas as Proteínas Cinases Ativadas por Mitógenos (MAPKs). Estudos apontam Drosophila melanogaster como um organismo que apresenta um considerável potencial para atuar como um bioindicador de contaminantes ambientais, apresentando alterações bioquímicas e comportamentais similares a efeitos observados em mamíferos. Deste modo, nossos resultados demonstraram que o HgCl2, quando incorporado na dieta junto com sacarose em D. melanogaster, causa significativa diminuição da viabilidade das mesmas a partir de 24h de modo dependente de concentração utilizada do composto. Além disso, após 48h de exposição ao Hg(II) as moscas tratadas com concentrações a partir de 100μM obtiveram prejuízos no desempenho locomotor, diminuição na atividade das enzimas: Acetilcolinesterase (Ache), Glutationa Peroxidase (GPx) e Superóxido Dismutase (SOD), não alterando a atividade da Catalase (CAT). Na análise dos genes de D. melanogaster, através do método de Real time-PCR, observou-se que os níveis NF-E2-relacionados fator 2 (Nrf2) não foram alterados em comparação ao grupo controle, sendo que os níveis de HSP83 foram aumentados em 10 vezes. Além disso, a partir de 6h de tratamento as moscas demonstraram indução na peroxidação lipídica e estresse oxidativo efeito este que persistiu até as 48h de tratamento. Na medição dos níveis de Hg, expressa em μg de Hg/g de tecido, observou-se que as moscas tratadas por 48h com HgCl2 apresentaram 100 vezes maiores níveis de Hg em comparação ao grupo controle. Com relação à análise da modulação de MAPKs pelo tratamento com HgCl2 observou-se aumentada fosforilação de JNK e ERK, sem alterar a fosforilação de p38MAPK, bem como o conteúdo total destas proteínas. HgCl2 levou a uma elevação na clivagem da proteína PARP, indicativo da indução de morte celular do tipo apoptótica. Os dados obtidos neste trabalho ressaltam a toxicidade do Hg(II) e estendem o conhecimento sobre seus mecanismos de ação para um modelo animal de invertebrado, além disso, o presente estudo aponta o sistema antioxidante e vias de transdução de sinal celular como mecanismos comuns envolvidos na toxicidade deste metal em vertebrados e invertebrados..

Ces dernières années, de nombreuses études transcriptomiques à grande échelle ont clairement mis en évidence que la grande majorité du génome des eucaryotes est transcrite.Ce réseau complexe de transcrits inclus des petits ARN non codants qui interviennent généralement en tant que régulateurs transcriptionnels, post-transcriptionnels et/ou traductionnels de l’expression de certains ARNm cibles spécifiques. Ils sont classés selon leur origine biologique et leur mode d’action. Une catégorie de petits ARN non codants, les Piwi-interacting RNAs (piRNA), maintient l’intégrité du génome dans les tissus reproducteurs des métazoaires en réprimant les éléments transposables endogènes, des séquences ADN capables de se déplacer et de se dupliquer à l’intérieur du génome. Les piRNA sont produits par deux mécanismes : i) La biogenèse primaire à partir de longs ARN simple brin produits par certains loci spécifiques du génome, les clusters de piRNA, des loci énigmatiques, localisés dans les régions hétérochromatiques et composés de fragments d’éléments transposables actifs, ii) La boucle d’amplification appelée ping-pong. Durant ma thèse, j’ai étudié un cluster de piRNA majeurs dans les cellules somatiques des gonades femelles de Drosophila melanogaster, le locus flamenco. Tout d’abord, j’ai mis en évidence que la transcription de flamenco est initiée à partir d’un promoteur contenant une séquence INR et un élément DPE, reconnu par l’ARN polymerase II, et qu’elle nécessite la présence du facteur de transcription Cubitus Interruptus. Ensuite, j’ai montré que le transcrit de flamenco subit de l’épissage alternatif pour générer divers précurseurs ARN qui seront ensuite maturés en piRNA. De plus, j’ai montré que le promoteur de flamenco serait suffisant pour déclencher l’adressage du transcrit vers la voie de maturation des piRNA. Dans un autre axe, je me suis intéressée à l’organisation tridimensionnelle du locus flamenco au sein du noyau en recherchant ses partenaires d’interaction en utilisant la technique de 4C (capture de la conformation des chromosomes). J’ai pu voir que flamenco semble interagir physiquement avec des régions génomiques fortement transcrites en cis. En trans, le locus flamenco interagit majoritairement avec des régions génomiques péricentromériques et avec d’autres clusters de piRNA. Cette disposition tridimensionnelle particulière pourrait être le reflet d’une organisation fonctionnelle.Dans l’ensemble, ces travaux permettent de mieux comprendre l’expression et le fonctionnement du locus flamenco et ouvrent la voie vers de nouvelles recherches prometteuses. / The past few years it has become clear from many transcriptomic studies that most of the eukaryotic genome is pervasively transcribed. This complex network of transcripts include several types of small RNAs classified as non-coding RNAs. The vast majority of small RNA act as