Gliomas são os mais comuns e devastadores tumores primários do sistema nervoso central. Nucleotídeos extracelulares estão envolvidos em diversos processos patofisiológicos no sistema nervoso central. Os níveis dos nucleotídeos da adenina podem ser controlados por hidrólise através da ação de vários membros da família das ectonucleotidases. O AMP formado pelas NTPDases é hidrolizado até adenosina por ação da ecto-5’-nucleotidase (ecto-5’-NT). A enzima ciclooxigenase (COX) está surgindo como um novo alvo na prevenção e no tratamento do câncer, sendo que substanciais evidências epidemiológicas, experimentais e clínicas sugerem que os antiinflamatórios não-esteróides (AINEs) possuem propriedades anticâncer. Vários estudos têm demonstrado que certos AINEs causam efeitos antiproliferativos independentes da atividade da COX. Assim, o objetivo deste estudo foi avaliar o efeito dos AINEs em linhagens celulares de gliomas e os possíveis mecanismos envolvidos neste efeito e avaliar a influência da indometacina na cascata de enzimas que catalisam a interconversão dos nucleotídeos. Indometacina, acetaminofeno, sulfeto de sulindaco e NS-398 induziram uma inibição da proliferação celular de modo tempo e dose dependente. Indometacina causou uma redução significativa na viabilidade celular. Nenhum dos AINEs testados induziu ativação de caspase 3/7. O tratamento com indometacina diminuiu a percentagem de células na fase S, com um aumento relativo nas fases G0/G1 e/ou G2/M, indicando uma parada na progressão do ciclo celular. A exposição de células de glioma à indometacina causou um aumento nas hidrólises de AMP e ATP. Um aumento significativo nos níveis de mRNA da ecto-5’-NT/CD73 foi observado após tratamento com indometacina Estes resultados suportam a hipótese que o aumento na atividade da ecto-5’-NT está relacionado com a superexpressão do mRNA com possíveis alterações no catabolismo das purinas extracelulares. Os dados sugerem ainda que o receptor A3 e a enzima ecto-5’-NT estão envolvidos no efeito antiproliferativo da indometacina nas linhagens celulares de gliomas. Considerando que a via das ectonucleotidases pode representar um importante mecanismo associado com a transformação maligna dos gliomas, os AINEs podem ser clinicamente importantes na intervenção farmacológica deste tipo de tumor.

A acidemia metilmalônica é um erro inato do metabolismo caracterizado pelo acúmulo tecidual de ácido metilmalônico (MMA), dano oxidativo e alterações neurológicas, como degeneração estriatal e convulsões. Considerando que o óxido nítrico é um mensageiro químico trans-sináptico que está envolvido em diversos eventos fisiopatologógicos e seu papel na toxicidade induzida pelo MMA é pouco conhecido, nós decidimos investigar a participação deste radical livre nas alterações comportamentais e neuroquímicas induzidas pela administração intraestriatal de MMA. No primeiro trabalho, foi evidenciado que a administração intraestriatal de um inibidor não-seletivo da enzima óxido nítrico sintase, metil éster de Nϖ-nitro-L-arginina (LNAME: 10-4 - 100 nmol/0,5 μl), exerceu efeito bifásico nas convulsões e na carbonilação proteíca induzidas pela injeção de MMA (4,5 μmol/1,5 μl; 30 minutos após a injeção de L-NAME) no estriado de ratos. Estes resultados sugeriram um envolvimento do óxido nítrico nas convulsões e no dano oxidativo induzido pelo MMA. Em um segundo momento, confirmamos o envolvimento do óxido nítrico nas convulsões induzidas por MMA, uma vez que a injeção intraestriatal de MMA causou um aumento na concentração de nitrito e nitrato (NO2 e NO3) estriatal. Além disso, os episódios convulsivos induzidos por MMA apresentaram uma correlação significativa com a inibição da atividade da Na+,K+-ATPase no estriado injetado, mas não com os níveis de carbonilação protéica, um marcador de dano oxidativo protéico. Neste estudo também foi avaliado o efeito da administração intraestriatal do azul de metileno (AM; 0,015 a 1,5 nmol/ 0,5 μl), que possui atividade antioxidante e é um inibidor da guanilato ciclase, nas convulsões e dano oxidativo induzidos pelo MMA. O AM (1,5 nmol/0,5 μl) diminuiu a formação de NO2 e NO3 estriatal e preveniu as convulsões, a carbonilação protéica e a inibição da atividade da Na+,K+-ATPase induzidos pelo MMA. Esses dados