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Mesenchymal stem cells for cellular cardiomyoplasty : the role of anti-inflammatory cytokinesChen, Guangyong. January 2008 (has links)
BACKGROUND Adult bone marrow derived MSCs had been explored to treat myocardial infarction (MI) and heart failure, for which various beneficial paracrine effects had been suggested. Since MSCs in vitro express anti-inflammatory cytokines, we tested the hypothesis that changes in the pro-/anti-inflammatory cytokine ratio in the infarct microenvironment may provide such a paracrine mechanism to improve early cardiac function following acute coronary occlusion. / Methods Rats (n=88) underwent acute left coronary artery ligations and were randomized into groups M and C and then injected with culture media or MSCs, respectively. These rats underwent blinded echocardiography to evaluate left ventricular ejection fractions (LVEF). Real Time PCR was used to compare cytokine gene expression for IL-1beta, IL-6, IL-8 (pro-inflammatory) and IL-10 (anti-inflammatory) at various times. Extra-cellular matrix (ECM) deposition and inflammatory cell infiltration were also analyzed. / Results As early as 12 hours, the ratio of pro-/anti-inflammatory cytokine gene expression in group C was significantly lower than group M. Similar results were found at 24 hours, 1 and 2 weeks, respectively. LVEF improved significantly in group C (M=62% vs C=68% at 12 hours* , M=66% vs C=75% at 24 hours*, M=57% vs C=75% at 1 week *, and M=52% vs C=70% at 2 weeks*, *p<0.01). The ratio of MMP-2/TIMP1 levels was lower in the Group C at all time frames, reaching significance at 12 and 24 hours and 2 weeks. In group C, histopathological analysis revealed significantly less ECM deposition (M=1.95% vs C=0.75% at 24 hours*, M=19.30% vs C=9.36% at 1 week*, M=24.46% vs C=7.57% at 2 weeks*, *p<0.01). This was associated with significantly decreased inflammatory cell infiltration after 24 hours. / Conclusions The current data suggests that MSCs therapy decreases the pro-/anti-inflammatory cytokine ratio in the infarct microenvironment. This is associated with improved cardiac function, reduced ECM deposition, and decreased inflammatory cell infiltration. This paracrine mechanism of MSCs therapy may explain the early functional improvement after MI before cell transdifferentiation or other mechanisms takes place.
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Immune modulation by mesenchymal stem cells /Rasmusson, Ida, January 2005 (has links)
Diss. (sammanfattning) Stockholm : Karolinska institutet, 2005. / Härtill 5 uppsatser.
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Mesenchymal stem cells for cellular cardiomyoplasty : the role of anti-inflammatory cytokinesChen, Guangyong. January 2008 (has links)
No description available.
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Characterisation of human fetal mesenchymal stem cells /Götherström, Cecilia, January 2004 (has links)
Diss. (sammanfattning) Stockholm : Karol. inst., 2004. / Härtill 5 uppsatser.
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Diferenciação neuronal in vitro de células-tronco mesenquimais humanas para uso em transplante neural / Neuronal differentiation of human mesenchymal stem cells in vitro for neural transplantationLepski, Guilherme Alves 07 August 2007 (has links)
Introdução. O transplante de células é possibilidade terapêutica promissora para muitas doenças neurológicas. Nos últimos anos, a possibilidade do isolamento de células-tronco dos tecidos adultos, por exemplo da medula-óssea, atrai a atenção da comunidade científica, estratégia que minimiza os problemas éticos relativos ao uso de tecido fetal para implantes visando ao tratamento de doenças neurológicas. Entretanto, a eficiência da transdiferenciação de células-tronco mesenquimais em neurônios, bem como os mecanismos envolvidos nesse processo, permanecem desconhecidos. A obtenção de neurônios maduros ocorreu somente em sistemas de co-cultura, o que induz a questão se a diferenciação representa um potencial das células per si, ou se é possível somente devido à fusão com neurônios maduros. Objetivos. No presente trabalho, pretendeu-se verificar o potencial de as células-tronco mesenquimais tornarem-se neurônios e esclarecer os possíveis mecanismos envolvidos nesse processo. Material e métodos. Células-tronco mesenquimais foram isoladas de 20 doadores voluntários normais e caracterizadas por análise de separação celular ativada por fluorescência. A multipotencialidade foi investigada ao se diferenciar as células em condrócitos e osteócitos. A capacidade de auto-renovação foi confirmada pelo ensaio de incorporação de BrdU. Ulteriormente, as células foram diferenciadas por uma semana em meio contendo AMPc, IBMX, ou combinação de ambos, e os resultados foram comparados com o cultivo em meio básico. Diferentes bloqueadores de Ca2+ ou inibidores de PKA foram usados como tentativa de se impedir a diferenciação, ocorrência que foi mensurada com imunocitoquímica para NF-200 (marcador de neurônios maduros). O registro eletrofisiológico por meio de patch clamp foi usado para se confirmar o fenótipo neuronal. As figuras foram configuradas em microscopia confocal. Para análise estatística foi utilizada ANOVA com teste post-hoc. Resultados. As células isoladas expressaram CD90, 105, 44 e 13 mas foram negativas para CD34 e 45. Isto significa que não são de origem hematopoiética; 98,74 ± 0,43% das células incorporaram BrdU em 24 horas. Após o isolamento, foi possível diferenciá-las em condrócitos ou osteócitos. Em situação controle, não foram evidenciadas células positivas para NF200. Por outro lado, ocorreu positividade em 10,75% ± 1,35 (p<0,0001) das células sob IBMX e, em 15,18% ± 1,12, sob a combinação cAMP e IBMX (p<0,0001). Foram registradas correntes de Na+ e K+ dependentes de voltagem, mas não potenciais de ação. A diferenciação foi inibida com PKAi (5,73% ± 