This PhD Thesis deals with the study of marine natural products as candidates in either drug discovery and development. In particular, the investigation focused on benthic organisms, i.e. those fixed or in a close relation with the sea bottom. These organisms, many of which are sessile or slow-moving invertebrates, thus unable to escape quickly from their predators, and devoid of physical protection (shell or hard texture), have developed alternative protective strategies as well as the production of chemical weapons. Compounds involved in the chemical defence, besides the ecological function, can display interesting pharmacological activities. Organisms of different phyla (Algae, Molluscs and Cnidarians) and from diverse geographical areas (Mediterranean Sea and China) were investigated. The benthic diatom Cocconeis scutellum is able to affect the sex reversal in the protandric shrimp Hippolyte inermis, inducing apoptosis (programmed cell death) in the crustacean's androgenic gland. Thus, we wondered whether these diatoms could act also in other crustaceans and on human cancer cells, in order to evaluate their applications in aquaculture and medicine. In fact, some commercially important crustaceans show a bimodal pattern of growth, in which males grow faster and are bigger than females. For this reason, the production of all-male populations is more advantageous. The administration of proapoptotic compounds in an early larval phase could be a method to manipulate the sex in these crustaceans. Nevertheless, our study demonstrated that diatom compounds did not induce apoptosis in the androgenic gland of other species, suggesting a targeted and specific action of C. scutellum metabolites. On the other hand, the biological assays on human cancer cell lines showed that solid tumours were more responsive to C. scutellum than haematological tumours and normal cells, suggesting a specific toxic action of the diatom compounds. In addition, we demonstrated that the most active fraction to induce apoptosis in cancer cells was that containing the highest amount of eicosapentaenoic acid (EPA), described in the literature for its anticancer and proapoptotic properties. This fraction detained the cell cycle at G2/M phase and the results in terms of apoptosis and reduced cell viability produced by this fraction were comparable with those induced by EPA. Western blotting experiments showed that diatoms triggered apoptosis by the extrinsic pathway, i.e. by means of activation of caspase 8, and confirmed the involvement of effector caspase 3. In addition, C. scutellum was studied for the first time from the chemical point of view. By GC-MC we identified more than 100 compounds, mainly fatty acids, sterols and glycerides, and excluded the presence of short chain aldehydes.In collaboration with the University of Athens, the chemical study on the anaspidean mollusc Aplysia fasciata was carried out. From its digestive and hermaphroditic glands 16 metabolites were isolated by a combination of chromatographic techniques, and they were identified by spectroscopic analysis. Six of them (6-hydroxy-1-brasilene, epibrasilenol acetate, (3Z,9Z)-7-chloro-6-hydroxy-12-oxopentadeca-3,9-dien-1-yne, 6-epi-beta-snyderol, 16-acetoxy-15-bromo-7-hydroxy-9(11)-parguerene), belonging to different classes of sesquiterpene, acetogenin and diterpene compounds, are new and related with metabolites isolated from different species of the red alga Laurencia, the animal's diet. In the Istituto di Chimica Biomolecolare (Italy), the chemical and biological investigation on the Chinese soft coral Sinularia sp. was performed. We isolated four new casbene compounds, i.e. bicyclic diterpenes characterized by a cyclopropane fused with a 14-membered macrocycle, which are usually found in Euphorbiaceae plants and rarely in marine organisms. Contrastingly to most natural cis ring-fused casbenes, in Sinularia co-existed cis and trans compounds and this suggested a non-stereospecific biosynthetic mechanism. The 4 casbenes were active against Gram+ bacteria and just casbene 3 also against Gram- bacteria, only hydroxylated casbenes displayed anti-feeding properties, and they did not exhibit antiproliferative activity. / "Metabolitos secundarios de organismos bentónicos: aspectos ecológicos y químicos" Depositada por Michela NappoTEXTO:El objetivo de esta Tesis es el estudio de los productos naturales marinos y su posible relevancia en el desarrollo de nuevos medicamentos. La investigación se enfocó sobre los organismos bentónicos, i.e. los que viven en contacto con el fondo marino y que, a pesar de la falta de protección física y la escasa movilidad de la mayoría de las especies, han desarrollado mecanismos de defensa alternativos, como la producción de armas químicas. Estos compuestos, dotados de propiedades