transcriptional, posttranscriptional and/or translational regulators, controlling specific target mRNAs involved in various cellular functions. They are classified based on their biogenesis and mode of action. A subclass of small non-coding RNAs, the Piwi-interacting RNAs (piRNA), ensures genomic stability by silencing endogenous transposable elements, endogenous sequence that are able to move and duplicate into the genome, in both germline and somatic gonadal tissues of metazoan. piRNA are produced through two mechanisms, i) The primary processing pathway from long single-stranded precursors produced by some specific loci in the genome, the piRNA clusters, ii) The secondary pathway by the amplification loop called the ping-pong. piRNA clusters are enigmatic loci localized in heterochromatic region and composed of transposable element fragments.During my PhD, I studied a major piRNA cluster in the somatic cells of Drosophila melanogaster female gonads, the flamenco locus. First, I demonstrated that flamenco transcription is initiated from an RNA Polymerase II promoter containing Inr and DPE elements, and requires the transcription factor, Cubitus interruptus. Then, I showed that the flamenco precursor transcript undergoes differential alternative splicing to generate diverse RNA precursors that are processed into piRNA. Moreover, I showed that the flamenco promoter could be sufficient to target transcripts into the piRNA processing pathway. In an other hand, I was interested to the tridimensional nuclear organization of the flamenco locus using the 4c technology. I saw that the flamenco locus interacts physically with strongly transcribed genomic region in cis. In trans, the flamenco interacts with other peri-centromeric genomic regions and with two other piRNA cluster. This particularly three-dimensional positioning could be the reflect of a functional organization.In the main, this work allows to better understand the expression and the mode ofaction of the flamenco locus and paves the way for new promising research.

Orientadores: Angela Maria Moraes, Paulo de Tarso Vieira e Rosa / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia Quimica / Made available in DSpace on 2018-08-14T08:50:13Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Egydio_JulianaAndrade_M.pdf: 10367421 bytes, checksum: 38511c53be9bd466f1d1a050abd0a1e7 (MD5) Previous issue date: 2009 / Resumo: Nos últimos anos o cultivo de células animais tornou-se uma importante tecnologia de produção de vacinas e proteínas terapêuticas recombinantes. Durante o crescimento in vitro de células animais, alterações nas condições ambientais ótimas do cultivo podem resultar em perda de viabilidade. Uma forma de controlar a apoptose, que é um processo de morte celular programado, é a inclusão de agentes antioxidantes no meio de cultura. O licopeno, cuja principal fonte é o tomate, tem despertado crescente interesse devido às suas propriedades antioxidantes e por apresentar atividade de proteção contra o câncer e doenças do coração. A caracterização da atividade biológica do licopeno in vitro é dificultada pelo fato de que solventes potencialmente tóxicos são empregados para sua obtenção. Assim, a extração de licopeno de tomate empregando CO2 supercrítico, consiste em uma opção atraente. Neste trabalho desenvolveu-se um processo de obtenção de licopeno de suco de tomate a partir de extração com CO2 supercrítico, em diferentes condições de temperatura e pressão, sem a etapa prévia de secagem do material, mas pela substituição de parte da água por etanol. Após a caracterização do extrato quanto à atividade antioxidante, a aplicabilidade do extrato como agente antiapoptótico foi avaliada no cultivo de células animais, especificamente da linhagem Drosophila melanogaster S2. Foram obtidos rendimentos na faixa de 7,7% a 76,9%, com efeito estatisticamente significativo apenas para a temperatura. Através da análise por cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE), observou-se que o licopeno é o principal composto presente nos extratos obtidos, com picos de 82,7% em média. O estudo da atividade antioxidante indicou que o extrato obtido à 40 ºC e 350 bar apresenta maior capacidade antioxidante, de 49,7% pelo método do DPPH_ e 38,2% pelo método do rubreno. Nos ensaios de citotoxicidade, o mesmo extrato não apresentou efeito citotóxico às células S2 em concentrações inferiores a 0,182 mg/mL quando disperso no solvente DMSO, entretanto quando disperso em THF, mostrou-se citotóxico às células. O extrato dissolvido em DMSO apresentou elevado potencial para ser utilizado como agente antiapoptótico no cultivo de células S2, resultando em proteção superior a 92% contra a apoptose induzida por H2O2. / Abstract: In recent years the cultivation of animal cells has become an important technology for the production of vaccines and therapeutic recombinant proteins. During in vitro culture of animal cells, changes in optimum environmental conditions may result in loss of viability. One way to control apoptosis, a process of programmed