This PhD Thesis deals with the study of marine natural products as candidates in either drug discovery and development. In particular, the investigation focused on benthic organisms, i.e. those fixed or in a close relation with the sea bottom. These organisms, many of which are sessile or slow-moving invertebrates, thus unable to escape quickly from their predators, and devoid of physical protection (shell or hard texture), have developed alternative protective strategies as well as the production of chemical weapons. Compounds involved in the chemical defence, besides the ecological function, can display interesting pharmacological activities. Organisms of different phyla (Algae, Molluscs and Cnidarians) and from diverse geographical areas (Mediterranean Sea and China) were investigated. The benthic diatom Cocconeis scutellum is able to affect the sex reversal in the protandric shrimp Hippolyte inermis, inducing apoptosis (programmed cell death) in the crustacean's androgenic gland. Thus, we wondered whether these diatoms could act also in other crustaceans and on human cancer cells, in order to evaluate their applications in aquaculture and medicine. In fact, some commercially important crustaceans show a bimodal pattern of growth, in which males grow faster and are bigger than females. For this reason, the production of all-male populations is more advantageous. The administration of proapoptotic compounds in an early larval phase could be a method to manipulate the sex in these crustaceans. Nevertheless, our study demonstrated that diatom compounds did not induce apoptosis in the androgenic gland of other species, suggesting a targeted and specific action of C. scutellum metabolites. On the other hand, the biological assays on human cancer cell lines showed that solid tumours were more responsive to C. scutellum than haematological tumours and normal cells, suggesting a specific toxic action of the diatom compounds. In addition, we demonstrated that the most active fraction to induce apoptosis in cancer cells was that containing the highest amount of eicosapentaenoic acid (EPA), described in the literature for its anticancer and proapoptotic properties. This fraction detained the cell cycle at G2/M phase and the results in terms of apoptosis and reduced cell viability produced by this fraction were comparable with those induced by EPA. Western blotting experiments showed that diatoms triggered apoptosis by the extrinsic pathway, i.e. by means of activation of caspase 8, and confirmed the involvement of effector caspase 3. In addition, C. scutellum was studied for the first time from the chemical point of view. By GC-MC we identified more than 100 compounds, mainly fatty acids, sterols and glycerides, and excluded the presence of short chain aldehydes.In collaboration with the University of Athens, the chemical study on the anaspidean mollusc Aplysia fasciata was carried out. From its digestive and hermaphroditic glands 16 metabolites were isolated by a combination of chromatographic techniques, and they were identified by spectroscopic analysis. Six of them (6-hydroxy-1-brasilene, epibrasilenol acetate, (3Z,9Z)-7-chloro-6-hydroxy-12-oxopentadeca-3,9-dien-1-yne, 6-epi-beta-snyderol, 16-acetoxy-15-bromo-7-hydroxy-9(11)-parguerene), belonging to different classes of sesquiterpene, acetogenin and diterpene compounds, are new and related with metabolites isolated from different species of the red alga Laurencia, the animal's diet. In the Istituto di Chimica Biomolecolare (Italy), the chemical and biological investigation on the Chinese soft coral Sinularia sp. was performed. We isolated four new casbene compounds, i.e. bicyclic diterpenes characterized by a cyclopropane fused with a 14-membered macrocycle, which are usually found in Euphorbiaceae plants and rarely in marine organisms. Contrastingly to most natural cis ring-fused casbenes, in Sinularia co-existed cis and trans compounds and this suggested a non-stereospecific biosynthetic mechanism. The 4 casbenes were active against Gram+ bacteria and just casbene 3 also against Gram- bacteria, only hydroxylated casbenes displayed anti-feeding properties, and they did not exhibit antiproliferative activity. / "Metabolitos secundarios de organismos bentónicos: aspectos ecológicos y químicos" Depositada por Michela NappoTEXTO:El objetivo de esta Tesis es el estudio de los productos naturales marinos y su posible relevancia en el desarrollo de nuevos medicamentos. La investigación se enfocó sobre los organismos bentónicos, i.e. los que viven en contacto con el fondo marino y que, a pesar de la falta de protección física y la escasa movilidad de la mayoría de las especies, han desarrollado mecanismos de defensa alternativos, como la producción de armas químicas. Estos compuestos, dotados de propiedades ecológicas, a menudo exhiben también importantes actividades farmacológicas. Se consideraron organismos pertenecientes a diferentes phyla (algas, moluscos y cnidarios) y áreas geográficas. Las diatomeas Cocconeis scutellum afectan la reversión sexual del decápodo proterándrico Hippolyte inermis, induciendo