Les metal·lotioneïnes (MTs), pèptids amb una excepcional capacitat coordinant, constitueixen una gran família de metal·loproteïnes presents en gairebé tots els éssers vius. L'estudi de les propietats coordinants i estructurals de les diverses isoformes de MT és important per a aportar noves dades a la resolució de les funcions que duen a terme, fins ara relacionades amb la destoxicació de metalls pesants i l'homeòstasi de zinc i coure. En aquesta tesi doctoral s'ha estudiat la metal·lotioneïna del cranc Callinectes sapidus CuMT-II (MTC en aquest treball), per la seva atípica estructura primària dins les MTs de crustaci i per contenir triplets de cisteïna, motiu molt poc habitual en aquestes proteïnes. Aquesta MT s'ha obtingut per enginyeria genètica en medis suplementats amb zinc, amb coure i amb ambdós metalls. Els complexos metàl·lics formats en aquestes síntesis s'han caracteritzat mitjançant ESI-MS, CD, UV i ICP-AES. Així mateix, fent ús d'aquestes tècniques, s'ha aprofundit en les propietats coordinants de MTC mitjançant la reconstitució de la forma demetal·lada apoMTC i la valoració de ZnMTC i apoMTC amb diversos ions metàl·lics. Finalment, s'ha estudiat per RMN la proteïna reconstituïda amb 113Cd.Amb aquests estudis s'ha establert que per a una millor estructuració amb coure, aquesta proteïna també ha de contenir ions zinc i que, a diferència del que estava àmpliament acceptat per a altres metal·lotioneïnes, l'estequiometria dels complexos que estableix MTC amb Cd(II) no s'ajusta exactament amb la que estableix amb Zn(II). Els treballs de RMN han permès establir que l'estructuració de MTC amb ions cadmi té lloc en dos dominis, cadascun dels quals coordina 3 - 4 ions Cd(II).Addicionalment, s'ha aportat noves dades sobre el mecanisme de funcionament de les MTs en el seu paper antiinflamatori en lesions cerebrals, mitjançant l'estudi funcional dels dominis de MT-1 de mamífer en ratolins criolesionats, knockout per MT-1/-2 (amb els gens de MT-1 i MT-2 inactivats), concloent que el domini β presenta unes millors condicions antiinflamatòries. / Metallothioneins (MTs), peptides with an exceptional heavy metal coordination capacity, constitute a superfamily of ubiquitous metalloproteins. Study of MTs metal coordinating properties and their structure is necessary to contribute to the determination of their physiological functions. Nowadays, detoxification of heavy metals and homeostasis of zinc and copper are some of the principal functions proposed for MTs.The principal aim of our work is to study the binding properties of isoform CuMT-II form the crab Callinectes sapidus (MTC), a crustacean MT with an atypical peptide sequence containing two cysteine triplets, which is a very unusual motif in MTs. MTC was obtained by genetic engineering protocols in zinc, copper and zinc plus copper supplemented media. The metal complexes recovered were analyzed by ESI-MS, CD, UV and ICP-AES spectroscopies. Metal coordination properties of MTC were deeper studied by means of metal reconstitution from apoMTC and by titration of ZnMTC and apoMTC with Cd(II) and Cu(I). Structural NMR studies of MTC reconstituted with 113Cd have also been carried out.MTC requires the binding of some Zn(II) ion to acquire the most chiral structure in the presence of Cu(I). Interestingly, cadmium total metallated protein shows slightly higher metal to MT stoichiometries than in the case of zinc in contrast with the equal Zn and Cd stoichiometries shown for most MTs. Moreover, NMR studies have shown that CdMTC is structured in two domains, with 3 - 4 Cd(II) ions in each of them.Additionally, we have contribute to determine the mechanism of MTs anti-inflammatory activity in brain, by studying the rule of the α and β domains of mammalian MT-1 in cryolesioned MTKO mice, which indicate that the β domain shows better anti-inflammatory properties than the α domain.