0,42, p<0,0001), nifedipina (5,79% ± 0,98, p<0,0001), Ni2+ (7,06% ± 1,68, p<0,0001) e Cd2+ (0 ± 0, p<0,0001). Discussão. Isolou-se uma população de células-tronco estromais da medula-óssea de seres humanos que se mostrou multipotencial e auto-renovável. O aumento da concentração de AMPc no meio elevou a concentração de neurônios para 15%. A diferenciação parece depender da via PKA mas também envolve a concentração intracelular de Ca2+. Conclusão. O correto entendimento de como as células-tronco mesenquimais diferenciam-se pode contribuir para aumentar a eficácia do método e, talvez um dia, tornar possível o uso dessa ferramenta no campo clínico. / Introduction. Cell transplantation has been considered a promising therapeutic approach for many neurological diseases. The possibility of isolation of stem cells from adult tissues, i.e. bone marrow, has attracted the attention of the scientific community in the recent years. This strategy is interesting on avoiding the ethical issues regarding the use of fetal tissue for neural implants. Moreover, the efficiency of the transdifferentiation of mesenchymal stem cells (MSCs) into neurons, and the mechanisms involved in this process remain largely unknown. The obtention of mature neurons was described only in coculture systems, what raised the question if the differentiation is a potential of the cells itself, or if it is possible only due to fusion with mature neurons. Objectives. In the present investigation, we aimed to verify the potential of MSCs to differentiate into neurons, and also to clarify the possible mechanisms involved on it. Material and methods. MSCs were isolated from 20 healthy human subjects and characterized by FACS-analysis. Multipotentiality was addressed by differentiating them into chondrocytes and osteocytes. The self-renewal capacity was confirmed with BrdU-incorporation assay. Afterwards, cells were differentiated for 1 week in a medium containing cAMP, IBMX, or a combination of both, and the results were compared with cells treated in basal-medium condition. Different Ca2+-blockers and PKA-inhibitor peptide were used on an attempt to impair differentiation, which was quantified with NF-200 immunostaining (a marker of mature neurons). Patch-clamp recording was used to confirm neuronal phenotype. Pictures were taken in confocal microscope. For statistical analysis ANOVA with a post-hoc test was used. Results. The isolated cells expressed CD90, 105, 44, and 13, but were negative for CD34 and 45, meaning that they were non-hematopoiethic; 98.74 ± 0.43 % of them incorporated BrdU in 6hs. After isolation, they differentiated into chondrocytes and osteocytes. In a control situation, no NF200 positive cell was seen. On the other hand, 10.75% ± 1.35 (p<.0001) of positivity was seen under IBMX and 15.18% ± 1.12 in the combination of cAMP with IBMX (p<.0001). Na+ and K+-voltage gated currents were recorded. Differentiation was impaired with PKAi (5.73% ± 0.42, p<.0001), nifedipin (5.79% ± 0.98, p<.0001), Ni2+ (7.06% ± 1.68, p<.0001), and Cd2+ (0 ± 0, p<.0001). Discussion. We were able to isolate a population of stromal stem cells from the bone marrow of human subjects, since they were multipotential and self-renewable. Increasing the concentration of cAMP raised the percentage of neurons up to 15%. The differentiation seems to be dependent on the PKA pathway, but also involved the intracellular concentration of Ca2+. Conclusions. The complete understanding of how MSC differentiate can contribute to increase the efficiency of the method and thus make possible to use this powerful tool in the clinical practice.
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Modulação do microambiente periférico pelas células-tronco mesenquimais e meio condicionado na fibrose pulmonar experimental / Modulation of the peripheral microenvironment by mesenchymal stem cells and conditioned medium in experimental lung fibrosisFelix, Renato Gonçalves 29 May 2018 (has links)
Introdução: A fibrose pulmonar idiopática (FPI) é definida como um tipo de doença fibrosante intersticial crônica de etiologia desconhecida limitada aos pulmões e que apresenta padrão histológico de pneumonia intersticial usual. A prevalência de FPI é estimada em, aproximadamente, 20/100.000 em homens e em 13/100.000 em mulheres, sendo que a idade média do diagnóstico é 67 anos e a sobrevivência média é 2 a 5 anos. Estima-se que 5 milhões de pessoas sejam afetadas em todo o mundo. O tratamento clínico atual está associado com melhora parcial e transitória, com resultados duvidosos ou insatisfatórios. Na abordagem cirúrgica da FPI, tem destaque o transplante pulmonar, cuja realização é rara, devido à escassez de doadores e à limitação das equipes capazes de realizar tais procedimentos. A terapia celular é uma alternativa terapêutica com grande potencial de aplicabilidade na fibrose pulmonar. Objetivos: Utilizar um modelo de fibrose pulmonar induzida pela bleomicina em ratos para investigar os efeitos da terapia com células-tronco mesenquimais (CTM) e o meio condicionado no remodelamento pulmonar com objetivo de elucidar o mecanismo de ação das CTM e meio condicionado, na reversão da fibrose pulmonar. Para tanto, buscamos: 1) padronizar a cultura de células-tronco mesenquimais e meio de cultura; 2) caracterizar o modelo experimental de fibrose pulmonar induzida pela bleomicina por microscopia óptica antes e após o tratamento com CTM e meio de cultura; 3) avaliar a expressão de biomarcadores sorológicos (Fibrinogênio, Fator von Willebrand e PDGF); 4) quantificar a expressão de proteínas relacionadas ao estresse oxidativo (NOS), citocinas pró-inflamatórias e pró-fibróticas (IL-17 e TGF-beta) e pró-angiogênicas (VEGF e endotelina) por imuno-histoquímica; e 5) quantificar a deposição de fibras do colágeno I e V por imunofluorescência. Materiais e Métodos: Utilizou-se um total de 44 ratos Wistar machos albinos com peso médio de 250-300g e 8 semanas de