O presente trabalho teve como objetivo estudar a patogênese das mucopolissacaridoses (MPS), em especial em órgãos de difícil correção pelas terapias atualmente disponíveis, bem como desenvolver novos tratamentos para estas doenças. Nossos estudos em camundongos MPS I e VII evidenciaram um aumento na atividade de proteases, incluindo catepsinas e metaloproteases, que podem contribuir para a patogênese da doença na aorta, articulações e cérebro. Ainda nestes órgãos, foi observada a ativação de vias inflamatórias, como o sitema complemento e a via dos receptores toll like, bem como um processo neuroinflamatório, e também podem ter papel fundamental no aparecimento das anormalidades. Dois protocolos de terapia gênica foram testados e, enquanto a microencapsulação celular atingiu apenas uma correção transitória in vivo (possivelmente por uma formação de fibrose pericapsular), o uso de um vetor retroviral levou a níveis séricos de alfa-L-iduronidase (IDUA) superiores aos níveis normais, com correção da doença no sistema nervoso central. Por fim, o uso da terapia de reposição enzimática desde o nascimento demonstrou uma melhora nas vísceras, especialmente aorta e válvulas cardíacas, e uma redução na formação de anticorpos contra a enzima. De forma surpreendente, a enzima foi detectada no cérebro dos animais, sugerindo que a mesma atravessa a barreira-hemato-encefálica. Nossos dados em conjunto sugerem a participação de vias inflamatórias e proteases na patogênese das MPS, e enquanto o tratamento com as microcapsulas ainda apresenta limitações, a terapia gênica com o retrovírus e a terapia de reposição enzimática desde o nascimento se mostram como alternativas viáveis e promissoras. / In this work we aimed to study the pathogenesis of mucopolysaccharidosis (MPS), especially organs that have been described as difficult-to-reach by current therapies. We also aimed to evaluate new therapies for these diseases. Our studies focused on MPS I and VII mice showed an increase in the activity of proteases, including cathepsins and metallopeptidases, that can contribute to the disease pathogenesis in the aorta, joints and brain. In the same organs, we observed activation of inflammatory pathways, including the complement system, the toll-like recetor pathway and a neuroinflammatory process, who can also contribute to the abnormalities observed. Two gene terapy protocols were tested and, while the cell encapsulation only achieved transient correction in vivo (possibly due to a pericapsular fibrosis), the use of a retroviral gene vector reached supernormal serum IDUA levels and correction of brain abnormalities. Finally the use of enzyme replacement therapy from birth showed improvements in visceral organs, specially the aorta and heart valves, and a reduction in the levels of serum anti-IDUA antibodies. Surprisingly, the enzyme could be detected in the brain, suggesting that a fraction crosses the blood-brain-barier. Our data altogether suggest the participation of inflammatory pathways and proteases in the pathogenesis of MPS, and although the treatment with microcapsules still presents limitations, retroviral gene therapy and enzyme replacement therapy started from birth are promising treatment alternatives.

A pré-eclâmpsia (PE) é causa importante de mortalidade fetal e materna em todo mundo e existem evidências que a resistência à insulina esteja implicada em sua fisiopatologia. A via Akt/PKB é estimulada pela insulina e exerce várias funções vitais como crescimento, sobrevivência e metabolismo celular. Objetivo: investigar a expressão basal da Akt/PKB, proteínas que regulam sua atividade e de seus substratos em placenta, músculo esquelético e adipócitos de parturientes normais e com pré-eclâmpsia. Método: amostras de 17 pacientes normais e 17 pacientes com PE foram coletadas, preparadas e analisadas por Western blot para quantificação da expressão de proteínas envolvidas na cascata de sinalização da Akt/PKB. Resultados: em placentas a expressão basal da P85 foi 1,12 (0,83 – 1,62 mediana e percentils 25 - 75), para normais e 1,29 (0,89 – 1,96) para PE com p = 0,42; a expressão da Akt/PKB total foi 1,85 (1,07 - 3,12) para normais e 1,53 (1,27-3,08) com p = 1,00. A atividade dos substratos da Akt/PKB fosforilados em serina e treonina foi semelhante entre placentas de parturientes normais e PE, e a expressão da HSP90 também se mostrou semelhante entre os dois grupos. No músculo esquelético a expressão da P85 foi de 1,41 (1,20 - 6,29) para normais e 1,63 (1,32- 1,90) para PE com p = 0,91. A expressão de Akt/PKB total foi de 0,96 (0,84 - 1,31) para normais e 1,55 (0,87 - 1,86), p = 0,41. A atividade dos substratos da Akt/PKB fosforilados em serina e treonina foi semelhante nesse tecido entre normais e PE, e a expressão da HSP90 também se mostrou semelhante entre os dois grupos no músculo esquelético. No tecido adiposo a expressão de Akt/PKB total foi 1,10 (0,53 - 1,73) em normais e 1,66 (0,83 - 2,00) em PE com p = 0,37 e a expressão do IRß; 1,58 (0,56 - 3,23) para normais e 2,00 (0,91 - 6,65) para PE com p = 0,53. Conclusões: Não houve diferença na via da Akt/PKB, em estado basal, em placenta e músculo esquelético de pacientes com PE e normais. Contudo, não podemos descartar defeitos nessa via de sinalização como fisiopatologia da PE, pois ainda é necessária a análise dessa via estimulada. / Preeclampsia (PE) is important cause of fetal and maternal mortality around the world and there are evidences that insulin resistance has been implicated in the pathophysiology of preeclampsia. Akt/PKB via is stimulated by insulin and perform several vital functions as growth, survival and cellular metabolism. Objective: to investigate the basal expression of Akt/PKB, proteins that regulate Akt/PKB activity and Akt/PKB substrate in the placenta, skeletal muscle and adipocytes of normal and preeclampsia parturient. Method: samples were collected from 17 normal patients and 17 PE patients, prepared and analyzed by Western blot to quantify the proteins expression involved in signaling cascade of Akt/PKB. Results: the basal expression of P85 in normal placentas was 1.12 (0.83 – 1.62 median and percentiles 25 - 75), and for PE 1.29 (0.89 – 1.96) with p = 0.42; total Akt/PKB expression for normal was 1.85 (1.07 – 3.12) and 1.53 (1.27-3.08) with p = 1.00. The Akt/PKB phospho(ser/thr) substrates activity was not different in placentas of the normal and PE groups and the HSP90 also showed no difference between the groups. In the skeletal muscle the expression of P85 of normal placentas was 1.41 (1.20 – 6.29) and for PE 1.63 (1.32- 1.90) with p = 0.91. Total Akt/PKB expression for normal was 0.96 (0.84 – 1.31) and 1.55 (0.87 – 1.86), p = 0.41. The Akt/PKB phospho(ser/thr) substrates activity was not different in skeletal muscle of the normal and PE groups and the HSP90 also showed no difference between the groups. Total Akt/PKB expression in the adipose tissue of normal placentas was 1.10 (0.53 – 1.73) and for PE 1.66 (0.83 – 2.00) with p = 0.37 and the expression of IRß of normal placentas was 1.58 (0.56 – 3.23) and for PE 2.00 (0.91 – 6.65) with p = 0.53. Conclusions: there was no difference in Akt/PKB via, in basal state, in placentas and skeletal muscle of normal and PE patients. However, we cannot discard defects in this signaling via as pathophysiology of PE, because it is still necessary to analyze this via during stimulation.