Les metal·lotioneïnes (MT) són una família de proteïnes d'entre 61 i 68 aminoàcids. Les seves principals característiques són lligar metalls pesants com el Cd 2 +, Zn 2 +, i Cu + i tenir una quantitat elevada de residus de cisteïna (30%), mentre que els aminoàcids aromàtics són absents de la seva composició.En els mamífers s'hi ha trobat fins a 4 isoformes diferents, anomenades MT-I, MT-II, MT-III i MT-IV. Es tracta de proteïnes cel·lulars de localització principalment citoplasmàtica, encara que en algun moment del cicle cel·lular es poden trobar al nucli. La MT va ser inicialment descoberta com una proteïna lligada al Cd i aquesta observació va subministrar la base per la hipòtesi de que estava relacionada amb la reducció de la toxicitat del Cd. Estudis posteriors van demostrar que els nivells de la proteïna s'incrementaven després de l'exposició a l'esmentat metall, la qual cosa va portar a especular amb la idea que la MT estava relacionada amb el segrest intracel·lular d'ions de metalls tòxics.És probable que metalls potencialment tòxics siguin capaços de desplaçar el Zn de la MT basant-se en l'afinitat per la proteïna ( Hg 2 +> Ag +> Cu +>Cd 2 +> Zn 2 + ). El Zn desplaçat podria subministrar més estimul per a la síntesi de MT i a la vegada reduir l'impacte tòxic del metall desplaçat. Altres metalls que s'ha demostrat incrementarien els nivells tisulars de MT inclouen el Cr, Fe, Pb, Mn, Hg i Ni.S'ha volgut aprofitar aquesta propietat de detoxificar metalls de la MT així com els coneixements previs sobre obtenció d'antisèrum policlonal de conill per a la quantificació de MT i aplicar aquestes possibilitats a l'àmbit laboral. Es vol veure si la MT és valida com a monitor de canvis en el medi intern per treballadors exposats a baixes concentracions ambientals de metalls durant periodes llargs de temps.S'ha dissenyat un treball de tipus transversal per observar les diferències en la concentració de metalls i de MT a l'orina de diversos tipus de treballadors i estudiar l'existència d'alguna relació entre la concentració de metalls i de MT.S'ha inclos un grup de soldadors, un grup de treballadors d'una empresa de colorants per a ceràmica i un grup de treballadors d'una empresa química que fabrica sosa caústica d'un alt grau de puresa, a partir de ClNa per un procés d'electrolisi en el qual el Hg hi actua de càtode. Els treballadors de la planta d'electrolisi están exposats exclusivament a vapors de mercuri.Com que la procedència dels treballadors estava fortament polaritzada en els dos extrems de la província de Tarragona es va optar per incloure dos grups control un del Tarragonès i l'altre de les terres de l'Ebre.S'ha determinat la concentració de MT a l'orina mitjançant tècnica de radioinmunoanàlisi, s'ha determinat la concentració de Pb, Cd, Mn, Cr, Ni, Cu i Zn amb la tècnica de l'espectrometria de masses de plasma acoblat inductivament (ICP-MS) i la concentració de Hg mitjançant espectrometria d'absorció atòmica (EAA).A part de l'ocupació i del lloc de residència s'ha tingut en compte altres factors: consum de tabac, consum d'alcohol, edat, enzims de citolisi hepàtica i índex de massa corporal.També s'ha contemplat l'aspecte del dia de la setmana de recollida de la mostra, perquè és sabut que determinats metalls s'acumulen al llarg de la setmana de treball.S'ha optat per realitzar una trasformació logarítmica dels resultats per lograr una normalització en la distribució de les variables.Per estudiar si existeixen diferències en la concentració de metalls i de MT a l'orina entre els grups estudiats s'ha emprat l'anàlisi de la variança o la prova de Kruskal-Wallis, segons l'ha variable hagi resultat de distribució normal o no.Per estudiar la relació entre concentració de metall i de MT a l'orina s'ha optat per la tècnica de la regressió simple, en la qual la concentració de la proteïna d'estudi s'ha situat com a variable depenent. Per estudiar l'efecte net de l'ocupació sobre la concentració de MT s'ha fet servir un model de regressió múltiple que compara un grup de teballadors amb el seu grup control en el qual s'hi ha afegit diversos factors predictius (tabac, alcohol, edat, IMC, enzims hepàtics). La concentració de MT a l'orina també s'ha fet servir de variable depenent.Els resultats obtinguts indiquen que La MT urinària és sensible a les variacions de Pb, Hg, Mn, Cr, Ni, Cu i Zn, però la marcada dependència del Zn i la influència del tabac la fan poc específica per poder ser utilitzada com a monitor d'exposició a metalls en el medi laboral.M. Dolors Batalla i FonollJuliol de 2003OCCUPATIONAL EXPOSURE TO HEAVY METALS.MONITORING VALUE OF METALLOTHIONEINIn working environments there are a variety of situations that can lead to exposure to heavy metals. According to data provided by the Spanish Ministry of Work and Social Affairs for the final term of 2002, about one million workers throughout Spain are potentially subject to exposure. The lack of professional data in medical histories makes it difficult to determine relationships between health disorders and occupational exposure to toxic substances such as heavy metals.On the level of molecular biology, cells generate a general and a specific response to aggression by toxic metals. The object of these responses