idade. Quatro grupos experimentais foram compostos de 10 animais, que participaram do experimento divididos em três momentos: D0, D10 e eutanásia (D14 ou D21). Em D0, foi realizada a instilação orotraqueal de bleomicina na dose de 1,5 U/kg; em D10, foi realizada a infusão em veia caudal de células-tronco mesenquimais na dose de 106 CTM/Kg ou 200 ?l de meio condicionado. Para o preparo das CTM, foi obtido, em média, 1,2 g de tecido adiposo, procedida a dissociação com colagenase tipo I, sendo que a contagem média de células foi de 3,05 x 106 células linfomononucleares/g de tecido adiposo. Estas células foram cultivadas durante 21 dias em meio Knockout DMEM-F12 suplementado com 10% de soro fetal bovino. Os seguintes três critérios foram utilizados para comprovar o perfil das células-tronco mesenquimais: aderência plástica, expressão de CD90 por citometria de fluxo ( > 90%) e capacidade de diferenciação em três linhagens mesodérmicas. Em D10, um pool destas células alogênicas foi infundido intravenosamente, na veia caudal, a uma concentração de 1 x 106 células/ animal num volume de 200 ul de solução salina. Em D14 ou D21, os animais foram eutanasiados e analisados quanto ao peso e conforme análises microscópico-laboratoriais. As análises histológicas foram realizadas por dois especialistas diferentes em estudo duplo-cego. Os parâmetros de ganho de peso e recuperação microscópica do tecido pulmonar foram analisados em cada grupo. Resultados: Nossos dados mostram que as células-tronco mesenquimais oriundas do tecido adiposo abdominal de ratos Wistar tiveram seu perfil fenotípico, capacidade de adesão plástica e diferenciação em 3 linhagens mesodérmicas estabelecidas inequivocamente, conforme estabelecido internacionalmente pela ISSCR. As células-tronco mesenquimais e o meio condicionado induziram: a recuperação clínica após tratamento; a reversão da inflamação e de fibrose pulmonar induzida pela bleomicina; a reversão da arteriopatia no parênquima pulmonar distal; a redução das concentrações de fibrinogênio, fator von Willebrand e PDGF (marcadores sorológicos); a diminuição da expressão de enzimas oxidantes; a diminuição da expressão de endotelina e a modulação da expressão da proteína de remodelamento (IL-17), da ativação dos fibroblastos TGF-B e da síntese de colágeno. Conclusão: Neste estudo, comprovamos que as terapias com células-tronco mesenquimais derivadas do tecido adiposo e com o meio condicionado foram eficazes na modulação dos processos inflamatórios e fibrogênicos no modelo induzido por bleomicina, agindo na ativação miofibroblástica, e, também, na restauração tecidual e endotelial. Além disso, o meio condicionado se mostrou tão eficiente quanto as células-tronco propriamente ditas, no efetivo remodelamento pulmonar, devendo ser considerado como uma proposta terapêutica viável e inovadora / Introduction: Idiopathic pulmonary fibrosis (IPF) is defined as a type of chronic interstitial fibrosing disease of unknown etiology limited to the lungs and presenting a histological pattern of usual interstitial pneumonia. The prevalence of IPF is estimated at approximately 20/100,000 in men and 13/100,000 in women, with the mean age of diagnosis being 67 years and the average survival is 2 to 5 years. It is estimated that 5 million people are affected worldwide. The current clinical treatment is associated with partial and transient improvement, with dubious or unsatisfactory results. In the surgical approach to IPF, pulmonary transplantation is a prominent feature, which is rare because of the scarcity of donors and the limitation of the teams capable of performing such procedures. Cell therapy is a therapeutic alternative with great potential for applicability in pulmonary fibrosis. Objectives: To use a model of bleomycin-induced lung fibrosis in rats to investigate the effects of mesenchymal stem cell (MSC) therapy and conditioned medium on lung remodeling in order to elucidate the mechanism of action of MSC and conditioned medium, in the reversion of pulmonary fibrosis. To do so, we aim to: 1) standardize the culture of mesenchymal stem cells and conditioned medium; 2) characterize the experimental model of lung fibrosis induced by bleomycin by optical microscopy before and after treatment with MSC and conditioned medium; 3) to evaluate the expression of serological biomarkers (Fibrinogen, Factor von Willebrand and PDGF); 4) to quantify the expression of proteins related to oxidative stress (NOS), pro-inflammatory and pro-fibrotic (IL-17 and TGF-beta) and pro-angiogenic cytokines (VEGF and endothelin) by immunohistochemistry; and 5) to quantify the deposition of collagen I and V fibers by immunofluorescence. Materials and methods: A total of 44 male albino Wistar rats weighing 250-300g and 8 weeks of age were used. Four experimental groups were composed of 10 animals, which participated in the experiment divided in three moments: D0, D10 and euthanasia (D14 or D21). In D0, orotracheal instillation of bleomycin at the dose of 1.5 U/ kg was performed; in D10 caudal vein infusion of mesenchymal stem cells at the dose of 106 MSC/ kg or 200 ul of conditioned medium was performed. To prepare the MSC, a mean of 1.2 g of adipose tissue was obtained, dissociated with type I collagenase and the mean cell count was 3.05 x 106 lymphomonuclear cells / g of adipose tissue. These cells were cultured for 21 days in DMEM-F12 Knockout medium supplemented with 10% fetal bovine serum. The following three criteria were used to prove the profile of mesenchymal stem cells: plastic adherence, expression of CD90 by flow cytometry ( > 90%) and differentiation capacity in three mesodermal lines. In D10, a pool of these allogeneic cells was infused intravenously into the caudal vein at a concentration of 1 x 106 cells / animal in a volume of 200 ul of saline. In D14 or D21 the animals were euthanized and analyzed for weight and microscopic-laboratory analyzes. Histological