apoptosis (muerte celular programada) en la glándula androgénica del crustáceo. En esta Tesis evaluamos también la capacidad de dichas diatomeas en afectar el cambio de sexo de otros crustáceos, en particular los de interés comercial, y de actuar sobre las células tumorales humanas, a fin de encontrar posibles aplicaciones en acuicultura y medicina. También se valoró el patrón metabólico de las diatomeas mediante cromatografía de gases/espectrometría de masas, identificando más de 100 compuestos (ácidos grasos, esteroles y glicéridos), no constatándose la presencia de aldéhidos de cadena corta.En la Universidad de Atenas, se realizó el estudio químico del molusco anaspídeo Aplysia fasciata. Mediante diferentes técnicas cromatográficas y espectroscópicas, se aislaron 16 metabolitos, de los cuales seis eran nuevos (6-hidroxi-1-brasileno, epibrasilenol acetato, (3Z,9Z)-7-cloro-6-hidroxi-12-oxopentadeca-3,9-dien-1-ino, 6-epi-beta-snyderol, 16-acetoxi-15-bromo-7-hidroxi-9(11)-parguereno), relacionados con metabolitos de algas rojas del género Laurencia, que constituyen la dieta del animal.En el Instituto de Química Biomolecular (Pozzuoli, Italia) se realizó tanto el estudio químico como los experimentos biológicos con el coral blando Sinularia sp. procedente de China. De esta especie se aislaron 4 nuevos compuestos casbénicos (diterpenos bicíclicos formados por un anillo ciclopropánico fusionado a un macrociclo de 14 átomos) cuya estructura es frecuente en plantas de la familia Euphorbiaceae y bastante más rara en los organismos marinos. Los casbenos hidroxilados eran repelentes alimenticios; todos son activos frente a las bacterias Gram+ y sólo el casbeno 3 es también activo frente a las bacterias Gram- .

Molts bacteris del grup fluorescent del gènere Pseudomonas són capaços de controlar malalties de les plantes causades per fongs i bacteris fitopatògens (ACBs) o mostren activitat com a bacteris promotors del creixement de les plantes (BPCPs). S'han descrit diversos metabòlits que intervenen de manera important en la seva activitat com a ACBs i BPCPs entre els quals en destaquen el 2,4-diacetilfloroglucinol (Phl), àcid fenazin-1-carboxílic (PCA), Pirrolnitrina (Prn), àcid cianhídric (HCN), àcid 3-indolacètic (IAA), sideròfors i quitinases.L'objectiu principal del nostre treball ha estat la comparació de les característiques d'un grup de Pseudomonas del grup fluorescent utilitzant una aproximació polifàsica amb la finalitat d'establir possibles relacions entre algunes de les característiques i la capacitat d'actuar com a ACB o BPCP.Atesa la importància en el biocontrol de la producció de metabòlits com Phl, PCA i Prn, l'objectiu preliminar ha estat la recerca i obtenció de soques productores d'aquests metabòlits. Per assolir aquest objectiu s'ha emprat una aproximació molecular basada en la detecció dels gens biosintètics implicats en la seva producció en lloc de la detecció directa dels metabòlits per evitar els efectes que poden tenir les condicions de cultiu en la inducció o repressió de la seva síntesi. S'han realitzat diferents protocols basats (i) en la cerca assistida de productors mitjançant l'ús de marcadors fenotípics i posterior confirmació per PCR i, (ii) en l'ús de la PCR per a la detecció dels gens directament dels extractes bacterians, d'enriquiments d'aquests extractes i la realització de la hibridació en colònies per al posterior aïllament. La cerca assistida de productors de Phl mitjançant marcadors fenotípics i posteriorment la utilització de tècniques moleculars (amplificació per PCR del gen phlD), ha estat el millor mètode en el tipus de mostres processades en el nostre treball, on la proporció de productors és relativament baixa. En total s'han aïllat a partir de diversos ambients 4 soques portadores dels gens de la síntesi de PCA, 15 de Phl i 1 de Prn.S'ha constituït una col·lecció de 72 soques de Pseudomonas del grup fluorescent que inclou 18 aïllats propis portadors dels gens biosintètics necessaris per la producció de Phl PCA i Prn; 6 soques de referència procedents de col·leccions de cultius tipus, 14 soques productores dels diferents antibiòtics cedides per altres investigadors i una selecció de 34 soques procedents d'un treball previ realitzat en el nostre grup de recerca. A la col·lecció s'hi troben soques candidates a ACB i BPCP de diverses malalties i plantes.Les 72 soques s'han caracteritzat fenotípica i genotípicament. La caracterització fenotípica s'ha portat a terme mitjançant la identificació a nivell d'espècie amb galeries API 20NE i proves bioquímiques específiques; la producció de metabòlits com PCA, Phl, Prn, IAA, HCN, quitinases i sideròfors mitjançant l'ús de diferents tècniques; antagonisme in vitro en diversos medis enfront dos fongs (Stemphylium vesicarium i Penicillium expansum) i tres bacteris fitopatògens (Erwinia amylovora, Pseudomonas syringae pv. syringae i Xanthomonas arboricola pv. juglandis); l'eficàcia de la inhibició de la infecció en bioassaigs in vivo sobre material vegetal enfront els fongs P. expansum en poma i S. vesicarium en fulles de perera i enfront el bacteri E. amylovora en