Animais tolerantes à anoxia são essenciais para o estudo dos mecanismos capazes de proteger tecidos sensíveis, como o coração e o sistema nervoso, de períodos de reduzida disponibilidade de oxigênio. Por ser um animal terrestre tolerante às reduções ambientais na tensão de oxigênio, o caracol Megalobulimus abbreviatus representa um excelente modelo para a análise da tolerância do sistema nervoso à anoxia. No presente estudo foram avaliados diferentes parâmetros do metabolismo do sistema nervoso central (SNC) de caracóis submetidos aos períodos de 3 h ou 12 h de anoxia e ao período de 15 h de reoxigenação após 3 h de anoxia. Além disso, foi analisada a possível existência de ritmicidade circadiana na atividade da forma ativa da enzima glicogênio fosforilase (GFa) e na concentração de glicose hemolinfática. Os resultados destes estudos demonstraram que a maior atividade GFa nos gânglios cerebrais de M. abbreviatus, assim como os níveis mais elevados de glicose hemolinfática do caracol ocorrem no início da escotofase, período de maior atividade comportamental do caracol. A partir desses resultados, foi necessária a utilização de um grupo controle para cada um dos períodos experimentais de anoxia analisados, evitando erros relativos ao período do dia em que os grupos anoxia ou recuperação foram dissecados. A anoxia não causou mudanças na captação de glicose nem na capacidade de síntese de glicogênio do SNC do caracol. Porém, a ausência de oxigênio causou uma redução na atividade das enzimas glicogênio sintase (GS) e glicogênio fosforilase (GF), o que pode sugerir a ativação de um mecanismo de depressão metabólica. Em relação ao metabolismo oxidativo, enquanto a oxidação dos substratos glicose e piruvato manteve-se constante durante a anaerobiose, a atividade da enzima citocromo oxidase (COx) apresentou uma regionalização. Enquanto a região neuropilar central dos gânglios cerebrais apresentou uma redução da atividade COx, as regiões do lobo pedal e do neuropilo lateral mantiveram a atividade enzimática basal, mesmo após 12 h de ausência de oxigênio. Esses resultados, juntamente com a falta de redução na oxidação de glicose e piruvato, sugerem a existência de alguma forma de estoque de oxigênio em M. abbreviatus, capaz de manter o metabolismo oxidativo tecidual mesmo durante a anoxia. O SNC do caracol apresentou uma alta atividade das enzimas antioxidantes catalase (CAT) e superóxido dismutase (SOD), e isto pode ser importante para evitar a geração de qualquer estresse oxidativo durante os constantes ciclos de anoxia/reoxigenação aos quais o animal está submetido no ambiente. Apesar de um pequeno aumento na imunorreatividade ao GABA, verificado nos corpos neuronais às 3 h de anoxia, não ocorreram alterações relativas ao neurotransmissor nas regiões neuropilares dos gânglios cerebrais. Esses resultados não apóiam a hipótese de que o GABA possa estar envolvido nos mecanismos de controle do processo de depressão metabólica em moluscos. De qualquer forma, o caracol M. abbreviatus está bem adaptado às situações de anoxia e reoxigenação, desde que não foi verificada qualquer mortalidade no presente estudo. Sem dúvida, a adaptação às condições anóxicas e de reoxigenação deve depender de um equilíbrio entre a estabilização de algumas variáveis metabólicas e a modificação de outras, como foi observado no presente estudo, mantendo a homeostase do SNC do caracol durante estes períodos. / Anoxia-tolerant animal models are crucial to understand the protective mechanisms available in the tissues sensitive to anoxia, like brain and heart. The snail Megalobulimus abbreviatus is an anoxia-tolerant land snail that has been used as an experimental model to study the effects of anaerobiosis on the nervous system. In the present study, different parameters of the nervous system metabolism were analyzed in animals submitted to anoxia for 3 h or 12 h and animals exposed to a 15 h aerobic recovery period. Moreover, it was analyzed the possible existence of circadian rhythms in the activity of glycogen phosphorylase and in hemolymph glucose levels. The results showed higher phosphorylase activity and hemolymph glucose levels during the scotophase, a period of behavioral activity of these nocturnal snails. Thus, in order to avoid circadian metabolic variations during anoxia experiments, it was used a control group specific to each anoxia experimental period. The anoxia treatment did not alter the glucose uptake and glycogen synthesis in the central nervous system of the snail. However, that condition induces a reduction of the glycogen phosphorylase and glycogen synthase activities, which suggest a possible metabolic arrest. The rates of glucose and piruvate oxidation remain constant during anoxia, but the cytochrome oxidase (COx) activity was variable in the different cerebral regions analyzed. There was a decrease in COx activity in the central neuropil. However, the somata and lateral neuropil of the pedal lobe maintained the COx activity ever after 12 h of anaerobiosis. These results suggest the existence of an oxygen store that supplies the aerobic metabolism even in anoxia. The CNS of the snail showed a high activity of the catalase and superoxide dismutase. These antioxidant enzyme levels could be important to avoid the oxidative stress during the anoxia/reoxygenation cycles. The GABAimmunoreactivity increases in the neuronal somata at 3 h of anoxia. However, in the neuropilar regions no changes were observed in the GABA immunoreactivity. A role for the GABAergic system in the metabolic depression in this snail deserves further investigation. Anyway, Megalobulimus abbreviatus is adapted to anoxic and reoxygenation conditions because no mortality was verified. Undoubtedly, this adaptation depends on balance between stabilization and changes of some variables. This pattern of response maintains the CNS homeostasis during the anaerobiosis and reoxygenation.