analyzes were performed by two different specialists in a double-blind study. The parameters of weight gain and microscopic recovery of lung tissue were analyzed in each group. Results: Our data show that the mesenchymal stem cells derived from the abdominal adipose tissue of Wistar rats had their phenotypic profile, plastic adhesion capacity and differentiation in 3 mesodermal lines established unequivocally, as established internationally by ISSCR. Mesenchymal stem cells and conditioned medium induced: clinical recovery after treatment; bleomycin-induced reversal of inflammation and pulmonary fibrosis; the reversal of arteriopathy in the distal pulmonary parenchyma; the reduction of fibrinogen, von Willebrand factor and PDGF concentrations (serologic markers); decreased expression of oxidizing enzymes; the reduction of endothelin expression and the modulation of the expression of the remodeling protein (IL-17), the activation of TGF-B fibroblasts and the synthesis of collagen. Conclusion: In this study we demonstrated that therapies with mesenchymal stem cells derived from adipose tissue and conditioned medium were effective in the modulation of inflammatory and fibrogenic processes in the bleomycin-induced model, acting to modulate myofibroblastic activation and also in tissue restoration and endothelial cells. In addition, the conditioned medium proved to be as efficient as the stem cells themselves, in effective pulmonary remodeling, and should be considered as a viable and innovative therapeutic proposal
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Modulação do microambiente periférico pelas células-tronco mesenquimais e meio condicionado na fibrose pulmonar experimental / Modulation of the peripheral microenvironment by mesenchymal stem cells and conditioned medium in experimental lung fibrosisRenato Gonçalves Felix 29 May 2018 (has links)
Introdução: A fibrose pulmonar idiopática (FPI) é definida como um tipo de doença fibrosante intersticial crônica de etiologia desconhecida limitada aos pulmões e que apresenta padrão histológico de pneumonia intersticial usual. A prevalência de FPI é estimada em, aproximadamente, 20/100.000 em homens e em 13/100.000 em mulheres, sendo que a idade média do diagnóstico é 67 anos e a sobrevivência média é 2 a 5 anos. Estima-se que 5 milhões de pessoas sejam afetadas em todo o mundo. O tratamento clínico atual está associado com melhora parcial e transitória, com resultados duvidosos ou insatisfatórios. Na abordagem cirúrgica da FPI, tem destaque o transplante pulmonar, cuja realização é rara, devido à escassez de doadores e à limitação das equipes capazes de realizar tais procedimentos. A terapia celular é uma alternativa terapêutica com grande potencial de aplicabilidade na fibrose pulmonar. Objetivos: Utilizar um modelo de fibrose pulmonar induzida pela bleomicina em ratos para investigar os efeitos da terapia com células-tronco mesenquimais (CTM) e o meio condicionado no remodelamento pulmonar com objetivo de elucidar o mecanismo de ação das CTM e meio condicionado, na reversão da fibrose pulmonar. Para tanto, buscamos: 1) padronizar a cultura de células-tronco mesenquimais e meio de cultura; 2) caracterizar o modelo experimental de fibrose pulmonar induzida pela bleomicina por microscopia óptica antes e após o tratamento com CTM e meio de cultura; 3) avaliar a expressão de biomarcadores sorológicos (Fibrinogênio, Fator von Willebrand e PDGF); 4) quantificar a expressão de proteínas relacionadas ao estresse oxidativo (NOS), citocinas pró-inflamatórias e pró-fibróticas (IL-17 e TGF-beta) e pró-angiogênicas (VEGF e endotelina) por imuno-histoquímica; e 5) quantificar a deposição de fibras do colágeno I e V por imunofluorescência. Materiais e Métodos: Utilizou-se um total de 44 ratos Wistar machos albinos com peso médio de 250-300g e 8 semanas de idade. Quatro grupos experimentais foram compostos de 10 animais, que participaram do experimento divididos em três momentos: D0, D10 e eutanásia (D14 ou D21). Em D0, foi realizada a instilação orotraqueal de bleomicina na dose de 1,5 U/kg; em D10, foi realizada a infusão em veia caudal de células-tronco mesenquimais na dose de 106 CTM/Kg ou 200 ?l de meio condicionado. Para o preparo das CTM, foi obtido, em média, 1,2 g de tecido adiposo, procedida a dissociação com colagenase tipo I, sendo que a contagem média de células foi de 3,05 x 106 células linfomononucleares/g de tecido adiposo. Estas células foram cultivadas durante 21 dias em meio Knockout DMEM-F12 suplementado com 10% de soro fetal bovino. Os seguintes três critérios foram utilizados para comprovar o perfil das células-tronco mesenquimais: aderência plástica, expressão de CD90 por citometria de fluxo ( > 90%) e capacidade de diferenciação em três linhagens mesodérmicas. Em D10, um pool destas células alogênicas foi infundido intravenosamente, na veia caudal, a uma concentração de 1 x 106 células/ animal num volume de 200 ul de solução salina. Em D14 ou D21, os animais foram eutanasiados e analisados quanto ao peso e conforme análises microscópico-laboratoriais. As análises histológicas foram realizadas por dois especialistas diferentes em estudo duplo-cego. Os parâmetros de ganho de peso e recuperação microscópica do tecido pulmonar foram analisados em cada grupo. Resultados: Nossos dados mostram que as células-tronco mesenquimais oriundas do tecido adiposo abdominal de ratos Wistar tiveram seu perfil fenotípico, capacidade de adesão plástica e diferenciação em 3 linhagens mesodérmicas estabelecidas inequivocamente, conforme estabelecido internacionalmente pela ISSCR. As células-tronco mesenquimais e o meio condicionado induziram: a recuperação clínica após tratamento; a reversão da inflamação e de fibrose pulmonar induzida pela bleomicina; a reversão da arteriopatia no parênquima pulmonar distal; a redução das concentrações de fibrinogênio, fator von Willebrand e PDGF (marcadores sorológicos); a