ecológicas, a menudo exhiben también importantes actividades farmacológicas. Se consideraron organismos pertenecientes a diferentes phyla (algas, moluscos y cnidarios) y áreas geográficas. Las diatomeas Cocconeis scutellum afectan la reversión sexual del decápodo proterándrico Hippolyte inermis, induciendo apoptosis (muerte celular programada) en la glándula androgénica del crustáceo. En esta Tesis evaluamos también la capacidad de dichas diatomeas en afectar el cambio de sexo de otros crustáceos, en particular los de interés comercial, y de actuar sobre las células tumorales humanas, a fin de encontrar posibles aplicaciones en acuicultura y medicina. También se valoró el patrón metabólico de las diatomeas mediante cromatografía de gases/espectrometría de masas, identificando más de 100 compuestos (ácidos grasos, esteroles y glicéridos), no constatándose la presencia de aldéhidos de cadena corta.En la Universidad de Atenas, se realizó el estudio químico del molusco anaspídeo Aplysia fasciata. Mediante diferentes técnicas cromatográficas y espectroscópicas, se aislaron 16 metabolitos, de los cuales seis eran nuevos (6-hidroxi-1-brasileno, epibrasilenol acetato, (3Z,9Z)-7-cloro-6-hidroxi-12-oxopentadeca-3,9-dien-1-ino, 6-epi-beta-snyderol, 16-acetoxi-15-bromo-7-hidroxi-9(11)-parguereno), relacionados con metabolitos de algas rojas del género Laurencia, que constituyen la dieta del animal.En el Instituto de Química Biomolecular (Pozzuoli, Italia) se realizó tanto el estudio químico como los experimentos biológicos con el coral blando Sinularia sp. procedente de China. De esta especie se aislaron 4 nuevos compuestos casbénicos (diterpenos bicíclicos formados por un anillo ciclopropánico fusionado a un macrociclo de 14 átomos) cuya estructura es frecuente en plantas de la familia Euphorbiaceae y bastante más rara en los organismos marinos. Los casbenos hidroxilados eran repelentes alimenticios; todos son activos frente a las bacterias Gram+ y sólo el casbeno 3 es también activo frente a las bacterias Gram- .

S'han estudiat els efectes dels factors ambientals sobre el perífiton dels sistemes lenític fluctuants del aiguamolls de l'Empordà. L'estudi s'ha realitzat als tres nivells d'integració: nivell d'ecosistema considerant el rol del perífiton envers els altres productors primaris; a nivell de comunitat, estudiant la composició específica de les diatomees i a nivell de població estudiant la plasticitat fenotípica d'una espècie de diatomea (Nitzschia frustulum).A nivell d'ecosistema s'observa que els factors que afavoreixen el predomini dels diferents tipus de productors primaris (perífiton, fitoplàncton i macròfits) són la renovació i el grau d'eutròfia de l'aigua. A nivell de comunitat els factors determinants en la composició i distribució de les espècies de diatomees són els gradients confinament-inundació així com la productivitat del sistema. En funció d'aquest factors s'han establert 5 associacions de diatomees. A nivell de població es demostra que tant la salinitat, com la relació N : P a l'aigua com el moviment de l'aigua afecten la morfologia i ultraestructura de la valva de N. frustulum. De forma interessant s'observa que la salinitat, considerada com a factor individual, afecta N. frustulum a nivell poblacional provocant-li modificacions en la morfologia de la valva, per en canvi, no afecta a nivell de comunitat, ja que totes les espècies de diatomees presents en ambients de salinitat fluctuant són eurihalines. / The effects of environmental conditions on periphytic of lentic and fluctuating waters (Empordà wetlands) at the three different levels of organisation were studied: at ecosystem level, considering the role of periphyton among the primary producers; at community level, analysing the periphytic diatom species composition; and at population level studying the phenotypic plasticity of a selected diatom species (Nitzschia frustulum). The factors favouring the predominance of different primary productors (periphyton, phytoplankton and macrophytes) were the turnover and eutrophy of the water. At the community level, we observed that the main factors affecting diatom species composition and distribution are the gradients confinement-flooding and productivity of the system. Based on these factors 5 diatom assemblages have been distinguished. At the population level, the results of the present thesis proved that the morphology and ultrastructure of N. frustulum is affected by salinity, N : P ratio and movement of the water. Interestingly the results showed that salinity, as a single environmental factor, has effect at N. frustulum population level resulting in phenotypic plasticity while there is no effect of salinity at diatom community level since in such environments with fluctuating salinity all the species present are euryhaline.