A hiperprolinemia tipo II é uma doença autossômica recessiva causada pela deficiência severa na atividade da enzima D1-pirrolino-5-carboxilato desidrogenase, o que resulta em acúmulo tecidual de prolina. Muitos pacientes afetados por essa doença apresentam epilepsia e retardo mental. Embora as manifestações neurológicas sejam encontradas em um considerável número de pacientes hiperprolinêmicos, os mecanismos pelos quais essas ocorrem são pouco compreendidos. Considerando que pouco se sabe a respeito dos altos níveis de prolina no cérebro, os objetivos do nosso estudo foram investigar os efeitos in vivo (agudo e crônico) e in vitro da prolina sobre alguns parâmetros bioquímicos (atividades da acetilcolinesterase e butirilcolinesterase em córtex cerebral e soro de ratos, respectivamente, citocromo c oxidase e Na+,K+-ATPase em córtex cerebral de ratos; captação do glutamato em fatias de córtex cerebral e hipocampo de ratos e hidrólise de nucleotídeos em sinaptossomas obtido de córtex cerebral e em soro de ratos).Também investigamos o efeito do pré-tratamento com as vitaminas E e C ou da administração concomitante desses antioxidantes durante a administração crônica de prolina sobre as alterações causadas pela prolina nos parâmetros de estresse oxidativo, nas atividades da acetilcolinesterase, citocromo c oxidase e Na+,K+- ATPase, na captação do glutamato e no déficit de memória espacial. Em adição, também investigamos o efeito da administração aguda de vitamina E, vitamina C, LNAME e melatonina sobre a alteração causada pela prolina na atividade daacetilcolinesterase, a fim de verificar se esses antioxidantes e o L-NAME seriam capazes de prevenir tal efeito. Os resultados mostraram que a administração aguda de prolina reduziu a atividade da acetilcolinesterase e aumentou a atividade da butirilcolinesterase em homogeneizado e soro de ratos, respectivamente. Verificamos também que a administração aguda e crônica de prolina reduziu a atividade da citocromo c oxidase em córtex cerebral de ratos e que a administração aguda de prolina reduziu a atividade da Na+,K+-ATPase em córtex cerebral de ratos. Além disso, também observamos que a prolina in vitro reduziu a captação do glutamato em córtex cerebral e hipocampo e que a prolina in vivo reduziu a captação do glutamato somente em córtex cerebral. Os efeitos relatados possivelmente ocorreram pela geração de radicais livres, visto que antioxidantes importantes como as vitaminas E e C preveniram esses efeitos, exceto a redução da captação do glutamato. Tais antioxidantes também preveniram o déficit de memória e as alterações de vários parâmetros de estresse oxidativo causados pela prolina, como o aumento da quimiluminescência, a redução do potencial antioxidante total não-enzimático (TRAP) e as alterações nas atividades das enzimas antioxidantes catalase (CAT) e glutationa peroxidase (GSH-Px). Cabe ressaltar que a administração aguda de vitamina E, vitamina C, L-NAME e melatonina também preveniu a ação da prolina causada sobre a acetilcolinesterase. Verificamos também que a administração aguda e crônica de prolina alterou a hidrólise de nucleotídeos adenínicos em sinaptossomas de córtex cerebral e em soro de ratos. Nossos resultados, em conjunto, mostram que a hiperprolinemia tipo II causa uma série de alterações neuroquímicas, as quais podemcontribuir para as disfunções neurológicas características da doença. Além disso, se esses resultados também ocorrerem em humanos, nossos dados referentes à utilização de antioxidantes (vitaminas E e C) poderão ser usados como uma estratégia para o tratamento de alguns sintomas associados com a hiperprolinemia tipo II. / Hyperprolinemia type II is an autosomal recessive disorder caused by the severe deficiency of D1-pyrroline-5-carboxylate dehydrogenase activity, resulting mainly in tissue accumulation of proline. Most patients detected so far show epilepsy and mental retardation. Although neurological dysfunction is commonly found in a considerable number of hyperprolinemic patients, the mechanisms by which this occurs are poorly understood. Considering that very little is known about the role of high sustained levels of proline in brain, the geral objective of the present study was to investigate the in vivo (acute and chronic) and in vitro effects of proline on some biochemicals parameters (activities of acetylcholinesterase and butyrylcholinesterase in cerebral cortex and serum of rats, respectively, cytochrome c oxidase and Na+,K+-ATPase in cerebral cortex of rats; glutamate uptake in cerebral cortex and hippocampus slices of rats and nucleotide hydrolysis in synaptosomes from cerebral cortex of rats and in serum of rats). We also investigated the effect of pretreatment with antioxidants (vitamins E and C) or concomitant administration of these antioxidants during chronic proline treatment on the effects elicited by proline on some parameters of oxidative stress, on the activities of acetylcholinesterase, cytochrome c oxidase and Na+,K+-ATPase, on glutamate uptake and on the deficit of spatial memory. In addition, we also evaluated the influence of acute administration of vitamin E, vitamin C, L-NAME and melatonin on the effects elicited by proline on acetylcholinesterase activity, with the propose to verify if these antioxidants and L-NAME will be able to prevent such effect. The results showed that acute administration of proline reduced acetylcholinesterase activity and increased butyrylcolinesterase activity in homogenate of cerebral cortex and serum of rats, respectively. We also verified that acute and chronic administration of proline reduced the activity of cytochrome c oxidase in cerebral cortex of rats and that acute administration of proline reduced the activity of Na+,K+-ATPase in cerebral cortex of rats. In addition, proline in vitro reduced glutamate uptake in cerebral cortex and hippocampus slices of rats and proline in vivo reduced glutamate uptake just in cerebral cortex. The effects related here possibly occured by the generation of free radicals, since important antioxidants such as vitamins E and C prevented these effects, except the reduction on glutamate uptake. The memory deficit and the alterations on various parameters of oxidative stress caused by proline [increase of chemiluminescence, reduction of total radical-trapping parameter (TRAP) and alterations on the activities of antioxidants enzymes catalase (CAT) and glutathione peroxidase (GSH-Px)] were also prevented by these antioxidants. Acute administration of vitamin E, vitamin C, L-NAME and melatonin also prevented the reduction caused by proline on acetylcholinesterase activity. Besides, we also showed that acute and chronic administration of proline altered the adenine nucleotide hydrolysis in synaptosomes from cerebral cortex of rats and in serum of rats. Our group´s results show that hyperprolinemia type II causes various neurochemical alterations, which may contribute to the neurological dysfunction characteristic of this disease. Furthermore, if these findings also occur in humans, we can suggest that the supplementation with antioxidants should be used as a strategy to the treatment of hyperprolinemia typo II.