diminuição da expressão de enzimas oxidantes; a diminuição da expressão de endotelina e a modulação da expressão da proteína de remodelamento (IL-17), da ativação dos fibroblastos TGF-B e da síntese de colágeno. Conclusão: Neste estudo, comprovamos que as terapias com células-tronco mesenquimais derivadas do tecido adiposo e com o meio condicionado foram eficazes na modulação dos processos inflamatórios e fibrogênicos no modelo induzido por bleomicina, agindo na ativação miofibroblástica, e, também, na restauração tecidual e endotelial. Além disso, o meio condicionado se mostrou tão eficiente quanto as células-tronco propriamente ditas, no efetivo remodelamento pulmonar, devendo ser considerado como uma proposta terapêutica viável e inovadora / Introduction: Idiopathic pulmonary fibrosis (IPF) is defined as a type of chronic interstitial fibrosing disease of unknown etiology limited to the lungs and presenting a histological pattern of usual interstitial pneumonia. The prevalence of IPF is estimated at approximately 20/100,000 in men and 13/100,000 in women, with the mean age of diagnosis being 67 years and the average survival is 2 to 5 years. It is estimated that 5 million people are affected worldwide. The current clinical treatment is associated with partial and transient improvement, with dubious or unsatisfactory results. In the surgical approach to IPF, pulmonary transplantation is a prominent feature, which is rare because of the scarcity of donors and the limitation of the teams capable of performing such procedures. Cell therapy is a therapeutic alternative with great potential for applicability in pulmonary fibrosis. Objectives: To use a model of bleomycin-induced lung fibrosis in rats to investigate the effects of mesenchymal stem cell (MSC) therapy and conditioned medium on lung remodeling in order to elucidate the mechanism of action of MSC and conditioned medium, in the reversion of pulmonary fibrosis. To do so, we aim to: 1) standardize the culture of mesenchymal stem cells and conditioned medium; 2) characterize the experimental model of lung fibrosis induced by bleomycin by optical microscopy before and after treatment with MSC and conditioned medium; 3) to evaluate the expression of serological biomarkers (Fibrinogen, Factor von Willebrand and PDGF); 4) to quantify the expression of proteins related to oxidative stress (NOS), pro-inflammatory and pro-fibrotic (IL-17 and TGF-beta) and pro-angiogenic cytokines (VEGF and endothelin) by immunohistochemistry; and 5) to quantify the deposition of collagen I and V fibers by immunofluorescence. Materials and methods: A total of 44 male albino Wistar rats weighing 250-300g and 8 weeks of age were used. Four experimental groups were composed of 10 animals, which participated in the experiment divided in three moments: D0, D10 and euthanasia (D14 or D21). In D0, orotracheal instillation of bleomycin at the dose of 1.5 U/ kg was performed; in D10 caudal vein infusion of mesenchymal stem cells at the dose of 106 MSC/ kg or 200 ul of conditioned medium was performed. To prepare the MSC, a mean of 1.2 g of adipose tissue was obtained, dissociated with type I collagenase and the mean cell count was 3.05 x 106 lymphomonuclear cells / g of adipose tissue. These cells were cultured for 21 days in DMEM-F12 Knockout medium supplemented with 10% fetal bovine serum. The following three criteria were used to prove the profile of mesenchymal stem cells: plastic adherence, expression of CD90 by flow cytometry ( > 90%) and differentiation capacity in three mesodermal lines. In D10, a pool of these allogeneic cells was infused intravenously into the caudal vein at a concentration of 1 x 106 cells / animal in a volume of 200 ul of saline. In D14 or D21 the animals were euthanized and analyzed for weight and microscopic-laboratory analyzes. Histological analyzes were performed by two different specialists in a double-blind study. The parameters of weight gain and microscopic recovery of lung tissue were analyzed in each group. Results: Our data show that the mesenchymal stem cells derived from the abdominal adipose tissue of Wistar rats had their phenotypic profile, plastic adhesion capacity and differentiation in 3 mesodermal lines established unequivocally, as established internationally by ISSCR. Mesenchymal stem cells and conditioned medium induced: clinical recovery after treatment; bleomycin-induced reversal of inflammation and pulmonary fibrosis; the reversal of arteriopathy in the distal pulmonary parenchyma; the reduction of fibrinogen, von Willebrand factor and PDGF concentrations (serologic markers); decreased expression of oxidizing enzymes; the reduction of endothelin expression and the modulation of the expression of the remodeling protein (IL-17), the activation of TGF-B fibroblasts and the synthesis of collagen. Conclusion: In this study we demonstrated that therapies with mesenchymal stem cells derived from adipose tissue and conditioned medium were effective in the modulation of inflammatory and fibrogenic processes in the bleomycin-induced model, acting to modulate myofibroblastic activation and also in tissue restoration and endothelial cells. In addition, the conditioned medium proved to be as efficient as the stem cells themselves, in effective pulmonary remodeling, and should be considered as a viable and innovative therapeutic proposal
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Diferenciação neuronal in vitro de células-tronco mesenquimais humanas para uso em transplante neural / Neuronal differentiation of human mesenchymal stem cells in vitro for neural transplantationGuilherme Alves Lepski 07 August 2007 (has links)