fruits immadurs de perera i, finalment, en assaigs de promoció de creixement en dos portaempelts comercials de Prunus. Cal destacar que P. expansum causa la podridura blava en pomes i peres en postcollita, S. vesicarium la taca bruna de la perera i E. amylovora el foc bacterià de les rosàcies.El nombre de soques de Pseudomonas, sobre el total de les 72 estudiades, productores d'IAA (4) i quitinases (6) és baix, mentre que és elevat en el cas del HCN (32), que a més està associat a la producció de Phl. Els resultats obtinguts en l'antagonisme in vitro han mostrat en el cas dels bacteris que és dependent del patogen indicador i del medi de cultiu. La presència o absència de ferro no sembla ser un factor que potencií l'antagonisme. En el cas dels fongs no s'ha observat però, influència del medi de cultiu emprat. En el total de 72 soques s'ha observat un percentatge baix de soques que manifesten antagonisme en tots els medis assajats vers 3 o 4 dels patògens (7). Solament 2 d'aquestes 7 soques han mostrat ser també efectives en bioassaigs d'inhibició de les infeccions causades per 2 dels 3 patògens assajats. Algunes de les soques efectives en els bioassaigs no són antagonistes in vitro en cap dels medis assajats enfront el mateix patogen. En el cas de la promoció del creixement, s'han observat més soques promotores del creixement del portaempelts de prunera Marianna 2624 que no en l'híbrid de presseguer-ametller GF677 i les eficàcies assolides són també majors en el cas de Marianna 2624, detectant una elevada especificitat soca/portaempeltsLa caracterització genotípica s'ha realitzat mitjançant l'anàlisi dels polimorfismes en la longitud dels fragments de restricció de DNA ribosomal (RFLP-rDNA) i l'anàlisi dels polimorfismes en la longitud dels fragments de macrorestricció genòmica de DNA cromosòmic separats per electroforesi en camp polsant (MRFLP-PFGE). Ambdues anàlisis van mostrar una gran heterogeneïtat genètica entre les soques caracteritzades i no s'ha pogut relacionar les agrupacions obtingudes amb les característiques fenotípiques o capacitat d'actuar com a ACB o BPCP. Els patrons de macrorestricció genòmica (MRFLP-PFGE) del bacteri model P. fluorescens EPS288 són estables en el temps i independents de les condicions de cultiu assajades al laboratori o en mostres naturals, mostrant ser una tècnica eficaç en la identificació de reaïllats de mostres naturals inoculades prèviament amb el bacteri.Una selecció de soques que comparteixen el fet de produir floroglucinol s'han caracteritzat mitjançant RFLP i seqüenciació del gen phlD. S'ha establert una relació entre les agrupacions obtingudes en les anàlisis RFLP-rDNA, RFLP-phlD i les seqüències del gen. En l'anàlisi filogenètica de les seqüències del gen phlD s'ha observat un elevat grau de polimorfisme obtenint-se 3 agrupacions principals. Les agrupacions semblen relacionar-se amb els patrons de producció de metabòlits (Phl, HCN i Prn en una primera agrupació; Phl i HCN en la segona i solament Phl en la tercera), però aquestes no s'han pogut relacionar amb l'origen geogràfic de les soques o la seva activitat com a ACBs i/o BPCP.Amb les dades obtingudes de la caracterització fenotípica i genotípica s'ha realitzat una anàlisi multivariant (correspondències, correlacions d'Spearman i de freqüències amb variables categòriques). S'ha demostrat la importància de disposar d'una tècnica que permeti depurar una col·lecció de soques descartant les soques genèticament idèntiques, ja que influeixen en els resultats de les anàlisis. Pels tres patògens assajats com a indicadors i els dos portaempelts emprats, no s'ha observat cap correlació entre la inhibició de la infecció o la promoció del creixement amb les característiques fenotípiques i genotípiques de les soques que fos significatiu i consistent en les tres tècniques emprades. / Many bacteria pertaining to the fluorescent Pseudomonas group are able to control plant diseases caused by bacterial and fungal plant pathogens (BCAs). Also, some of them exhibit activity as plant growth promoting bacteria (PGPBs). Several metabolites like 2,4-diacetylphloroglucinol (PHL), phenazin-1-carboxilic acid (PCA), pyrrolnitrin (Prn), hydrogen cyanide (HCN), indol-3-acetic acid, siderophores and chitinases has been described accounting for their ability of being BCAs or PBPBs.The aim of the present work was to compare the phenotypic and genotypic characteristics of a selected group of fluorescent Pseudomonas by means of a polyphasic approach in order to establish relationships with the ability of being BCA and PGPB.Due to the importance of production of metabolites like Phl, PCA and Prn in biocontrol, the preliminary objective of this work was to search and isolate of metabolite producing strains. To achieve this objective a molecular approach was used based on the detection of biosynthetic genes, which are implicated in the metabolite production, instead of direct detection of the metabolites. The procedure was performed to avoid the effect of culture conditions on induction or repression of metabolite synthesis. Two procedures were used (i) assisted search of metabolite