A cisteamina (CSH) é um aminotiol redutor formado a partir da via catabólica da coenzima A e é precursora da taurina, um aminoácido abundante no encéfalo e que possui propriedades antioxidantes. A CSH é uma droga depletora de cistina e, quando utilizada precocemente no tratamento da cistinose, retarda a evolução da doença. A cistinose é uma doença metabólica causada pela deficiência do transportador lisossomal de cistina levando à formação de cristais de cistina em diversos órgãos e tecidos, incluindo o sistema nervoso central. Estudos realizados com fibroblastos de pacientes cistinóticos e com células tubulares renais sobrecarregadas com cistina dimetil éster (CDME), um análogo da cistina utilizado para estudar a patogênese da cistinose, sugerem que a apoptose está aumentada nesta doença. Considerando que o estresse oxidativo é um conhecido indutor de apoptose, o objetivo inicial deste estudo foi investigar um possível efeito antioxidante da CSH sobre vários parâmetros de estresse oxidativo em córtex cerebral de ratos jovens. Para os experimentos in vitro, foram utilizados ratos Wistar de 22 dias não tratados e a CSH foi testada nas concentrações finais de 0,25 a 1,0 mM. Os resultados mostraram que a CSH reduziu a lipoperoxidação (LPO), a oxidação do 2′,7′-dihidrodiclorofluoresceina (DCFH), a carbonilação protéica e a atividade da catalase (CAT); e aumentou a atividade da glutationa peroxidase (GSH-Px). No tratamento agudo, ratos de 22 dias de vida receberam três injeções subcutâneas de CSH (0,26 μmol/g de peso corporal), com intervalo de 3 h entre elas e foram mortos 1 h após a última injeção. Os ratos do grupo controle receberam o mesmo volume de solução salina. A CSH reduziu a LPO e a atividade da GSH-Px; e aumentou a carbonilação protéica e a atividade da CAT. A próxima etapa da investigação foi verificar os efeitos da co-administração de CSH sobre os mesmos parâmetros de estresse oxidativo estudados anteriormente em córtex cerebral de ratos submetidos a um modelo experimental de cistinose por administração crônica de CDME. Os animais receberam duas injeções diárias intraperitoneais de CDME (1,6 μmol/g de peso corporal) e/ou subcutâneas de CSH (0,26 μmol/g de peso corporal) do 16º ao 20º dia de vida. Os ratos foram mortos no 21º dia de vida, metade 1 h depois da última injeção e os outros 12 h após a última injeção. O CDME induziu a LPO, a carbonilação protéica e estimulou a atividade das enzimas superóxido dismutase (SOD), GSH-Px e CAT. O CDME diminuiu a relação tióis/dissulfetos. Por sua vez, a co-administração de CSH restabeleceu o equilíbrio redox e preveniu o estresse oxidativo induzido pela administração de CDME. Quando analisados em conjunto, os resultados sugerem que a CSH, além de ser uma droga depletora de cistina intralisossomal, pode ser um seqüestrador de radicais livres, reduzindo a lesão celular por apoptose. Se estes efeitos também ocorrerem nos pacientes cistinóticos, a CSH também pode retardar a evolução da cistinose pelo seu efeito antioxidante. / Cysteamine (CSH) is a reducing aminothiol generated from the coenzyme A catabolic pathway and is the main source of taurine, an abundant amino acid in the brain with antioxidant properties. CSH is a cystine-depleting drug and when used earlier in the treatment of cystinosis, extends life of affected patients. Cystinosis is a metabolic disease caused by deficiency of the lysosomal cystine carrier leading to the formation of cystine cristals in many organs and tissues, including central nervous system. Studies performed in fibroblasts of cystinotic patients and in kidney cells loaded with cystine dimethyl ester, a cystine analog used for studying the pathogenesis of cystinosis, suggest that apoptosis is enhanced in this disease. Considering that oxidative stress is a known apoptosis inducer, the first objective of this study was to investigate a possible antioxidant effect of CSH on several parameters of oxidative stress in the brain of young rats. For the in vitro experiments, non-treated 22-dayold rats were used and CSH was added to the assay at 0.25 to 1.0 mM final concentrations. Results showed that CSH reduced lipoperoxidation (LPO), 2′,7′-dihydrodichlorofluorescein oxidation (DCFH), carbonyl content of proteins and catalase (CAT) activity, and increased glutathione peroxidase activity (GSH-Px). In the acute treatment, 22-day-old rats received three subcutaneous injections of CSH (0.26 μmol/g body weight) at 3 h intervals and were sacrificed 1 h after the last injection. In the control group, rats received the same volumes of 0.85% NaCl. Cysteamine decreased LPO and GSH-Px activity, and increased the carbonyl content of proteins and CAT activity. The next step of this investigation was to verify the effects of CSH co-administration in the same oxidative stress parameters studied before, in cerebral cortex of rats submitted to an experimental model of cystinosis. The animals were injected intraperitoneously twice a day with 1.6 mol/g body weight cystine dimethylester and/or subcutaneously 0.26 mol/g body weight cysteamine from the 16th to the 20th postpartum day. Rats were sacrificed in the 21st day, half 1 h after the last injections, and the others 12 h after the last injection. CDME induced LPO, protein carbonylation, and stimulated superoxide dismutase (SOD), GSH-Px and CAT activities. CDME significantly decreased thiol/disulfide ratio. CSH co-administration restored the redox status and prevented the oxidative stress induced by CDME administration. Taken together, the results suggest that CSH act not only as an intralysosomal cystine-depleting drug but also as a scavenger of free radicals, reducing cell damage by apoptosis. If these effects also occur on cystinotic patients, the antioxidant effect of CSH may contribute to retard the evolution of the disease.