Introdução. O transplante de células é possibilidade terapêutica promissora para muitas doenças neurológicas. Nos últimos anos, a possibilidade do isolamento de células-tronco dos tecidos adultos, por exemplo da medula-óssea, atrai a atenção da comunidade científica, estratégia que minimiza os problemas éticos relativos ao uso de tecido fetal para implantes visando ao tratamento de doenças neurológicas. Entretanto, a eficiência da transdiferenciação de células-tronco mesenquimais em neurônios, bem como os mecanismos envolvidos nesse processo, permanecem desconhecidos. A obtenção de neurônios maduros ocorreu somente em sistemas de co-cultura, o que induz a questão se a diferenciação representa um potencial das células per si, ou se é possível somente devido à fusão com neurônios maduros. Objetivos. No presente trabalho, pretendeu-se verificar o potencial de as células-tronco mesenquimais tornarem-se neurônios e esclarecer os possíveis mecanismos envolvidos nesse processo. Material e métodos. Células-tronco mesenquimais foram isoladas de 20 doadores voluntários normais e caracterizadas por análise de separação celular ativada por fluorescência. A multipotencialidade foi investigada ao se diferenciar as células em condrócitos e osteócitos. A capacidade de auto-renovação foi confirmada pelo ensaio de incorporação de BrdU. Ulteriormente, as células foram diferenciadas por uma semana em meio contendo AMPc, IBMX, ou combinação de ambos, e os resultados foram comparados com o cultivo em meio básico. Diferentes bloqueadores de Ca2+ ou inibidores de PKA foram usados como tentativa de se impedir a diferenciação, ocorrência que foi mensurada com imunocitoquímica para NF-200 (marcador de neurônios maduros). O registro eletrofisiológico por meio de patch clamp foi usado para se confirmar o fenótipo neuronal. As figuras foram configuradas em microscopia confocal. Para análise estatística foi utilizada ANOVA com teste post-hoc. Resultados. As células isoladas expressaram CD90, 105, 44 e 13 mas foram negativas para CD34 e 45. Isto significa que não são de origem hematopoiética; 98,74 ± 0,43% das células incorporaram BrdU em 24 horas. Após o isolamento, foi possível diferenciá-las em condrócitos ou osteócitos. Em situação controle, não foram evidenciadas células positivas para NF200. Por outro lado, ocorreu positividade em 10,75% ± 1,35 (p<0,0001) das células sob IBMX e, em 15,18% ± 1,12, sob a combinação cAMP e IBMX (p<0,0001). Foram registradas correntes de Na+ e K+ dependentes de voltagem, mas não potenciais de ação. A diferenciação foi inibida com PKAi (5,73% ± 0,42, p<0,0001), nifedipina (5,79% ± 0,98, p<0,0001), Ni2+ (7,06% ± 1,68, p<0,0001) e Cd2+ (0 ± 0, p<0,0001). Discussão. Isolou-se uma população de células-tronco estromais da medula-óssea de seres humanos que se mostrou multipotencial e auto-renovável. O aumento da concentração de AMPc no meio elevou a concentração de neurônios para 15%. A diferenciação parece depender da via PKA mas também envolve a concentração intracelular de Ca2+. Conclusão. O correto entendimento de como as células-tronco mesenquimais diferenciam-se pode contribuir para aumentar a eficácia do método e, talvez um dia, tornar possível o uso dessa ferramenta no campo clínico. / Introduction. Cell transplantation has been considered a promising therapeutic approach for many neurological diseases. The possibility of isolation of stem cells from adult tissues, i.e. bone marrow, has attracted the attention of the scientific community in the recent years. This strategy is interesting on avoiding the ethical issues regarding the use of fetal tissue for neural implants. Moreover, the efficiency of the transdifferentiation of mesenchymal stem cells (MSCs) into neurons, and the mechanisms involved in this process remain largely unknown. The obtention of mature neurons was described only in coculture systems, what raised the question if the differentiation is a potential of the cells itself, or if it is possible only due to fusion with mature neurons. Objectives. In the present investigation, we aimed to verify the potential of MSCs to differentiate into neurons, and also to clarify the possible mechanisms involved on it. Material and methods. MSCs were isolated from 20 healthy human subjects and characterized by FACS-analysis. Multipotentiality was addressed by differentiating them into chondrocytes and osteocytes. The self-renewal capacity was confirmed with BrdU-incorporation assay. Afterwards, cells were differentiated for 1 week in a medium containing cAMP, IBMX, or a combination of both, and the results were compared with cells treated in basal-medium condition. Different Ca2+-blockers and PKA-inhibitor peptide were used on an attempt to impair differentiation, which was quantified with NF-200 immunostaining (a marker of mature neurons). Patch-clamp recording was used to confirm neuronal phenotype. Pictures were taken in confocal microscope. For statistical analysis ANOVA with a post-hoc test was used. Results. The isolated cells expressed CD90, 105, 44, and 13, but were negative for CD34 and 45, meaning that they were non-hematopoiethic; 98.74 ± 0.43 % of them incorporated BrdU in 6hs. After isolation, they differentiated into chondrocytes and osteocytes. In a control situation, no NF200 positive cell was seen. On the other hand, 10.75% ± 1.35 (p<.0001) of positivity was seen under IBMX and 15.18% ± 1.12 in the combination of cAMP with IBMX (p<.0001). Na+ and K+-voltage gated currents were recorded. Differentiation was impaired with PKAi (5.73% ± 0.42, p<.0001), nifedipin (5.79% ± 0.98, p<.0001), Ni2+ (7.06% ± 1.68, p<.0001), and Cd2+ (0 ± 0, p<.0001). Discussion. We were able to isolate a population of stromal stem cells from the bone marrow of human subjects, since they were multipotential and self-renewable. Increasing the concentration of cAMP raised the percentage of neurons up to 15%. The differentiation seems to be dependent on the PKA pathway, but also involved the intracellular concentration of Ca2+. Conclusions. The complete understanding of how MSC differentiate can contribute to increase the efficiency of the method and thus make possible to use this powerful tool in the clinical practice.