sugerem que a atividade da Na+,K+-ATPase pode ser de grande importância para a gênese das convulsões induzidas pelo MMA e que o AM exerce efeito neuroprotetor contra as alterações comportamentais e neuroquímicas induzidas pelo MMA. Além disso, se essas alterações ocorerem nos pacientes com acidemia metilmalônica, é possível propor que o AM poderia ser considerado como uma terapia adjuvante para o tratamento desta acidemia. O efeito da administração do 7-nitroindazol (7-NI; 3-60 mg/kg, i.p.), um inibidor da enzima NOSn, nas convulsões, carbonilação protéica, produção de NO2 e NO3 e na atividade da Na+,K+-ATPase após trinta minutos da administração intraestriatal de MMA (6 μmol/ 2 μl) também foi avaliado. O tratamento com 7-NI (60 mg/kg, i.p.) potencializou as convulsões, aumentou a carbonilação protéica e reduziu a produção de NO2 e NO3 induzidos pelo MMA, entretanto, este tratamento não alterou a atividade da Na+,K+-ATPase. A adminstração intraestriatal de L-arginina (50 nmol/ 0.5 μl), mas não de D-arginina (5 and 50 nmol/ 0.5 μl), aumentou a produção de NO2 e NO3 e preveniu as convulsões, a carbonilação protéica e a inibição da atividade da Na+,K+-ATPase induzidos pelo MMA. Esses resultados sugerem que o óxido nítrico neuronal pode exercer um efeito protetor sobre as convulsões bem como nas alterações neuroquímicas evidenciadas neste modelo de acidemia orgânica. Concluindo, estes resultados ampliam o papel dos radicais livres nas alterações comportamentais e neuroquímicas induzidas pela administração intra-estriatal de MMA.

O ácido glutárico (AG) é o principal metabólito acumulado nos tecidos e fluidos corporais de pacientes afetados por acidemia glutárica tipo I (AG I), um erro inato do metabolismo da via catabólica dos aminoácidos lisina, hidroxilisina e triptofano causado pela deficiência severa da atividade da enzima glutaril-CoA desidrogenase. Clinicamente, os pacientes apresentam macrocefalia ao nascimento e uma hipomielinização ou desmielinização progressiva do córtex cerebral. Crises de descompensação metabólica com encefalopatia aguda ocorrem nestes pacientes principalmente entre 3 e 36 meses de vida, levando a uma marcada degeneração estriatal, que é a principal manifestação neurológica da doença. Depois de sofrer essas crises, os pacientes apresentam distonia e discinesia que progridem rapidamente e os incapacita para as atividades normais. Apesar dos sintomas neurológicos severos e achados neuropatológicos com atrofia cerebral, os mecanismos que levam ao dano cerebral na AG I são pouco conhecidos. O objetivo inicial do presente trabalho foi desenvolver um modelo animal por indução química de AG I através da injeção subcutânea do AG em ratos Wistar de forma que os níveis cerebrais deste composto atinjam concentrações similares aos encontrados em pacientes (~0,5 mM) para estudos neuroquímicos e comportamentais. Observamos que o AG atingiu concentrações no cérebro aproximadamente 10 vezes menores do que no plasma e 5 vezes menores do que nos músculos cardíaco e esquelético. O próximo passo foi investigar o efeito desse modelo sobre parâmetros do metabolismo energético no cérebro médio, bem como nos tecidos periféricos (músculo cardíaco e músculo esquelético) de ratos de 21 dias de vida Verificamos que a produção de CO2 a partir de glicose não foi alterada no cérebro médio dos ratos, bem como a atividade da creatina quinase no cérebro médio, músculo cardíaco e músculo esquelético. A atividade do complexo I-III da cadeia respiratória estava inibida em cérebro médio de ratos (25%), enquanto no músculo esquelético estavam inibidas as atividades dos complexos I-III (25%) e II-III (15%) e no músculo cardíaco não foi encontrada nenhuma inibição dos complexos da cadeia respiratória. Em seguida, testamos o efeito in vitro do AG sobre os mesmos parâmetros do metabolismo energético e observamos uma inibição das atividades do complexo I-III (20%) e da sucinato desidrogenase (30%) no cérebro médio na concentração de 5 mM do ácido. A produção de CO2, a partir de glicose e acetato, e a atividade da creatina quinase não foram alteradas pelo AG no cérebro médio dos animais. Assim, concluímos que o AG interfere no metabolismo energético celular, o que poderia explicar, ao menos em parte, a fisiopatogenia da AG I.