cell death is the inclusion of antioxidants in the culture medium. Lycopene, whose main source is tomatoes, has attracted increasing interest due to its antioxidant activity and because it can provide protection against cancer and heart diseases. The characterization of the biological activity of lycopene in vitro is complicated by the fact that potentially toxic solvents are used for their production. Thus, the extraction of lycopene from tomatoes using supercritical CO2 is an attractive option. In this work, a process was developed for obtaining lycopene from tomato juice by extraction with supercritical CO2 at different conditions of temperature and pressure, without the prior step of drying the material, but replacing water by ethanol. After characterizing the extract regarding its antioxidant activity, the applicability of the extract as an antiapoptotic agent was evaluated for the cultivation of animal cells, specifically the Drosophila melanogaster S2 cell line. Yields in the range of 7.7% to 76.9% were observed, with statistically significant effect only for the temperature. The analysis by high performance liquid chromatography (HPLC) indicated that lycopene was the main compound present in the extracts obtained, with peaks of 82.7% in average. The extract obtained at 40 ºC and 350 bar showed the highest antioxidant capacity, equal to 49.7% by the DPPH_ method and 38.2% by the rubrene method. The same extract showed no cytotoxic effect on S2 cells concentrations up to 0.182 mg/mL when dispersed in the solvent DMSO, however, when dispersed in THF, it proved to be cytotoxic to cells. The extract dissolved in DMSO showed strong potential to be used as an antiapoptotic agent in the culture of S2 cells, resulting in protection above 92% against apoptosis induced by H2O2. / Mestrado / Desenvolvimento de Processos Biotecnologicos / Mestre em Engenharia Química

Orientador: Louis Bernard Klaczko / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-08T02:56:34Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Silva_LauraHelenaHafnerda_M.pdf: 2141945 bytes, checksum: 17c00d0d744de62b04cc274305caedb5 (MD5) Previous issue date: 2006 / Resumo: O presente trabalho tem como objetivo caracterizar a variação do tamanho e forma das asas de populações de Drosophila melanogaster em três pontos ao longo de uma grande amplitude latitudinal na costa brasileira. O trabalho foi feito a partir de coletas realizadas no Recife, Rio de Janeiro e Porto Alegre, e os seguintes aspectos foram abordados: 1) variação geográfica; 2) variação temporal; 3) herdabilidade; e 4) a influência de inversões cromossômicas. Para este fim, o método da elipse foi aplicado a imagens digitalizadas das asas, e foram analisados: o tamanho das asas, sua forma e as posições dos pontos de junção e das extremidades das veias (caracterizadas por suas coordenadas angulares é radiais, essas padronizadas pelo tamanho da asa). Os resultados obtidos mostraram que a variação de tamanho em D. melanogaster no Brasil segue a tendência mundial de formação de clines latitudinais, com indiv.íduos maiores sendo encontrados a latitudes também maiores. No entanto, a herdabilidade e a variação temporal entre múltiplas coletas realizadas no Recife e no Rio de Janeiro não apresentou um padrão regular nítido. O único efeito consistente e significativo de inversões cromossômicas que pudemos observar foi o de In(3R)Payne sobre o tamanho corporal, sendo também consistente com achados prévios descritos na literatura. Entretanto, não detectamos efeito significativo de interação genótipo-ambiente, quer entre coletas, quer entre localidades / Abstract: The present work aims to characterize the variation of wing size and shape in Drosophila melanogaster populations from three localities distributed along a wide latitudinal range of the Brazilian coast. The work was performed based on collections made in the cities of Recife, Rio de Janeiro and Porto Alegre. The aspects studied were: 1) geographic variation; 2) temporal variation; 3) heritability; and 4) the influence of chromosomal inversions. To this end, the ellipse method was applied to digitized images of the wings. We analyzed wing size, wing shape and the position of vein junctions and extremities (characterized by their angular and radial coordinates, the latter being standardized by wing size). The results obtained showed that size variatiorn in Brazilian D. melanogaster follows the worldwide tendency toward the formation of latitudinal clines, with larger individuaJs being found at higher latitudes. However, the heritability and temporal variation among multiple collections performed in Recife and Rio de Janeiro did not show a clear regular pattern. The only consistent and significant effect of chromosomal inversions that we could observe was that of In(3R)Payne on body size, which is also consistent with previous findings reported in the literature. However, we did not detect a significant effect of genotype-environment interactions, neither among collections, nor among localities / Mestrado / Genetica Animal e Evolução / Mestre em Genética e Biologia Molecular