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Reconstrução de defeitos ósseos cranianos em ratos com células-tronco de polpa dentária humana: estudo experimental de neoformação óssea / Reconstruction of cranial defects in rats with human dental pulp stem cells: experimental design of bone regenerationCosta, André de Mendonça 15 December 2009 (has links)
Os defeitos da calota craniana causados por traumas severos, neoplasias, cirurgias ou deformidades congênitas representam um grande desafio para os cirurgiões. O uso de enxertia óssea autóloga continua sendo o método de tratamento padrão ouro, embora apresente morbidade na área doadora e seja considerado insuficiente para reconstrução de grandes defeitos. Recentemente, com o advento da bioengenharia tecidual, novas expectativas surgiram na regeneração óssea. O objetivo deste estudo foi desenvolver um modelo experimental em ratos para o estudo de deformidades craniofaciais e verificar se as células-tronco humanas provenientes de dentes decíduos seriam capazes de regenerar defeitos críticos em calota craniana de ratos não imunossuprimidos. Foram realizados dois defeitos ósseos de espessura total com diâmetro de 5 x 8 mm na região biparietal. O lado esquerdo foi preenchido com membrana de colágeno, enquanto o lado direito com membrana de colágeno associada a células-tronco humanas provenientes de dentes decíduos. Essas células foram caracterizadas previamente in vitro como células mesenquimais. A eutanásia dos animais foi realizada no 7º, 21º, 30º e 60º dia de pós-operatório e amostras de tecido ósseo foram extraídas para realização da análise histológica. A análise da presença de células humanas no novo osso formado foi confirmada através do estudo molecular. A linhagem de células-tronco humanas provenientes de dentes decíduos foi positiva para células-tronco mesenquimais e sua diferenciação em tecido ósseo também foi evidenciada in vitro. Foi observada a formação óssea após 21 dias de cirurgia nos dois lados, sendo o lado direito um osso mais maduro. A reação da cadeia de polimerase para DNA humano foi amplificada apenas no lado direito demonstrando que existiam células humanas nesse novo osso formado. O uso de células-tronco de dentes decíduos humanas em ratos não imunossuprimidos não evidenciou rejeição durante o período estudado. Os achados sugerem que o modelo experimental descrito poderá ser utilizado para o estudo dos defeitos ósseos cranianos em cirurgia craniofacial e que o uso de células-tronco humanas provenientes de dentes decíduos associado à membrana de colágeno parece representar uma importante estratégia para a reconstrução de tecidos ósseos e seu uso pode ser considerado uma opção para o reparo de grandes defeitos ósseos cranianos. / Repair of bone defects caused by severe trauma, resection of tumors, and congenital deformity remains a big challenge to surgeons. As a gold standard for the treatment of bone defects in clinic, autologous bone grafts are usually limited by considerable donor site mobility and available supply of tissue that can be harvested. Recently, tissue engineering has become a promising approach for bone regeneration. The main aim of this study is to create an experimental surgical protocol and evaluate the capacity of human dental pulp stem cells isolated from deciduous teeth, to reconstruct critical size cranial bone defects in nonimmunosuppressed rats. Bilateral 5 x 8 mm cranial full-thickness defects of parietal bone were created. The left side was supplied with collagen membrane only and the right side with collagen membrane and human dental pulp stem cells. Cells were used after in vitro characterization as mesenchymal cells. Animals were euthanized at 7, 21, 30 and 60 days postoperatively and cranial tissue samples were taken from the defects for histologic analysis. Analysis of the presence of human cells in the new bone was confirmed by molecular analysis. The human dental pulp stem cells lineage was positive for the four mesenchymal cell markers tested and showed osteogenic in vitro differentiation. The bone formation was observed 21 days after surgery on both sides, but a more mature bone was present in the right side. Human DNA was polymerase chain reaction-amplified only at the right side, indicating that this new bone had human cells. The use of human dental pulp stem cells in nonimmunosuppressed rats did not cause any graft rejection during this period. Our findings suggest that surgical protocol created may ultimately be used in experimental studies of cranial bone defects in craniofacial surgery and the use of human dental pulp stem cells together with collagen membrane seems to be a promising strategy for in vivo bone tissue reconstruction and their use might provide an option to repair human large cranial bone defects.