A G6PD é expressa em todos os tecidos, onde catalisa a primeira etapa da via das pentoses-fosfato. O NADPH produzido pela ação da G6PD serve como doador de elétrons na biossíntese redutora. Pelo fato de os glóbulos vermelhos não terem mitocôndria, a via das pentoses-fosfato é a única fonte de NADPH e essencial para sua proteção contra o stress oxidativo. A deficiência da G6PD é classificada como anemia hemolítica hereditária ligada ao cromossomo X, associada a manifestações clínicas heterogêneas. O gene da G6PD possui cerca de 140 variantes moleculares já descritas, muitas dessas associadas à enzimopatia. Considerando-se a alta freqüência populacional da deficiência de G6PD, a constituição da população do Rio Grande do Sul e as dificuldades diagnósticas desta deficiência, este trabalho teve como objetivo caracterizar os aspectos laboratoriais do diagnóstico da deficiência de G6PD em nosso meio. Para a quantificação da atividade da G6PD, foi utilizado o método enzimáticocolorimétrico com normalização da hemoglobina (kit intercientífica) e para as análises moleculares foram investigadas as mutações 202, 376 e 563 por PCR/RFLP. O presente estudo revelou uma prevalência combinada de 7,9% das duas formas de deficiência de G6PD (completa e parcial) no Rio Grande do Sul, com alta prevalência de pacientes parcialmente deficientes e sem correlação com origem étnica. Usando técnicas bioquímicas e moleculares, foi caracterizada a deficiência de G6PD em amostras de Porto Alegre como sendo principalmente devida às mutações G202A e A376G, representando a variante G6PD A-, confirmando uma distribuição homogênea do padrão G6PD A- no Brasil. Os resultados apresentados aqui demonstraram que as condições de estocagem (temperatura principalmente) desempenham um papel fundamental na atividade da G6PD, especialmente nas coletas em papel filtro. Na avaliação da acurácia do método enzimático de medida da atividade da G6PD as sensibilidades e especificidades calculadas para os valores de cut-off estabelecido em uma população normal foram: para 2,9 U/gHb ( 11,4% e 100%), para 8 U/g Hb (77,1% e 94,7%) e para 11,5 U/g hb (97,1% e 76,3%). Estima-se que a deficiência de ambas as formas combinadas de G6PD seja de aproximadamente 8% numa amostra do RS. A partir de uma probabilidade pré-teste de 8,0%, após a realização do ensaio enzimático, a probabilidade pós-teste de uma pessoa ser deficiente de G6PD com nível enzimático inferior a 8 U/g Hb passa a ser 55,9%. Ao passo que para níveis superiores a 11,5 U/gHb esta probabilidade de deficiência diminui para 0,37%. Pode-se concluir que o método empregado (kit Intercientífica) foi adequado para avaliar a atividade enzimática de G6PD em amostras de sangue total. É um método capaz de detectar a deficiência de G6PD, demonstrando de forma satisfatória o grau de deficiência em indivíduos que possuem mutações que causam deficiência enzimática menos severa, inclusive mulheres heterozigotas. A análise molecular pode identificar o tipo de variante mas não pode indicar o risco real para as mulheres portadoras, que é diretamente estimado pelo nível de atividade enzimática.