is to isolate the free-metal fraction, which is what causes problems of cellular toxicity. A ligand that is extremely efficient at this sort of task is a group of proteins known as metallothioneins (MTs). They are located in the cytoplasm, they are of low molecular weight, and they are rich in cis and divalent and monovalent metals, mainly from groups 11 and 12.One of the most outstanding characteristics of MTs is that they can be induced by numerous stimuli. The metals themselves that interact with the protein have been shown to be the most powerful inducers. We felt that it would be interesting to evaluate how MTs could be used as a biological marker of exposure in workers who are chronically exposed to low environmental concentrations of heavy metals.A transversal study was designed to compare groups of 50 workers. Their occupations were: welders, employees in a company that makes colouring for ceramics, and electrolysis cell operatives who are selectively exposed to mercury vapours. Because of the considerable polarization of the location of the companies and the places where the workers lived, two control groups were established: one in the Tarragonès and the other around the Ebre river in the south of Catalonia.Metals were determined in urine using inductively coupled plasma mass spectrometry. MT was determined in urine using radioimmunoassay. We also asked about the subjects' consumption of tobacco and alcohol, obesity, age and hepatic function. The means and group comparisons were studied a priori, always relating the welders/Tarragonès control group, colouring employees/Ebre control group, mercury/Ebre control group and Tarragonès control group/Ebre control group.The results show that there are significant differences in some of the metal contents in the exposed and control groups. The highest concentration of MT was found in the group of welders.The relation between the concentration of each metal and MT in urine for each group of exposed subjects was investigated by the technique of linear regression and it was found that for the group of welders there is no relation between the metals and MT in the urine. On the other hand, the group of ceramic colouring employees show a relation with all the metals studied.A multiple regression test was used to study how occupations affected the MT concentration in pairs of groups, with tobacco, alcohol, hepatic enzyme activity, body mass index and age as adjusting factors. It was found that belonging to the group of welders had an effect on MT concentration and that this effect was statistically significant if the adjusting factors tobacco and age were taken into account. In the other comparisons, belonging to the Ebre control group has a positive effect on the concentration of MT in urine, in the sense that it is higher. Tobacco proved to be a significant predictive factor in all the relationsFrom the above, it can be concluded that MT is sensitive to variations in Pb, Hg, Mn, Cr, Ni, Zn and Cu but that its high dependence on Zn and the influence of tobacco mean that it is not an appropriate biological marker for exposure to heavy metals in a working environment.M. Dolors Batalla i FonollJuliol de 2003

En aquest treball es caracteriza per primera vegada la capacitat de coordinació metàl·lica d'una metal·lotineïna (MT) de planta i es proposa un model de plegament per a les MTs de planta en general. Els resultat mostren que aquestes proteïnes poden tenir un paper molt important en la regulació de l'estat redox de les cèl·lules, probablement a través de la coordinació a Cu.Les MTs de planta són proteïnes molt desconegudes. Es postula que participen en l'homeòstasi del Cu i en la protecció contra l'estrès oxidatiu, però es desconeix la capacitat de coordinació metàl·lica i el plegament. En aquest treball s'han estudiat una metal·lotioneïna d'alzina surera, QsMT, aïllada d'una llibreria de cDNA de fel·lema. Els objectius concrets han estat: (1) estudiar l'expressió de QsMT i la resposta a l'estrès oxidatiu; (2) determinar la capacitat de coordinació metàl·lica i la funcionalitat in vivo; (3) fer una aproximació al plegament de les MTs de planta. L'expressió del gen s'ha estudiat mitjançant hibridació in situ en plàntules i en embrions d'alzina surera. QsMT s'expressa majoritàriament en cèl·lules amb fort estrès oxidatiu, associat a la síntesi de polifenols (suberització i lignificació) i a la senescència. També s'expressa en cèl·lules meristemàtiques, cèl·lules en divisió molt activa on la funció de les MTs podria estar relacionada amb el manteniment de l'estat redox. L'aplicació d'estrès oxidatiu exogen (H2O2 i paraquat) incrementa fortament l'expressió de QsMT en teixits amb expressió constitutiva, confirmant la regulació de l'expressió del gen per estrès oxidatiu.Per l'estudi de les propietats de coordinació metàl·lica es va expressar QsMT en cèl·lules d'E. coli en medi de cultiu suplementat amb Cu, Zn o Cd. Es van aïllar els agregats metàl·lics corresponents i es van analitzar mitjançant tècniques espectroscòpiques i espectromètriques (ICP-OES, ESI-MS i CD). Els resultats mostren que QsMT coordina de forma estable Cu (8 ions metàl·lics/molècula), Zn (4 ions de Zn/molècula) i Cd (6 ions de Cd/molècula), i adopta