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Efeito das células-tronco pluripotentes induzidas (iPS) no tratamento da insuficiência renal crônica experimentalDias, Cinthia 25 August 2015 (has links)
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Previous issue date: 2015-08-25 / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo - FAPESP / Introduction: Stem cell therapy is a promising strategy to repair or delay the progression of chronic renal failure (CRF). Induced pluripotent stem cells (iPS) can be a therapeutic alternative due to their differentiation potential. Objectives: 1- To modify genetically stem cells from mice´s fibroblasts with lentiviral vectors containing transcription factors, transforming differentiated cells into iPS; 2- To evaluate the effect of iPS in the experimental IRC progression of IRC induced by 5/6 nephrectomy (CRF-5/6). Materials and Methods: The animals were divided according to the type of cell therapy received from extracted mesenchymal stem cells from bone marrow (MSC) or iPS and compared with CRF group 5/6 without treatment. Assessment of renal function was carried out during baseline and after 60 days. Additionally expression of genes, VEGF, IL-6, TGF-β and IL-10 were quantified in the kidney tissue, and also the analysis of implanted cell migration through the SRY gene. Immunohistochemical study evaluated the expression of CD68, α-SMA, TGF-β, PCNA and VEGF markers. Results: A significant decrease was observed in creatinine variation (p<0.05) and plasma urea (p<0.01) in animals treated with MSC and a 33%-decrease in plasma creatinine levels of animals treated with iPS cells, although non- significant when compared to the control group. The 24-hour proteinuria was significantly reduced only in the iPS group (p<0.0001). Significant improvement was observed in creatinine clearance in both treatments (p<0.04). Disease progression measured by the clearance decline rate was significantly lower only in the MSC group (p<0.05) and the urinary osmolality was similar in both treated groups. There was an increase in the expression of TGF- β gene in iPS group when compared to the control group (p<0.05) and VEGF expression in the groups treated with iPS and MSC (p<0.05). IL-6 and IL-10 showed similar expression levels in both treated groups (p=NS). Immunohistochemical analysis showed fewer macrophages and decreased cell proliferative activity (PCNA) in the iPS group p<0.05. Histological analysis showed a significant decrease in glomerulosclerosis in both treatment groups (p<0.01), tubular atrophy was similar in all groups . Leukocyte infiltration was reduced in both treatments when compared to CRF group. The SRY gene was detected in 5 out of 8 (62.5%) mice that were treated with iPS. After 60 days the tumor formations were observed in animals in which SRY gene was detected. Conclusions: MSC therapy is effective in delaying the progression of CKD. Treatment with iPS also improves some parameters of renal function but this assessment can be difficult since the onset of tumor formations; thus some care is necessary with this type of cells. / Introdução: A terapia com células-tronco (CT) é uma estratégia promissora para reparar ou retardar a progressão da insuficiência renal crônica (IRC). As células-tronco pluripotentes induzidas (iPS) podem ser uma alternativa terapêutica, em virtude de seu potencial de diferenciação. Objetivos: 1) Modificar geneticamente células de fibroblastos de ratos com vetores lentivirais contendo fatores de transcrição, transformando essas células diferenciadas em iPS; 2) Avaliar o efeito das iPS e CTM na progressão da IRC experimental induzida pela nefrectomia 5/6 (CRF5/6). Materiais e Métodos: Os animais foram divididos conforme o tipo de terapia celular recebida (célula-tronco mesenquimal extraída da medula óssea (CTM) ou com iPS) e comparados com o grupo CRF5/6. A avaliação da função renal foi realizada no período basal e após 60 dias. Adicionalmente foi quantificada a expressão dos genes, VEGF, IL-6, TGF-β e IL-10 no tecido renal e estudada a migração das células implantadas contendo o gene SRY. O estudo imunohistoquímico avaliou a expressão de marcadores CD68, α-SMA, TGF-β, PCNA e VEGF. Resultados: Redução significativa foi observada na variação da creatinina (p<0,05) e ureia plasmática (p<0,01) dos animais tratados com CTM e uma diminuição de 33% dos níveis de creatinina plasmática nos animais tratados com células iPS, porém sem significância estatística quando comparada ao grupo controle. A proteinúria de 24 horas foi reduzida somente no grupo iPS (p=0,0001) e houve melhora significativa no clearance de creatinina com ambos tratamentos (p=0,04). A progressão da doença, medida pela taxa de declínio do clearance de creatinina, foi significativamente lentificada somente no grupo CTM (p=0,04) e a osmolalidade urinária foi similar em ambos os grupos tratados. Houve aumento na expressão do gene TGF-β no grupo iPS quando comparado ao grupo controle (p=0,01) e da expressão de VEGF nos grupos tratados com iPS e CTM (p=0,01). IL-6 e IL-10 mostraram níveis de expressão semelhantes em ambos os grupos tratados (p=NS). A análise imunohistoquímica demonstrou menor número de macrófagos e diminuição da atividade proliferativa celular (PCNA) no grupo iPS p<0,05. A analise histológica mostrou diminuição significativa da glomeruloesclerose em ambos grupos tratados (p<0,01), a atrofia tubular foi semelhante nos três grupos. A infiltração leucocitária foi reduzida em ambos os tratamentos, quando comparados ao grupo CRF. O gene SRY foi detectado em 5 de 8 (62,5%) ratos que receberam tratamento com iPS. Após 60 dias foram observadas as formações tumorais nos respectivos animais em que o gene SRY foi detectado. Conclusões: A terapia com CTM é eficiente para retardar a progressão da IRC. Tratamento com iPS também melhora alguns parâmetros da função renal, mas o aparecimento de formações tumorais dificulta essa avaliação e requer cuidados com esse tipo de célula.
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