A Doença do Xarope do Bordo (DXB) é um erro inato do metabolismo causado pela deficiência na atividade do complexo da desidrogenase dos α- cetoácidos de cadeia ramificada. Como conseqüência deste bloqueio ocorre o acúmulo dos aminoácidos de cadeia ramificada leucina, isoleucina e valina, bem como de seus respectivos α-cetoácidos e α-hidroxiácidos de cadeia ramificada. A manifestação clínica da DXB varia da forma clássica severa a formas variantes moderadas. Os principais sinais clínicos laboratoriais apresentados pelos pacientes com DXB incluem cetoacidose, hipoglicemia, recusa alimentar, opistótono, apnéia, ataxia, convulsões, coma, atraso no desenvolvimento psicomotor e retardo mental. No entanto, os mecanismos responsáveis pelos sintomas neurológicos apresentados pelos pacientes com DXB ainda são pouco conhecidos. O tratamento para DXB consiste na restrição da ingestão de proteínas, bem como dos aminoácidos leucina isoleucina e valina, suplementada com uma fórmula semi-sintética contendo aminoácidos essenciais, minerais e vitaminas. Estudos in vitro têm demonstrado que os aminoácidos de cadeia ramificada e seus respectivos α- cetoácidos acumulados na DXB estimulam a lipoperoxidação e reduzem as defesas antioxidantes em córtex cerebral de ratos. O objetivo deste estudo foi investigar se o estresse oxidativo ocorre em pacientes com DXB em tratamento ou ainda não tratados. Inicialmente, foram analisados parâmetros de estresse oxidativo em amostras de plasma de pacientes com DXB obtidas antes do início do tratamento (no diagnóstico). Foi observado um aumento significativo das espécies reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS) e uma diminuição significativa da reatividade antioxidante total (TAR). Em seguida foram avaliados parâmetros de estresse oxidativo em plasma de dois grupos de pacientes com DXB em tratamento dietético com níveis plasmáticos baixos e altos de leucina. Verificou-se um marcado aumento do TBARS e uma diminuição significativa do TAR em ambos os grupos de pacientes tratados, porém a redução do TAR foi mais pronunciada nos pacientes com baixos níveis sanguíneos de leucina. Além disso, não foi observada correlação entre os níveis de leucina, isoleucina ou valina com os parâmetros de estresse oxidativo. Em continuidade ao trabalho, foram estudados os níveis de selênio no plasma de pacientes com DXB antes e durante o tratamento dietético, bem como a atividade de enzimas antioxidantes em eritrócitos de pacientes em tratamento. Foi verificado que os pacientes com DXB apresentam uma deficiência moderada de selênio no momento do diagnóstico (antes do tratamento) da doença e que essa deficiência se agrava com o tratamento dietético. Ainda, verificou-se que a atividade da enzima glutationa peroxidase está diminuída em eritrócitos de pacientes em tratamento. Posteriormente, foram medidos vários parâmetros bioquímicos em plasma de pacientes com DXB tratados, com o objetivo de verificar se havia correlação destes com parâmetros de estresse oxidativo. Foi demonstrado que os pacientes com DXB em tratamento apresentam redução nos níveis séricos de glicose, colesterol total, creatinina sérica e albumina e aumento na atividade enzimática da aspartato aminotransferase e da lactato desidrogenase. (Continua). Entretanto, não foram observadas alterações nos níveis de colesterol HDL, colesterol LDL, triglicerídeos, alanina aminotransferase, creatina quinase, uréia e ácido úrico. Foi ainda verificado um aumento significativo de TBARS e uma diminuição significativa de TAR, bem como uma correlação positiva entre a medida de 3 TBARS e os níveis de triglicerídeos. Concluindo, nossos resultados indicam que existe um desequilíbrio entre a produção de radicais livres (aumento) e as defesas antioxidantes (diminuição) gerando estresse oxidativo em pacientes com DXB não tratados e em tratamento e que esse processo não está correlacionado com os níveis plasmáticos dos aminoácidos leucina, isoleucina e valina acumulados nesta doença. Além disso, verificamos que a deficiência de selênio e a concomitante diminuição da atividade da glutationa peroxidase podem estar associados ao desenvolvimento do estresse oxidativo nesta doença. É, portanto, possível inferir que o dano oxidativo contribua, pelo menos em parte, para a fisiopatologia desta doença, explicando o dano neurológico que ocorre nos pacientes afetados. Portanto, é possível que a administração de antioxidantes possa ser útil na DXB. / Maple Syrup Urine Disease (MSUD) is an inborn error of metabolism caused by a deficiency of the branched-chain α-keto acid dehydrogenase complex activity. This blockage leads to accumulation of the branched-chain amino acids leucine, isoleucine and valine, as well as their corresponding α- keto acids and α-hydroxy acids. Clinical manifestations are variable, pending on the variants classical severe form to milder variants. The major clinical features presented by MSUD patients include ketoacidosis, hypoglycemia, poor feeding, opisthotonos, apnea, ataxia, convulsions, coma, psychomotor delay and mental retardation. However, the mechanisms of the neurological symptoms presented by MSUD patients are still poorly understood. MSUD treatment consists of a low protein diet and a semi-synthetic formula poor in leucine, isoleucine, and valina and supplemented by essential amino acids minerals and vitamins. Studies have been showed that the branched-chain amino acids and their corresponding brached-chain α-keto acids accumulating in MSUD stimulate in vitro lipid peroxidation and reduce antioxidant defences in cerebral cortex of rats. The objective of the present study was to investigate oxidative stress parameters in MSUD patients treated and non-treated. First, it was analyzed parameters of oxidative stress in plasma from non-treated MSUD patients. It was observed a significant increase of thiobarbituric acid-reactive species (TBARS) and a marked reduction in total antioxidant reactivity (TAR). Parameters of oxidative stress in plasma from two groups of MSUD patients under dietetic treatment with low and high blood leucine levels were also evaluated. It was verified an increase of TBARS and a significant decrease of TAR in both groups of MSUD patients. However, TAR reduction was higher in the group presenting low leucine levels. On the other hand, it was not found a correlation between leucine, valine and isoleucine levels and oxidative stress parameters. Selenium levels in plasma from MSUD patients at diagnosis (nontreated) and under treatment, as well as the activities of antioxidant enzymes in erythrocytes from treated patients were also determined. MSUD patients presented a significant selenium deficiency at diagnosis which becomes more pronounced during treatment and a decrease of erythrocyte glutathione peroxidase activity during treatment. Subsequently, it was evaluated various biochemical parameters in plasma from MSUD patients during treatment in order to verify if there was correlation between these parameters and oxidative stress. It was demonstrated that MSUD patients under treatment present a reduction of glucose, total cholesterol, albumin and creatinine levels and an increased activity of aspartate aminotransferase and lactate dehydrogenase. However, HDL cholesterol, LDL cholesterol, triglycerides, alanine aminotransferase, creatine kinase, urea and uric acid measurements were not altered. Besides, it was verified a significant increase of TBARS and a significant decrease of TAR, as well as a positive correlation between TBARS and triglycerides levels. In summary, our results suggest an imbalance between the production of free radicals and the antioxidant defenses in MSUD patients leading to oxidative stress at diagnosis and during treatment and that this is not correlated with the amino acids leucine, isoleucine and valine accumulating in this disease. Besides, the selenium deficiency and the decrease of erythrocyte glutathione peroxidase activity could be associated to the development of oxidative stress. Finally, it is possible that oxidative damage may contribute, at least in part, to the pathophysiology of this disorder. If that is the case, antioxidants may serve as an adjuvant therapy in MSUD.