una estructura especialment quiral en coordinació a Cu. L'elevada capacitat quelant de la proteïna i la quiralitat de l'estructura indiquen que QsMT possiblement té preferència metàl·lica pel Cu i per tant una funció relacionada amb aquest metall in vivo. Estudis de complementació en llevat demostren que QsMT coordina Cu de forma funcional in vivo. En coordinació a Cd QsMT presenta una peculiaritat no observada fins ara en altres MTs: la participació d'ions sulfur en la formació de l'agregat metàl·lic incrementant la capacitat de coordinació metàl·lica (6 ions metàl·lics divalents de Cd enlloc de 4 ions de Zn). A més QsMT coordina Cd de forma funcional en llevat, i per tant la seva funció també podria estar relacionada amb la destoxicació de Cd en la planta.QsMT s'ha utilitzat com a model per fer una aproximació al plegament de les MTs de planta. Amb aquest objectiu vam dissenyar tres pèptids mutants derivats de QsMT: N25 corresponent a la zona rica en cisteïna en posició amino-terminal, C18 corresponent a la zona rica en cisteïna en posició carboxil-terminal, i N25-C18 corresponent a les dues zones riques en cisteïna enllaçades per 4 glicines substituint la zona central de 39 aminoàcids. Es van expressar i estudiar aquests pèptids per les mateixes tècniques utilitzades en l'estudi de QsMT. Els resultats indiquen que QsMT es plega formant un sol agregat metàl·lic per la interacció de les dues zones riques en cisteïna. En aquest model la zona central d'enllaç, típica de les MTs de planta, no participa en la coordinació metàl·lica però és imprescindible per a la funció de la proteïna. El paper de la zona central podria variar en funció del metall que coordina, participant en el plegament i estructura de la proteïna quan coordina Zn i Cd i en la seva regulació i estabilització quan coordina Cu. / In this work we characterize for the first time the metal coordination capacity of a plant metallothionein (MT), and propose a model for the protein folding of plant MTs in general. Results show that these proteins can play a very important role in the regulation of the cellular redox, probably through its copper-coordination ability.Plant MTs are largely unknown proteins. It is postulated that they play a role in copper homeostasis and protection against oxidative stress, but precise function of these proteins, as well as its metal coordination capacity remain unknown.In this work we have studied a cork oak metallothionein, QsMT, isolated from phellem cDNA library. Our main objectives were: (1) to study the QsMT gene expression and its response to oxidative stress; (2) to determine the protein metal coordination properties and the functionality in vivo; (3) to estimate a type of folding for plant MTs.The sudy of the gene expression has been carried out by in situ hybridization in cork oak plants and embryos. QsMT is mainly expressed in cells with high oxidative stress associated to both polyphenol synthesis (suberization and lignification) and senescence. QsMT is also expressed in meristematic cells, where its function could be related to the redox regulation. The oxidative treatment (H202 and paraquat) highly increases gene expression in tissues with constitutive expression, confirming its regulation by oxidative stress.To characterize the protein metal coordination properties we expressed QsMT in E. coli cells in culture medium supplemented with Cu, Zn or Cd. We isolated the corresponding metal aggregates and analyzed them using spectroscopic and spectrometric techniques (ICP-OES, ESI-MS, CD). Results show that QsMT effectively binds Cu (8 ions/molecule), Zn (4 ions/molecule) and Cd (6 ions/molecule), and presents highest chirality when folds with copper. The high binding capacity and chirality of the protein in the presence of copper suggest that QsMT may play a function related to this metal in vivo. Functional complementation studies confirm that QsMT functionally binds copper in vivo. When coordinating Cd QsMT presents a peculiarity not seen in other MTs: the participation of sulfur ions in the formation of the metal aggregate, this increasing the coordination capacity (6 Cd/molecule in contrast to 4 Zn/molecule). Moreover, QsMT functionaly binds Cd in yeast, suggesting that the protein function could also be realted to a Cd detoxification role in plant.We have also used QsMT as a model for the study of the folding of plant MTs. With this aim we designed three mutant peptides derived from QsMT: N25 corresponding to the amino Cys-rich domain; C18 corresponding to the carboxy Cys-rich domain; and N25-C18 corresponding to the two Cys-rich domains linked by 4 glycines in substitution to the central 39 amino acid region. Peptides were expressed and studied using same techniques used for the study of QsMT. Results point to a protein folding in one metal cluster formed by the interaction of the two Cys-rich domains. In this model the central region, typical from plant MTs, does not participate in metal coordination but is indispensable for the protein function. The role of the central region could depend on the metal it coordinates, playing a role in the protein folding and structure when it binds Zn or Cd and a role in protein regulation and stability when it binds Cu.