Els sistemes aquàtics continental representen un dels ecosistemes més amenaçats a nivell mundial, com a conseqüència de l'ús intensiu quel'home en fa. La conca del Guadiana no està lliure d'aquestes pressions antròpiques. Les grans infraestructures hidràuliques i l'escorrentia provinent de l'agricultura són només exemples dels greus problemes que pateix la conca. Aquests problemes es fan especialment palesos en la zona alta de la conca, on l'escassetat d'aigua no fa més que agreujar el problema.Tot això ha generat la necessitat urgent d'avaluar l'estat de conservació d'aquests ecosistemes aquàtics continentals, poder determinar la mesura i la magnitud de les pertorbacions que els estan afectant i així proposar mesures de gestió destinades a restaurar-ne la integritat ecològica. El principal objectiu que presenta aquest és determinar els patrons de distribució de les comunitats de algals (amb una menció especial en el grup de les diatomees) i de les seves causes en la conca del Guadiana i associades, amb la finalitat d'establir i proposar eines que permetin avaluar l'estat de conservació de les masses d'aigua d'aquestes conques. / In many parts of the world freshwater ecosystems are intensely modified and degraded by human activities. Rivers have been altered since historical times, but such modifications have intensified in the last century. Water extraction and heavily regulated reservoirs are spread disturbances in the Guadiana network. Drainage from agricultural land in river systems results in large inputs of nitrates and phosphates that eutrophy river waters. Inputs of fertilizers and water extraction are especially remarkable in the North-East Guadiana watershed. The development of tools to assess ecological status of water bodies has been a key issue in the management of the freshwater ecosystems in the last decades in order to protect and restore the biological integrity of ecosystems. The present study aims to determine distributional patterns of benthic algae communities (with a special attention on diatom microflora) and their causes in Guadiana and associated watersheds in order to establish tools for assessing the conservation status of the water bodies in those watersheds.

Els resultats que es presenten en aquesta tesi estan centrats bàsicament en l'estudi de la biodiversitat de les diatomees epilítiques presents en els rius de la conca de l'Ebre i en la seva aplicació com a indicadores de l'estat ecològic de les masses d'aigua. Durant els mesos d'estiu del 2005 i 2006 es va realitzar el mostreig de la flora de diatomees epilítiques en un total de 197 i 211 estacions, respectivament, pertanyents a la Xarxa de Control de l'Estat de les Masses d'Aigües Superficials (CEMAS) de la Confederació Hidrogràfica de l'Ebre (CHE). Aquests mostrejos van ser impulsats per la CHE amb l'objectiu d'establir xarxes de control biològic, basades en bioindicadors del fitobentos per tal de conèixer l'estat ecològic de les aigües fluvials d'acord amb el que estableix la Directiva Marc de l'Aigua (DMA). La recollida de les mostres, el seu tractament químic i, la quantificació de les espècies per localitat, s'han basat en les normatives estandarditzades europees CEN/TC 230 EN 13946:2003, norma prEN 14407: 2004 i, en els protocols de la CHE per l'avaluació de la qualitat biològica en rius mitjançant diatomees. L'examen de les mostres recollides ha permès la identificació de 499 tàxons, repartits en 91 gèneres, dels quals 492 han estat a nivell específic o infra-específic. Dels tàxons identificats, 361 estan representats en 751 fotografies realitzades al microscopi òptic, agrupats en 25 làmines. Com a particularitats de la flora s'esmenta d'una banda la presència de 7 espècies al•lòctones segons les consideracions principalment de Coste & Ector 2000 Achnanthidium catenatum, A. druartii, Diadesmis confervacea, Didymosphenia geminata, Gomphoneis minuta, Navicula kotschyi y Reimeria uniseriata) i per l'altre, la presència en algunes localitats de diverses formes teratològiques que podrien indicar condicions adverses del medi (estrès químic o contaminació), encara que en alguns casos podrien ser originades simplement per causes naturals. Com a resultat de la determinació de l’estat ecològic de les masses d’aigua s'ha comprovat l'aplicació i funcionament òptim dels índexs de diatomees (Index de Pol•lució Específica IPS, Index Biològic de Diatomees IBD i Index Europeu CEE), sent l'IPS l'índex més convenient per la bioindicació de l'aigua a la conca de l'Ebre. No obstant, aquests índexs no reflecteixen prou bé les diferències entre algunes ecoregions de la conca de l'Ebre, com ara les capçaleres calcàries. Tenint en compte els resultats obtinguts amb l'IPS, la proporció de localitats estudiades que complirien amb la DMA en aquests 2 anys d'estudi