Resumo não disponível

A homocistinúria é um erro inato do metabolismo de aminoácidos causado pela deficiência severa na atividade da enzima cistationina β-sintase, o que resulta no acúmulo tecidual de homocisteína e metionina. Pacientes afetados geralmente apresentam aterosclerose, retardo mental, convulsões e isquemia cerebral. Entretanto, os mecanismos fisiopatológicos responsáveis por estas manifestações são pouco conhecidos. A isquemia cerebral é caracterizada por uma redução grave ou pelo bloqueio completo do fluxo sanguíneo normal em alguma região do cérebro, geralmente causada por um trombo ou uma hemorragia. O estresse oxidativo parece ser um dos principais mecanismos envolvidos no dano celular induzido por isquemia e a administração de antioxidantes, em alguns casos, pode prevenir alguns desses danos. Considerando que: a) pacientes com homocistinúria apresentam alterações neurológicas e que são mais suscetíveis à isquemia, b) o estresse oxidativo parece estar envolvido na fisiopatogenia tanto da homocistinúria quanto da isquemia cerebral c) o ácido fólico reduz os níveis plasmáticos de homocisteína e pode ter efeitos antioxidantes, e) o pré-tratamento com vitaminas E e C previne os efeitos da Hcy sobre a Na+, K+-ATPase e sobre a memória, neste trabalho nós verificamos os efeitos in vivo e in vitro da homocisteína sobre fatias de hipocampo de ratos submetidas à privação de oxigênio e glicose, um modelo in vitro de isquemia cerebral, e também os efeitos do pré-tratamento com antioxidantes, vitamina E mais C e ácido fólico sobre o dano celular causado pela homocisteína. Os resultados mostraram que a homocisteína in vitro (100 e 500 μM), aumentou a liberação de lactato desidrogenase (LDH) para o meio de incubação, sugerindo um aumento no dano celular causado pela isquemia. Além disso, tanto o modelo agudo quanto o crônico de hiperhomocisteinemia aumentou a morte celular quando os animais foram sacrificados 1 hora após a administração de homocisteína. Nossos resultados também mostraram que o pré-tratamento com ácido fólico foi capaz de prevenir completamente o dano causado pela administração aguda de homocisteína, enquanto que a vitamina E preveniu apenas parte deste efeito. Estes achados podem ser relevantes para explicar, pelo menos em parte, a maior susceptibilidade dos pacientes hiperhomocisteinêmicos de apresentar eventos issquêmicos e apontam uma possível estratégia de prevenção. / Homocystinuria is an inherited metabolic disorder caused by severe deficiency of cystationine β-synthase activity, resulting in the tissue accumulation of homocysteine and methionine. Affected patients usually present atherosclerosis, mental retardation, seizures, and stroke. However, the physiopatological mechanisms are not yet fully established. Cerebral ischemia is defined as a severe reduction or blockage of normal blood flow in the brain, usually caused by thrombosis or hemorrhage. Oxidative stress seem to be one of major mechanisms involved on cellular damage induced by ischemia, and antioxidants administration, sometimes, can prevent this damage. Considering that: a) homocystinuric patients present neurological alterations and are more susceptible to ischemia, b) oxidative stress is involved on pathogenia such of homocystinuria as of cerebral ischemia, c) folic acid reduces the serum levels of homocisteine and could have antioxidant effects, c) pretreatment with vitamins E and C prevent the effects of homocysteine on Na+, K+-ATPase activity and on memory, in this work we verified the in vivo and in vitro effects of homocysteine on rat hippocampal slices exposed to oxygen and glucose deprivation, an in vitro model of cerebral ischemia, we also investigated the effects of pretreatment with antioxidants, vitamin E plus C and folic acid on cellular damage caused by homocysteine. Results showed that homocysteine in vitro (100 and 500μM), both chronic (1 h after homocysteine administration) and acute hyperhomocysteinemia increased the LDH release to the incubation medium, suggesting an increase of tissue damage caused by ischemia. Furthermore, results showed that both chronic (1 h after homocysteine administration) and acute hyperhomocysteinemia increased the cellular death. Our results also demonstrated that pretreatment with folic acid completely prevented the damage caused by acute homocysteine administration, whereas vitamin E just partially prevented such effect. These findings may be relevant to explain, at least in part, the higher susceptibility of hyperhomocysteinemic patients to bear ischemic events and point to a possible preventive treatment.