Resumo não disponível

As células estreladas hepáticas (HSCs) são a principal fonte de componentes de matriz extracelular em doenças crônicas do fígado e, por esta razão, exercem um papel fundamental no desenvolvimento e na manutenção da fibrose hepática. Os nucleotídeos e nucleosídeos são moléculas sinalizadoras que regulam diversos processos no fígado e têm um importante papel na patogênese da fibrose hepática. As ecto-nucleosídeo trifosfato difosfoidrolases (E-NTPDases), ecto-nucleotídeo pirofosfatase fosfodiesterases (E-NPPs), ecto-5’-nucleotidase (eNT/CD73) e a fosfatase alcalina tecido inespecífica (TNALP) são enzimas localizadas na superfície celular que regulam a concentração dos nucleotídeos no meio extracelular e, desse modo, modulam os efeitos biológicos mediados por eles via ativação dos receptores P1 e P2. Assim, neste estudo nós comparamos o metabolismo extracelular de nucleotídeos e o nível transcricional das ectoenzimas em HSCs quiescentes e ativadas usando uma linhagem de células estreladas hepáticas murina GRX. Estas células expressam o fenótipo miofibroblástico em meio basal e o tratamento com retinol ou indometacina induz a mudança das células GRX para o fenótipo quiescente das HSCs. Os dois fenótipos das células GRX expressam as NTPDase3 e 5, NPP1, 2 e 3, ecto-5’- nucleotidase e TNALP. Entretanto, apenas as HSCs ativadas expressam a NTPDase6. Nas HSCs quiescentes, a hidrólise de nucleosídeos trifosfatados foi significativamente mais alta e foi correlacionada com o aumento na expressão do mRNA da Entpd3 e ENPP3. Os nucleosídeos difosfatados foram hidrolisados de maneira similar pelos dois fenótipos das células GRX e esta atividade foi associada com o aumento da expressão do mRNA da Entpd5 nas células quiescentes e com a expressão da Entpd6 apenas nas HSCs ativadas. A atividade AMPásica foi maior nas células quiescentes do que nas células ativadas e foi relacionada com o aumento da atividade e da expressão do mRNA da ecto-5’-nucleotidase. O tratamento com retinol também envolve a ativação transcricional da TNALP. Para analisar o papel fisiológico da eNT/CD73 nas HSCs, o mRNA e a expressão desta proteína foram reduzidos nas células GRX utilizando a técnica de RNAi. O knockdown da eNT/CD73 aumentou a expressão do mRNA da TNALP e do colágeno I e alterou a adesão e a migração celular através de um mecanismo independente da hidrólise de nucleotídeos. Nós também avaliamos o efeito da adenosina na regulação de marcadores de ativação das HSCs. Este nucleosídeo diminuiu a proliferação, a migração, a transcrição de colágeno I e das metaloproteinases 2 e 9 e diminuiu a transcrição da eNT/CD73. As diferenças na atividade e expressão das ectonucleotidases entre os dois fenótipos das células GRX sugerem que estas enzimas modulam a concentração de nucleotídeos/nucleosídeos e geram efeitos distintos na sinalização purinérgica nos dois fenótipos e podem ser importantes alvos na regulação das funções das HSCs. / Hepatic stellate cells (HSC) are recognized as a primary cellular source of matrix components in chronic liver disease and, therefore, play a critical role in the development and maintenance of liver fibrosis. Nucleotides and nucleosides are signaling molecules that regulate a variety of activities within the liver and play a role in the pathogenesis of hepatic fibrosis. Ecto-nucleoside triphosphate diphosphohydrolases (E-NTPDases), ecto-nucleotide pyrophosphatase/phosphodiesterases (E-NPPs), ecto- 5’-nucleotidase (eNT/CD73) and tissue non-specific alkaline phosphatase (TNALP) are enzymes that are located at the cell surface and regulate the concentration of extracellular nucleotides, thereby modulating their biological effects by the activation of P1 and P2 receptors. Thus, in the study we compared the extracellular metabolism of nucleotides and transcriptional levels of ectoenzymes in activated and quiescent HSC of the mouse hepatic stellate cell line GRX. This cell line expresses a myofibroblast phenotype in basal medium and both retinol and indomethacin treatment induced a phenotypic change of GRX cells to quiescent HSC. Two phenotypes of GRX cells expressed NTPDase3 and 5, NPP1, 2 and 3, ecto-5’-nucleotidase/CD73 and TNALP. However, only activated HSC expressed NTPDase6. In quiescent HSC, the hydrolysis of triphosphonucleosides was significantly higher and was related to an increase in Entpd3 and ENPP3 mRNA expression. The diphosphonucleosides were hydrolyzed at a similar rate by two phenotypes of GRX cells and this hydrolysis was associated with an up-regulation of Entpd5 mRNA expression in quiescent-like HSC, whilst Entpd6 mRNA expression was observed only in activated HSC. The AMPase activity in quiescent HSC was higher than myofibroblasts and was related to an increase in ecto-5’-nucleotidase activity and its mRNA expression. The treatment with retinol also involves transcriptional activation of TNALP. To analyze the biological significance of eNT/CD73 in HSC, the expression of eNT/CD73 mRNA and protein was reduced in GRX cell line using the technique of RNAi. ENTCD73 knockdown leads to an increase in mRNA expression of TNALP and collagen I, and a clear alteration of cell adhesion and migration by a mechanism not dependent of changes in nucleotide metabolism. We also tested the effect of adenosine on the regulation of activation markers of in HSCs. This nucleotide decreased proliferation, migration, transcription of collagen I and matrix metalloproteinases 2 e 9 and increased transcription of eNT/CD73. The differential ectonucleotidases activities and expressions in two phenotypes of GRX cells suggest that these enzymes modulate the concentration of nucleotides/nucleosides and affect purinergic signaling differently in the two phenotypes and may play a role in the regulation of HSC functions.