són bastant similars, seria del <62% pel 2005 i del <64% pel 2006. Els resultats de l'índex de Shannon & Weaver indiquen que la diversitat i la riquesa específica s'ajusta a un model relacionat amb la qualitat del medi. Les correlacions d'aquests paràmetres respecte a variables ambientals (pH, conductivitat, clorurs, amoni, fosfats, nitrats, TSS, oxigen dissolt, altitud de la localitat, corrent, amplada i fondària del riu) i els resultats dels índexs de diatomees (IPS, IBD i CEE) mostren que la diversitat de les comunitats de diatomees en les localitats estudiades augmenta quan empitjora l'estat ecològic, seguint un gradient marcat principalment per l'altitud i la concentració de nutrients. L'estudi de l'ordenació de les comunitats de diatomees epilítiques en els rius de la conca de l'Ebre, tenint en compte les variables ambientals de les localitats estudiades, mostra que la seva distribució seguiria un gradient capçalera-desembocadura, marcat per l’increment progressiu de la mineralització en el que se superposen els efectes de les variables ambientals que es relacionen amb els impactes i els nutrients. Les anàlisis clúster dels inventaris seleccionats distingeixen 7 grups de localitats i 6 grups ecològics diferents de diatomees que responen a les pertorbacions observades i als gradients de mineralització i eutròfia que caracteritzen la conca de l'Ebre. / "Diatoms of the Ebro basin: Biodiversity and ecological state of water" TEXT: The aim of this PhD thesis is to contribute to the taxonomic knowledge of the epilithic diatom flora from the rivers of the Ebro basin and to determinate the water quality status in the studied area using benthic diatoms as indicators. The studied area is located inside the Water Quality Surveillance Network of the Ebro Water Agency, CHE (NE Spain). It includes the Ebro and Garona rivers and all the rivers and streams which run into them in the Spanish territory, mostly over a calcareous and sedimentary substrata. A total of 408 epilithic diatoms samples were collected from different environments and ecoregions within the limits of the network of the Ebro Water Agency, CHE (NE Spain) during the summers of 2005 (197 sites) and 2006 (211 sites). Epilithic diatom were sampled, and then treated to prepare permanent diatoms slides following the standard methods (European Committee for Standardization 2003, 2004). The number of taxa identified in the material studied amounted to 499 (492 a specific or infra specific level), belonging to 91 different genera. 361 taxa are presented in 751 light microscope micrographs regrouped in 25 plates. We noticed the presence of species considered rare or exotic for European freshwaters (Coste & Ector, 2000) such as Diadesmis confervacea; Achnanthidium catenatum, Reimeria uniseriata, Navicula kotschyi, Gomphoneis minuta and Didymosphenia geminata. A few diatoms species presented teratological forms have been detected in some localities. However, we could not find a direct relationship of these forms occurrence and any particular cause. In order to evaluate the water quality assessment, three diatoms indices were applied (Specific Pollution Index IPS, Biological Diatom Index BDI and European Index CEC). All of them correlated significantly with water physical and chemical variables, but SPI achieved better correlations, and is therefore to be the best diatom index to be applied in the Ebro basin, although in some cases it did not properly reflected special situations in this basin as calcareous headwaters. According to the cluster and canonical correspondence analyses, nutrient enrichment (from the headwaters to the mouth), environmental variables and impacts were to be the most important variables structuring diatom communities in the Ebro basin.

En esta tesis se ha demostrado que la radiación ultravioleta induce mortalidad en comunidades de fitoplancton de diferentes áreas del Océano Atlántico, del Mar Mediterráneo y del Océano Antártico. El fitoplancton más pequeño (pico-fitoplancton) muestra mayor sensibilidad a la radiación UV respecto al fitoplancton de mayor tamaño. Este estudio identifica que el crecimiento de las poblaciones del fitoplancton antártico está controlado por la radiación ultravioleta con inhibiciones de biomasas por encima del 80-90%. Se demuestra también que la transferencia de radicales OH, generados por la radiación ultravioleta, desde la atmósfera hacia la superficie del Océano causa mortalidad en comunidades de fitoplancton de aguas tropicales, templadas y antárticas. El trabajo presentado en esta tesis muestra la importancia de la radiación ultravioleta como factor que induce mortalidad en el fitoplancton, su influencia en el balance del crecimiento neto de estas poblaciones, así como las consecuencias que se derivan en la cadena trófica.