A S100B é uma proteína ligante de cálcio astrocítica que, além de sua função intracelular sobre o citoesqueleto, tem um efeito trófico ou apoptótico sobre neurônios, dependendo de sua concentração. Esta proteína é marcadora de ativação glial durante dano ao sistema nervoso central. O dano neurológico associado ao Diabetes Melito está sendo investigado em modelos experimentais usando estreptozotocina e, alterações neuronais são atribuídas ao déficit insulínico resultante. Recentemente, o efeito neurotóxico da estreptozotocina foi caracterizado. Ratos hiperglicêmicos apresentam alterações no conteúdo de S100B e condições hiperglicêmicas prejudicam a viabilidade de astrócitos, mas não a de células de glioma. Neste trabalho nós investigamos as alterações bioquímicas e morfológicas de astrócitos e células de glioma C6 cultivadas em um meio com alto conteúdo de glicose Nossos resultados demonstraram uma diminuição no imunoconteúdo de S100B (e de proteína ácida fibrilar glial) em astrócitos corticais e células de glioma C6 de ratos expostas a um meio com alto conteúdo de glicose. Entretanto, astrócitos exibiram uma redução na secreção basal de S100B, enquanto, células de glioma C6 demonstraram um aumento nesta secreção. Além disso, a captação de glutamato não foi modificada em astrócitos, mas aumentou significativamente em células de glioma C6. Estas mudanças astrocíticas podem contribuir para a patofisiologia das desordens do sistema nervoso central induzidas pelo diabetes, bem como, para as alterações neuronais associadas às atividades de tumores derivados de astrócitos. Tais alterações específicas nas atividades astrocíticas são devido a um efeito direto do meio com elevada concentração de glicose e não de um efeito tóxico da estreptozotocina ou devido a um déficit de insulina, como observado em outros modelos de estudo. / S100B is an astrocyte calcium-binding protein that, beyond its intracellular role in the cytoskeleton, has a trophic or apoptotic effect on neurones, depending on its concentration. This protein is a marker of glial activation during brain injury. Neurological damage associated with Diabetes mellitus has been commonly investigated in experimental models using the streptozotocin, and neural changes are attributed to the resulting insulin deficit. More recently, the direct neurotoxic effect of streptozotocin has also been characterized. Hyperglycaemic rats show changes in brain S100B content and a high-glucose supply impairs viability of astrocytes, but not of glioma cells. Here we investigated biochemical and morphological alterations in astrocytes and C6 glioma cells cultured in high-glucose medium. We found a decrease in the immunocontent of S100B (and glial fibrillary acidic protein) in both rat cortical astrocytes and C6 glioma exposed to high-glucose medium. However, astrocytes exhibited a decrease in basal S100B secretion, while glioma cells demonstrated an increment. Moreover, glutamate uptake was not modified in astrocytes, but was significantly increased in C6 glioma cells. These astrocyte changes may contribute to the underlying pathophysiology of diabetes-induced brain disorders, as well as neurological alterations associated with activities of astrocyte-derived tumors. Such specific alterations in astrocyte activities are due to a direct effect of high-glucose medium and not to a toxic effect of streptozotocin or to an insulin deficit, as observed in other models of investigation.

Os nucleotídeos extracelulares são importantes moléculas sinalizadoras, sendo essenciais para o início e manutenção de reações inflamatórias. Estão envolvidos no recrutamento de leucócitos e mastócitos ao sítio inflamatório, na ativação da vasculatura e no prolongamento da ativação inflamatória. Durante o processo inflamatório, o ATP exerce uma série de efeitos. Está envolvido no desenvolvimento da inflamação por um conjunto de ações combinadas: liberação de histaminas de mastócitos, provocando produção de prostaglandinas e produção e liberação de citocinas de células do sistema imune. A adenosina é um potente mensageiro extracelular e tem sido demonstrado que sua produção é aumentada em condições metabólicas desfavoráveis. Os nucleotídeos extracelulares podem ser hidrolisados por uma variedade de enzimas localizadas nas membranas celulares ou presentes na forma solúvel no meio intracelular e/ou extracelular. Assim, as ectonucleotidases desempenham um importante papel no controle da homeostasia dos níveis de nucleotídeos e nucleosídeos extracelulares. Estas enzimas estão ancoradas na membrana plasmática e possuem seu sítio catalítico voltado para o meio extracelular. Entre elas, pode-se destacar a família das ecto-nucleosídeo trifosfato difosfoidrolases (E-NTPases), a família das ecto-pirofosfatase/fosfodiesterase (E-NPP) e a ecto-5´- nucleotidase. Considerando-se o papel pró-inflamatório do ATP e que a adenosina pode atuar como um imunomodulador, neste estudo foi avaliado o efeito in vitro e in vivo do lipopolissacarídeo sobre as ectonucleotidases de linfócitos e plaquetas e as formas solúveis presentes em soro. Nos resultados in vitro, observamos um aumento na hidrólise dos nucleotídeos em linfócitos e na hidrólise de ADP e AMP em plaquetas. Em soro, ocorreu uma diminuição da atividade da NPP. In vivo, observamos um aumento na hidrólise dos nucleotídeos em linfócitos e um decréscimo na hidrólise de todos os nucleotídeos testados em soro. Esses resultados nos permitem observar que as ectonucleotidases apresentam suas atividades