Introdução: A Síndrome de Down (SD) é um distúrbio genético complexo atribuído à presença de três cópias do cromossomo 21. O cromossomo 21 extra é de origem materna em quase 95% dos casos, originado por um erro na segregação cromossômica durante a meiose. O único fator de risco reconhecido para erros devido a não-disjunção é a idade materna avançada na concepção. Um estudo preliminar sugeriu que alterações no metabolismo do folato e o polimorfismo C677T do gene MTHFR poderiam ser considerados fatores de risco materno para SD. Objetivos: Este estudo procurou associar alguns fatores genéticos - relacionados aos polimorfismos em genes que codificam enzimas que participam do metabolismo do ácido fólico/homocisteína - e fatores ambientais - relacionados a dosagens de folato e vitamina B12, além de hábitos maternos durante a gestação - como possíveis fatores de risco para SD e suas malformações maiores. Material e Métodos: Foram analisados os polimorfismos C677T e A1298C do gene MTHFR, A2756G do gene MTR, A66G do gene MTRR, 844ins68 do gene CBS e A80G do gene RFC-1 em 239 mães de crianças com SD e 197 mães de crianças normais, através de um estudo caso-controle. Também foram feitas dosagens de folato e vitamina B12 em 150 mães casos e 148 mães controle. Resultados: A distribuição das variantes genotípicas foi comparada entre mães de crianças com SD e mães controle, e não demonstrou diferença estatisticamente significativa quando avaliadas separadamente. Quando a análise foi controlada pela idade materna apenas o polimorfismo C677T do gene MTHFR apresentou tal associação (p=0,05). Os genótipos combinados 677CT ou TT e 1298AA do gene MTHFR aumentaram o risco de SD na prole em quase duas vezes (OR= 1,99; IC95% 1,11-3,55). Além disto, mães que possuem um ou dois genótipos de risco - relacionados a outros polimorfismos que não os do gene MTHFR - têm 4,62 e 5,02 vezes mais chances de ter um filho com SD quando comparadas a mães contoles (IC 95% 1,22-17,46 e 1,36-18,55, respectivamente). A combinação dos genótipos MTHFR CT+TT e MTRR AG+GG foi associada a um aumento de 1,55 (IC95% 1,03-2,35) vezes no risco de ter um filho com SD. Mães de crianças com SD que possuem o alelo 677T apresentaram menores níveis plasmáticos de vitamina B12 (p<0,02). Adicionalmente, a presença do alelo 677T em mães casos resultou em um aumento de 2,07 vezes no risco de ter um filho com SD e defeito congênito do coração (p<0,01). Mães de crianças com SD e malformações cardíacas que possuem os genótipos 677CT ou TT, associado ao não uso de ácido fólico periconcepcional tiveram um aumento de 2,26 vezes no risco de ter um filho com SD e malformações cardíacas. Conclusões: Nossos resultados mostraram que apenas o alelo 677T do gene MTHFR parece estar relacionado à etiologia da SD quando considerado isoladamente. Igualmente, o efeito das combinações de genótipos de risco entre os genes MTR, MTRR, CBS e RFC podem ser considerados fatores de risco pra SD em nossa população. Finalmente, o alelo materno 677T pode estar associado ao aumento na ocorrência de defeitos congênitos do coração em crianças com SD. Pode-se supor que mulheres que possuem este polimorfismo possam obter benefícios a partir da suplementação vitamínica contendo ácido fólico na gestação para proteção contra malformações cardíacas em seus filhos com SD. / Introduction: Down syndrome (DS) is a complex genetic disorder attributed to the presence of three copies of chromosome 21. The extra chromosome derives from the mother in almost 95% of cases and is due to abnormal chromosome segregation during meiosis. Except for advanced age at conception, maternal risk factors for meiotic nondisjunction are not well established. A preliminary study suggested that abnormal folate metabolism and the C677T polymorphism in MTHFR gene may be maternal risk factors for DS. Objectives: This study evaluated the association between genetic factors - related to the polymorphisms in genes that encode enzymes of folic acid/homocysteine metabolism; and environmental factors - related to folate and B12 vitamin, besides maternal habits during pregnancy- as possible risk factors for DS and their major malformations. Material and Methods: We analyzed the polymorphisms C677T and A 1298C of MTHFR gene, A2756G of MTR gene, A66G of MTRR gene, 844ins68 of CBS gene and A80G of RFC-1 gene in 239 mothers of child with DS and 197 normal children, through a casecontrol study. Dosages of folate and B12 vitamin in 150 case mothers and 148 control mothers where also done. Results: The distribution of these genotypic variants was similar between mothers of DS children and control mothers of normal children, and didn’t show statistical significant differences when considered alone. When this analyze was controlled for maternal age, just the C677T polymorphism of MTHFR gene presented a significant association (p=0.05). The combined genotypes 677CT or TT and 1298AA increased the risk of DS offspring (OR= 1.99; 95%CI 1.11-3.55). Besides that, mothers that have one or two risk genotypes - related to other polymorphisms than MTHFRs - have 4.62 and 5.02 more chances of having a child with DS when compared to control mothers. The combined genotypes MTHFR CT+TT e MTRR AG+GG was associated with na incresed risk of de 1.55 fold (IC95% 1,03-2,35) in the risk of having a DS child. Mothers of DS that carry the 677T allele presented the lowest plasmatic levels of B12 vitamin (p<0.02). Additionally, the presence of the 677T allele in case mothers resulted in a 2.07-fold higher risk of congenital heart defects (CHD) in the offspring (p<0.01). In 57 mothers of CHD affected DS child who carry MTHFR 677CC or TT genotypes in combination with no use of periconceptional folate intake had a 2.26 fold increased risk of having any CHD affected DS child in offspring. Conclusions: Our results show that only the 677T allele of MTHFR gene seems to be involved with the etiology of Down syndrome in our population when considered alone. Equally, the effect of risk genotypes combinations among genes MTR, MTRR, CBS and RFC may be considered as a risk factor for DS in our population. And finally, maternal 677T allele may be associated to increased occurrence of congenital heart anomalies in DS child in our population. We can also expect that women who carry this polymorphism can have benefits from periconceptional folate supplementation to protect against CHD in DS offspring.