Orientadores: Angela Maria Moraes, Carlos Augusto Pereira / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia Quimica / Made available in DSpace on 2018-08-09T04:29:58Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Galesi_AdrianaLagesLima_D.pdf: 1381119 bytes, checksum: 756e8fc5c7c30b40f7e2ebe60c293b63 (MD5) Previous issue date: 2007 / Resumo: Células de inseto têm sido freqüentemente empregadas na obtenção de proteínas recombinantes devido a algumas vantagens em relação às células de mamíferos, e a linhagem Drosophila melanogaster Schneider 2 é um dos sistemas de expressão utilizados para este propósito. Entretanto, a literatura é escassa em relação ao metabolismo e ao cultivo destas células, o que motivou o desenvolvimento deste trabalho. O objetivo deste estudo foi determinar, através da técnica estatística de planejamento fatorial de experimentos, um meio de cultura adequado ao crescimento da linhagem Drosophila melanogaster Schneider 2 transfectada para expressão da glicoproteína do vírus da raiva (GPV) e avaliar seu comportamento nos diferentes meios formulados. Para tal, no meio basal TC100, foram estudados os efeitos dos suplementos glicose, glutamina, concentrado protéico de soro de leite, yeastolate (extrato de levedura), hidrolisado de soja, lactoalbumina hidrolisada, emulsão lipídica e Pluronic F68 sobre o crescimento e a viabilidade celular, na tentativa de reduzir o percentual de soro fetal bovino do meio de cultura. A combinação de diferentes suplementos permitiu que o soro fetal bovino fosse eliminado do meio de cultura, principalmente em decorrência da adição de yeastolate, e, em várias das formulações desenvolvidas, a densidade de células foi bastante superior àquela obtida empregando o meio basal TC100 suplementado com 10% de soro fetal bovino. O meio de cultura que resultou no melhor desempenho celular foi formulado com o meio TC100 suplementado com 10 g/L de glicose e 3,5 g/L de glutamina (concentrações finais), 3 g/L de yeastolate, 1% (v/v) de emulsão lipídica e 0,1 % (m/v) de Pluronic F68. Inicialmente, os ensaios realizados em biorreator não reproduziram o crescimento celular obtido em menor escala. Porém, com o aumento da concentração de Pluronic F68 para 0,6%, tal limitação foi contornada. Glicose não foi o substrato limitante nos meios formulados e lactato foi produzido em pequenas quantidades. Apesar de produzido em elevadas concentrações, o amônio não influenciou o crescimento celular. A dosagem da glicoproteína mostrou que as células não perderam sua capacidade de expressão após a adaptação em diferentes meios de cultura e que a produção de GPV no meio formulado é superior à verificada com os meios comerciais SF900 II e TC100 suplementado com 10% de soro fetal bovino / Abstract: Insect cells have been intensively employed to obtain recombinant proteins due to some advantages over mammalian cells, and the Drosophila melanogaster Schneider 2 cell line is one of the expression systems used for this purpose. Nevertheless, literature is scarce with regard to metabolism and culture of these cells, what motivated the development of this work. The aim of this study was to establish an adequate culture medium to cultivate Drosophila melanogaster Schneider 2 cells transfected for the expression of the rabies virus glycoprotein (GPV), and to evaluate their behaviour in different formulated media. For this, the factorial design strategy was employed. The effects of glucose, glutamine, whey protein concentrate, yeastolate, soy hydrolysate, lactoalbumin hydrolysate, lipid emulsion and Pluronic F68 were studied over cell growth and viability, aiming to reduce the fetal bovine serum percentage from the culture medium. Adjusting the concentration of these distinct compounds, serum was eliminated, mainly due to the addition of yeastolate, and cell concentration was higher in several of the developed formulations than that achieved with basal TC100 medium supplemented with 10% of serum. The formulated medium which resulted in best cell performance was composed by TC100 containing 10 g/L of glucose, 3.5 g/L of glutamine, 3 g/L of yeastolate, 1% (v/v) of lipid emulsion and 0.1% (w/v) of Pluronic F68. When in bioreactor, initially the cells did not reproduce the growth behavior observed in smaller scale. However, increasing Pluronic F68 percentage to 0.6%, this limitation was circunvended. Glucose was not the limiting substrate in formulated culture media and lactate was produced in low quantities. Despite ammonium was produced in high concentrations, this compound did not influence cell growth. Glycoprotein quantification shows that cells did not loose their expression capacity after adaptation in the different media, and that glycoprotein production in the formulated medium was higher than that obtained in SF900 II medium and TC100 medium containing 10% of fetal bovine serum / Doutorado / Desenvolvimento de Processos Biotecnologicos / Doutor em Engenharia Química