diferentemente alteradas in vitro e após a indução de endotoxemia pela administração de LPS. As alterações observadas sugerem que estas enzimas podem atuar na regulação dos níveis extracelulares de nucleotídeos e nucleosídeos em um modelo capaz de desencadear processos inflamatórios. / Extracellular nucleotides are important signalling molecules, which are essential for the beginning and maintenance of inflammatory reactions. They are involved on leukocytes and mastocytes recruitment to the inflammatory site, vascular activation and in the maintenance of inflammatory activation. During the inflammatory process, ATP exerts a number of actions. It has been involved in the inflammation development by a conjunct of actions: release of histamines from mastocytes, triggering prostraglandine production and release of cytokines from immune cells. Adenosine is a potent extracellular messenger and it has been shown that its production is increased under adverse metabolic conditions. Extracellular nucleotides can be hydrolyzed by a variety of extracellular enzymes located on cell membranes or present in soluble forms on the extra and/or intracellular milieu. Thus, ectonucleotidases play an important role in the control of homeostasis on nucleotide and nucleoside levels. These enzymes are anchored in the plasmatic membrane and their catalytic site is faced to the extracellular milieu. These enzymes comprise the ecto-nucleoside triphosphate diphosphohydrolyse family (NTPDases), the ecto-nucleotide pyrophosphatase/phosphodiesterase family (ENPP) and the ecto-5´- nucleotidase. Considering the proinflammatory role of ATP and that adenosine can exert immunomodulatory actions, here we evaluate the in vitro and in vivo effect of lipopolysaccharyde on the ectonucleotidases from lymphocytes, platelets and blood serum of rats. In vitro results have shown an increase on nucleotide hydrolysis in lymphocytes and on ADP and AMP hydrolysis in platelets. In serum, it has been demonstrated a decrease on NPP activity. In vivo, we observed an increase on nucleotide hydrolysis in lymphocytes and a decrease in the hydrolysis of all nucleotides tested in serum. These results suggest that the ectonucleotidases present their activities differentially altered in vitro and after the induction of endotoxemia by LPS administration. The changes observed suggest that these enzymes can act in the regulation of extracellular nucleosides and nucleotides in a model able to trigger inflammatory process.

A fenilcetonúria é um erro inato do metabolismo dos aminoácidos, bioquimicamente caracterizado pela deficiência da atividade da fenilalanina hidroxilase, enzima que catalisa a hidroxilação da fenilalanina em tirosina, na presença do cofator tetraidrobiopterina. A deficiência desta enzima leva ao acúmulo de fenilalanina no plasma e tecidos dos pacientes fenilcetonúricos. A principal característica clínica desses pacientes é retardo mental e outros achados neurológicos, cuja base bioquímica ainda é um enigma. No presente trabalho, investigamos o papel do estresse oxidativo na fisiopatologia da fenilcetonúria. Primeiramente, avaliamos diversos parâmetros de estresse oxidativo em plasma e eritrócitos de pacientes fenilcetonúricos no momento do diagnóstico (pacientes com idade entre 2 e 20 anos). Observamos que as espécies reativas ao ácido tiobarbitúrico estavam marcadamente aumentadas, enquanto a medida da reatividade antioxidante total estava significantemente diminuída em plasma e a atividade da enzima antioxidante glutationa peroxidase estava reduzida em eritrócitos de pacientes fenilcetonúricos ao diagnóstico. Em seguida, avaliamos alguns parâmetros de estresse oxidativo em amostras de pacientes submetidos ao tratamento para a fenilcetonúria, que consistiu em uma dieta pobre em fenilalanina, através da eliminação de alimentos com alto conteúdo protéico, associada à administração de uma fórmula especial contendo outros aminoácidos essenciais. Investigamos dois grupos de pacientes tratados, um grupo com boa resposta bioquímica ao tratamento dietético e outro com altos níveis plasmáticos de fenilalanina, com o intuito de avaliar se as concentrações sanguíneas deste aminoácido estão correlacionadas com o estresse oxidativo. Encontramos um aumento significativo das espécies reativas do ácido tiobarbitúrico no plasma, assim como uma diminuição significativa da medida da reatividade antioxidante total em ambos os grupos de pacientes estudados. Além disso, encontramos uma diminuição significativa da atividade da glutationa peroxidase em eritrócitos dos dois grupos estudados. Não observamos correlação significativa entre os níveis sangüíneos de fenilalanina e os parâmetros de estresse oxidativo estudados. Nossos resultados nos permitem concluir que o estresse oxidativo ocorre em pacientes fenilcetonúricos e, possivelmente, esteja relacionado com a fisiopatologia do dano neurológico encontrado na doença. Além disso, nossos resultados indicam que o estresse oxidativo na fenilcetonúria pode não estar diretamente relacionado com os níveis sangüíneos da