A acidemia glutárica tipo I (AG I) é um erro inato do metabolismo causado pela deficiência severa da atividade da enzima glutaril-CoA desidrogenase. Bioquimicamente, a AG I caracteriza-se por um aumento nas concentrações dos ácidos glutárico (AG) e 3-hidróxiglutárico (3HG) nos tecidos e líquidos corporais. Os pacientes afetados por essa doença apresentam macrocefalia ao nascimento e hipomielinização ou desmielinização progressiva do córtex cerebral. Crises de descompensação metabólica com encefalopatia aguda ocorrem principalmente entre 3 e 36 meses de vida, levando a uma marcada degeneração estriatal. Após as crises, os pacientes apresentam distonia e discinesia que progridem rapidamente até espasticidade. Apesar de diversos estudos apontarem para efeitos do AG e do 3HG induzindo disfunção energética, estresse oxidativo e excitotoxicidade, os mecanismos fisiopatológicos da AG I ainda são pouco conhecidos. Por outro lado, praticamente nada foi investigado sobre o comportamento de animais submetidos a modelos de AG I. Assim, os objetivos do presente trabalho foram estabelecer um modelo químico de AG I através de injeções subcutâneas de AG em ratos durante uma fase de intenso desenvolvimento do SNC, bem como investigar os efeitos deste modelo sobre o desempenho de ratos em tarefas comportamentais e sobre parâmetros de metabolismo energético em tecidos cerebrais (córtex cerebral e cérebro médio) e músculo esquelético. Observamos que esse tratamento não teve efeito sobre o peso corporal dos animais, bem como sobre a data de aparecimento dos pelos, abertura dos olhos, erupção dos dentes incisivos ou a tarefa do endireitamento em queda livre, indicando que o desenvolvimento físico e motor dos animais não foi alterado. Verificamos também que na tarefa do labirinto aquático de Morris os animais administrados com AG permaneceram por um período de tempo significativamente menor no quadrante alvo (onde a plataforma foi inicialmente colocada), além de permanecer por mais tempo no quadrante oposto ao quadrante alvo. Além disso, os animais administrados com AG também tiveram um menor número de passagens pelo local exato da plataforma e apresentaram uma maior latência para passar pela primeira vez sobre a posição da plataforma no dia do teste, em comparação aos animais controle (administrados com solução salina). Esses resultados indicam que a administração de AG provocou um déficit na memória e no aprendizado dos ratos. Por outro lado, observamos que o comportamento dos ratos na tarefa do labirinto em cruz elevado e no campo aberto não foi alterado pela administração do AG. Em relação aos parâmetros de metabolismo energético, observamos que a administração crônica do AG inibiu significativamente as atividades dos complexos I-III e II e aumentou a atividade do complexo IV da cadeia transportadora de elétrons em músculo esquelético, sem afetar essas atividades enzimáticas nas estruturas cerebrais estudadas. Observamos ainda que a atividade do ciclo de Krebs, medida pela produção de CO2 a partir de acetato, não foi alterada pela administração crônica do AG, porém a atividade da enzima creatina quinase (CK) foi marcadamente reduzida apenas no músculo esquelético dos animais. Esses resultados indicam que a administração crônica do AG provocou um déficit energético em músculo esquelético sem afetar as estruturas cerebrais, o que pode estar relacionado com as diferentes concentrações de AG atingidas nesses tecidos. Outro objetivo deste trabalho foi investigar o efeito combinado in vitro do ácido quinolínico (AQ) que foi recentemente associado à fisiopatologia da AG I, com o AG ou o 3HG e do AG com o 3HG sobre vários parâmetros do metabolismo energético em córtex cerebral de ratos jovens. Observamos que, quando o AG, 3HG ou AQ foram testados isoladamente, ou quando AQ foi co-incubado com o AG ou o 3HG, não foram observadas alterações nos parâmetros de metabolismo energético examinados. Por outro lado, a combinação do AG com o 3HG provocou uma inibição da produção de CO2 a partir de glicose, da atividade da enzima piruvato desidrogenase e a utilização de glicose em córtex cerebral de ratos, bem como um moderado aumento na produção de lactato a partir de glicose, porém de uma forma não significativa. Finalmente, observamos que a atividade da CK, particularmente a fração mitocondrial, foi significativamente inibida pela coincubação do AG com o 3HG e que o GSH ou a combinação das enzimas catalase e superóxido dismutase preveniram totalmente a inibição dessa enzima. Concluindo, demonstramos neste trabalho que a administração crônica de AG compromete o aprendizado/memória especial e inibe o metabolismo energético em ratos jovens. Mostramos também um efeito sinérgico in vitro do AG com o 3HG, alterando vários parâmetros do metabolismo energético. / Glutaric acidemia type I (GA I) is an inborn error of metabolism caused by a deficiency in the glutaryl-CoA dehydrogenase activity. Biochemically, GA I is characterized by the accumulation of glutaric (GA) and 3-hydroxyglutaric (3HG) acids in tissue and body fluids of affected patients, which present macrocephaly at birth and a progressive demyelination of cerebral cortex. Striatal degeneration following metabolic crises is the main neurological finding in this disease, occurring between 3 and 36 months of life. After crises, dystonia and diskinesia progress quickly. Although several studies suggest neurotoxic effects for GA and 3HG inducing energy dysfunction, oxidative stress and excitotoxicity, the pathophysiology of GA I is poorly unknown. However, practically nothing has been done to investigate whether GA, the most pronounced metabolite accumulating in GA I, could provoke deficit of performance in behavioral tasks. In this scenario, the aim of the present work was to establish chemically-induced animal model of GA I by subcutaneous injections of GA during a phase of rapid CNS development. We also aimed to investigate the effects of this model on rat performance in behavioral tasks and on energy metabolism in brain tissues (cerebral cortex and midbrain) and skeletal muscle of rats. It was observed that chronic GA administration did not change the animal body weight, the date of appearance of coat, eye opening or upper incisor eruption, nor the free-fall righting task, indicating that the physical and motor development was not altered. We also verified that GA-treated animals stayed for a significantly shorter time in the target quadrant, where the platform was formerly located, and spent significantly more time in the opposite quadrant as compared to controls (injected with saline). GA-treated rats also had a lower number of correct annulus crossings and presented a higher latency to cross over the platform position than saline-treated animals. These data suggest that early chronic postnatal GA administration caused a long-standing deficit in learning and memory processes of rats. On the other hand, we observed that rat behavior in the elevated plus maze and in the open field was not affected by GA administration. With regards to energy metabolism parameters, we observed that GA treatment significantly inhibited respiratory chain complexes I-III and II and increased complex IV enzyme activity in skeletal muscle, with no effects on these enzyme activities in brain tissues. We also observed that chronic GA treatment did not modify Krebs cycle activity, as assessed by CO2 production from acetate, but markedly inhibited creatine kinase (CK) activity specifically in skeletal muscle. These data indicate that GA administration provoked energy deficit in rat skeletal muscle but not in brain structures. It is possible that this difference in GA effects is related to different GA levels reached in these tissues during the treatment. We also aimed with this work to investigate the combined in vitro effect of quinolinic acid (QA), recently associated to GA I pathophysiology, with GA or 3HG and of GA with 3HG on various parameters of energy metabolism in brain of young rats. We found that when GA, 3HG or AQ were tested isolated, or when QA was co-incubated with GA or 3HG, no alterations were found in the examined parameters. On the other hand, the combination of GA with 3HG resulted in an inhibitition of CO2 production from glucose, pyruvate dehydrogenase enzyme activity and glucose uptake from cerebral cortex, as well as in a mild increase in the lactate production, although non-significantly. Finally, it was observed that CK activity, particularly the mitochondrial fraction, was significantly inhibited by the coincubation of GA with 3HG and that GSH or the combination of catalase and superoxide dismutase enzymes were able to fully prevent this inhibition. Concluding, we here demonstrated that chronic GA administration compromises the learning/memory processes and inhibits energy metabolism in young rats. We also showed a synergic in vitro effect between GA and 3HG, leading to alterations in various parameters of energy metabolism.