producing strains by means of phenotypic markers and subsequent confirmation by PCR analysis, (2) direct use of PCR for gene detection in direct extracts or enrichments from samples and subsequent colony-hybridization for assistance in strain isolation. The best method for isolation of Phl producers in the type of samples processed in the present work, where the frequency of Phl producers is very low, was the assisted search by means of phenotypic markers followed of a confirmation by PCR amplification of phlD gene. Four strains harboring the PCA genes, 15 strains with Phl genes, and one with Prn genes were isolated.A collection of 72 strains of Pseudomonas pertaining to the fluorescent group was made including 18 isolates derived from the present work which harbor the biosynthetic genes for PhL, PCA and Prn production; 6 strains from reference collections; 14 strains producing several antibiotics which were supplied by other colleagues; and a selection of 34 strains from a previous work performed by our research group. Within the collection there are many strains with promising potential as BCAs and PGPBs of several diseases and plant hosts.The collection was characterized phenotypically and genotypically. The phenotypic characterization included identification at the species level with the aid of API20NE kit and several specific biochemical tests; the production of metabolites such as PCA, Phl, Prn, IAA, HCN, chitinases and siderophores; in vitro antagonism in several culture media against two fungi (Stemphylium vesicarium and Penicillium expansum) and three bacterial pathogens (Erwinia amylovora, Pseudomonas syringae pv. syringae and Xanthomonas arboricola pv. juglandis); efficacy in biossays of inhibition of infection of plant material by P. expansum on apple fruit tissue and S. vesicarium on pear leaves, E. amylovora on immature pear fruit, and of growth promotion in two commercial Prunus rootstocks. P. expansum causes blue mold rot of apple and pear in postharvest, S. vesicarium cause brown spot of pear and E. amylovora is the causal agent of fire blight of rosaceous plants.The number of strains, over a total of 72 studied, producing IAA and chitinases was very low (4 producing IAA and 6 producing chitinases), whereas a high number of HCN producing strains (32) was detected which was associated to Phl production. In vitro antagonism against bacteria was highly dependent on indicator pathogen and growth medium, but the presence or absence of iron did not seem to affect. However, in the case of antagonism against fungi, no influence of the medium composition was observed. Among the collection a low frequency of strains exhibiting antagonism against 3 or 4 pathogens a total of 7 strains was observed in all tested media. Only two out of the seven strains were effective in infection inhibition bioassays caused by two of the three pathogens tested. Some of the effective strains in the in vivo assays were not antagonist for the indicator pathogen in any of the media tested. In the case of plant growth promoting strains, the growth in rootstock Marianna 2624 was more stimulated than in GF677, and there was a strain-host specificity. Genotypic characterization of strains was performed by means of restriction fragment length polymorphism analysis of the ribosomal DNA (RFLP-rDNA) and macrorestriction fragment length polymorphism analysis of chromosomal DNA separated by pulsed field gel electrophoresis (MRFLP-PFGE). Both techniques showed a high level of genotypic diversity within the collection of strains, and no relationships were observed between clusters and phenotypic characteristics or ability to be BCA or PGPB. Patterns of MRFLP-PFGE for the model bacterium P. fluorescens EPS288 were found stable within time and independent of cultivation conditions in the laboratory or under natural conditions. Therefore the method is highly suitable for identification of strains reisolated from natural samples previously inoculated with the bacterium.A further selection of strains which produce phloroglucinol were characterized by RFLP analysis and phlD sequencing. The groups observed were consistent among the RFLP-rDNA, RFLP-phlD and gene sequence data. Phylogenetic analysis obtained using phlD sequences showed a high level of polymorphism revealing three main clusters. These clusters appear to be related with metabolite production: a first cluster producing Phl, HCN and Prn, a second producing Phl and HCN, and a third producing only Phl. However, this groups were related neither to the geographic origin of strains nor to the activity as BCA or PGPB.A multivariate analysis (correspondence, pairwise Spearman rank correlation, and frequency analysis)was performed using data of phenotypic and genotypic characterization of strains. The results emphasize the importance of discarding from the database those strains being genetically identical because skew the final results. The three types of analysis did not revealed a significant and consistent relationship between the activity of infection inhibition or growth promotion of the strains and their characteristics.