fenilalanina. / Phenylketonuria is an inborn error of amino acid metabolism, biochemically characterized by phenylalanine hydroxylase activity deficiency, enzyme that catalyzes the hydroxylation of phenylalanine to tyrosine, in the presence of the cofactor, tetrahydrobiopterin. The deficiency of this enzyme leads to the accumulation of phenylalanine in plasma and tissues of phenylketonuric patients. The main clinical characterization of these patients is mental retardation and other neurological features, whose biochemical basis is an enigma. In the present work we investigated the role of oxidative stress in the pathophysiology of phenylketonuria. First, we evaluated various oxidative stress parameters in plasma and erythrocytes of phenylketonuric patients at diagnosis (patients aged between 2 and 20 years). We observed that thiobarbituric acid-reactive species was markedly increased, whereas total antioxidant activity measurement was significantly decreased in plasma and the activity of antioxidant enzyme glutathione peroxidase was reduced in erythrocytes from phenylketonuric patients at diagnosis. Next, we evaluated some parameters of oxidative stress in samples of patients under treatment for phenylketonuria, that was based on a low-phenylalanine diet by eliminating high-protein foods, associated with a special formula containing others essentials amino acids. We investigated two groups of treated patients, one with a good biochemical response to dietary treatment and the other with high phenylalanine blood levels, in order to evaluate if phenylalanine blood concentration is correlated to oxidative stress. We found a significant increase of plasma thiobarbituric acid-reactive species and a significant decrease of total antioxidant reactivity measurement in both groups of studied patients. Moreover, we found a decrease of glutathione peroxidase activity in erythrocytes of two groups studied. No correlation was observed between phenylalanine blood levels and the oxidative stress parameters studied. Our results allow to conclude that oxidative stress is induced in phenylketonuric patients, and possibly is related to pathophysiology of neurological damage in phenylketonuria. Moreover, our results indicate that oxidative stress in phenylketonuria may not be directly related to phenylalanine blood levels.

A cistinose é uma doença genética letal causada pelo transporte deficiente de cistina para fora dos lisossomos, levando ao acúmulo intralisossomal de cistina na maioria dos tecidos, principalmente no rim. O tratamento precoce com cisteamina, um aminotiol capaz de remover a cistina acumulada nos lisossomos, retarda a evolução da doença. Embora o dano tecidual dependa do acúmulo do dissulfeto cistina, os mecanismos responsáveis por este dano ainda não estão esclarecidos. A sobrecarga de lisossomos com dimetil cistina éster tem sido usada para estudar a patogênese da cistinose. Túbulos renais proximais isolados de ratos e de coelhos, sobrecarregados com dimetil cistina éster desenvolveram deficiência na reabsorção tubular semelhante à observada na síndrome de Fanconi, a principal manifestação clínico-laboratorial da cistinose. Estudos realizados com fibroblastos de pacientes cistinóticos e com células tubulares renais sobrecarregadas com dimetil cistinal éster sugerem que a apoptose está aumentada nesta doença. O acúmulo de cistina também induz queda nos níveis intracelulares de glutationa e de ATP , mesmo com a capacidade mitocondrial geradora de ATP intacta. Considerando que a creatinaquinase é uma enzima tiólica crítica para a homeostasia energética renal e que pode ser alterada por dissulfetos, nós investigamos os efeitos in vivo e in vitro da cistina sobre a atividade desta quinase em rim de ratos Wistar jovens. Os resultados mostraram que a cistina inibiu a atividade da creatinaquinase in vivo e in vitro. A inibição foi do tipo não competitivo e dependente da concentração do inibidor e do tempo de pré-incubação, sendo prevenida e revertida por cisteamina e por glutationa, sugerindo a oxidação de grupos tiólicos essenciais para o funcionamento da enzima. Com o objetivo de investigar se a inibição causada pela cistina era específica para a creatinaquinase renal ou poderia ocorrer também com outras enzimas tiólicas de outros tecidos, nós estudamos os efeitos da sobrecarga de dimetil cistina éster sobre as enzimas tiólicas creatinaquinase e piruvatoquinase, bem com sobre a enzima não tiólica lactato desidrogenase, em rim e córtex cerebral de ratos Wistar jovens. Os animais foram injetados subcutaneamente com dimetil cistina éster na dose de 1,6 μmol/g de peso corporal e/ou cisteamina na dose de 0,46 μmol/g de peso corporal do décimo sexto ao vigésimo dia de vida, tendo sido mortos por decapitação sem anestesia 12 horas após a última injeção. A administração de cistina dimetiléster diminuiu a relação tiol/dissulfeto sem alterar a atividade da lactato desidrogenase, mas inibiu a atividade das duas quinases, tanto no rim, quanto no córtex cerebral. A administração de cisteamina normalizou a relação tiol/dissulfeto e a atividade das duas quinases em ambos tecidos, reforçando a hipótese de que a cistina causa a inibição de enzimas tiólicas, provavelmente por meio da oxidação de grupos tiólicos essenciais para o funcionamento destas enzimas. Considerando que a cistina é um potencial oxidante e o estresse oxidativo pode alterar a função das proteínas tiólicas e induzir apoptose, nós investigamos os efeitos da sobrecarga de cistina dimetiléster sobre vários parâmetros de estresse oxidativo em rim de ratos Wistar jovens. A cistina dimetiléster induziu lipoperoxidação, carbonilação de proteínas, e estimulação da atividade da superóxido dismutase, glutationa peroxidase e catalase, provavelmente por meio da formação de ânions superoxido, peróxido de hidrogênio e radicais hidroxilas. A administração de cisteamina preveniu, ao menos em parte, estes efeitos, sugerindo que este aminotiol aja como um “scavenger” de radicais livres. Considerando todos os resultados em conjunto, podemos presumir que a cistina induz estresse oxidativo, inibindo enzimas tiólicas com consequentes alterações metabólicas, tais como diminuição da homeostasia metabólica e redução dos níveis dos antioxidantes piruvato, creatina epossivelmente glutationa. Se estes efeitos também ocorrerem nos pacientes cistinóticos, eles poderiam contribuir para o dano celular que ocorre nesta doença. / Cystinosis is a lethal genetic disease caused by a lysosomal transport deficiency od cystine, leading to intra-lysosomal cystine accumulation in most tissues, specially in kidney. Early treatment with cysteamine, a cystine-depleting aminothiol, extends life of affected patients. Although tissue damage might depend on accumulation of the disulfide cystine, the mechanisms of tissue damage are not fully understood. Lysosomal loading with cystine dimethyl ester has been used for studying the pathogenesis of cystinosis. Isolated proximal renal tubules from rats and rabbits loaded with CDME developed defective proximal tubular reabsorption, similar to that of Fanconi syndrome in cystinosis Studies performed in fibroblasts of cystinotic patients and in kidney cells loaded with cystine dimethyl ester suggest that apoptosis is enhanced in this disease. Cystine accumulation also induces decrease of glutathione and of intracellular ATP content with intact energy generating capacity of mitochondria. Considering that creatine kinase, a thiol-containing enzyme, is critical for renal energy homeostasis and may be altered by disulfides, we investigated the in vivo and in vitro effects of cystine on this kinase in the kidney of young Wistar rats. Results showed that cystine inhibited in vivo and in vitro the enzyme activity and that this inhibition was of the non competitive type, time and concentration dependent, prevented and reversed by cysteamine and glutathione, suggesting that creatine kinase inhibition was caused by oxidation of essential sulfhydryl groups necessary for the enzyme function. Next, to investigate whether this inhibition was specific for renal creatine kinase, or might occur for other thiol-containing enzymes in other tissues, we studied the effects of cystine dimethylester load on the thiol-containing enzymes creatine kinase and pyruvate kinase, in the kidney and brain of young Wistar rats. We also studied these effects on lactate dehydrogenase, a non-containing thiol enzymae. The animals were injected twice a day with 1.6 μmol/g body weight cystine dimethylester and/or 0.46 μmol/g body weight cysteamine from the 16th to the 20th postpartum day and killed after 12 hours. Cystine dimethylester administration decreased thiol/disulfide ratio and inhibited the two enzyme activities in tissues, but not lactate dehydrogenase activity, a non-containing thiol enzyme. Co-administration of cysteamine normalized thiol/disulfide ratio and the two enzyme activities, reinforcing the hypothesis that cystine inhibits thiol containing enzymes possibly through oxidation of essential thiol groups of the enzymes. Considering that cystine is a potential oxidant and oxidative stress is known to alter the function of thiol containing proteins and induce apoptosis, we investigated the effects of cystine dimethyl ester loading on several parameters of oxidative stress in the kidney of young rats. Cystine dimethyl ester induced lipoperoxidation, protein carbonylation, and stimulated superoxide dismutase, glutathione peroxidase and catalase activities, probably through the formation of superoxide anions, hydrogen peroxide, and hydroxyl radicals. Coadministration of cysteamine prevented, at least in part, those effects, possibly acting as a scavenger of free radicals. Taken together all the results, it can be presumed that cystine induces oxidative stress inhibiting thiol-containing enzymes with consequent metabolic alterations such as diminution of energy homeostasis and reduction levels of the antioxidants pyruvate, creatine, and possibly glutathione. If these effects also occur in cystinotic patients, they could contribute to tissue damage that occurs in this disease.