O objetivo principal do presente estudo foi avaliar a diversidade bacteriana endofítica cultivável associada a plantas de Citrus sinensis (L.) Osbeck sintomáticas e assintomáticas para a doença Greening, com destaque para Methylobacterium spp. Simultaneamente, como objetivo secundário, foi realizado o estudo da comunidade bacteriana endofítica de Methylobacterium spp. presente em plantas de laranja doce com e sem sintomas da Clorose Variegada dos Citros (CVC). Assim, em período chuvoso (novembro de 2008 e fevereiro de 2009) e seco (maio de 2009) foram amostradas dez plantas sadias e dez plantas doentes (Greening e/ou CVC), em dois municípios citrícolas da região central do estado de São Paulo. A confirmação da presença e/ou ausência dos fitopatógenos Candidatus Liberibacter americanus, Ca. L. asiaticus e Ca. L africanus, agentes causadores do Greening e, também, de Xylella fastidiosa, agente causador da CVC foram realizadas para todas as amostras pela técnica PCR a partir da utilização de iniciadores específicos para os respectivos fitopatógenos. Em relação à comunidade bacteriana estudada, foi realizado o isolamento e posterior quantificação do número de unidades formadoras de colônia (UFCs) totais e de Methylobacterium, caracterizadas pela presença de coloração rósea. A análise do sequenciamento parcial da região do gene 16S DNAr e agrupamentos filogenéticos dos isolados amostrados foram as metodologias adotadas para a geração dos resultados. Os resultados revelaram que a quantidade de Methylobacterium spp. isoladas em plantas sintomáticas para as doenças Greening e CVC foi expressivamente superior em relação as plantas sadias, destacando-se as espécies M. fujisawaense e M. radiotolerans, que foram os filotipos mais encontrados nas referidas amostras. As amostras vegetais coletadas em período seco, também, apresentaram maior presença da comunidade metilotrófica. A observação dos resultados da comunidade endofítica cultivável total associada a plantas sintomáticas e assintomáticas para Greening, mostrou que não houve diferenças relevantes quanto as UFCs encontradas nas plantas doentes e sadias. Foram encontradas as classes: Actinobacteria, Alfaproteobacteria, Betaproteobacteria, Gamaproteobacteria e Firmicutes e os gêneros mais frequentes foram Brevundimonas, Alcaligenes e Pantoea. Em relação às características adaptativas de Methylobacterium spp. quanto a situações de estresses, foram verificadas in vitro a produção da enzima ácido aminociclopropano-1-carboxilato deaminase (ACCd) e tolerância aos metais pesados cádmio e chumbo. Dos 62 isolados avaliados, 63% foram capazes de utilizar a molécula de 1-aminociclopropano-1-carboxilato (ACC) como fonte de nitrogênio para seu desenvolvimento. Os testes para tolerância ao metais pesados revelaram que apenas 3 isolados foram capazes de crescer em meio CHOI suplementado com sulfato de cádmio nas concentrações de 2,5 e 5,0 mM. Somente dois isolados se mostraram tolerantes ao chumbo, presente no meio CHOI suplementado com nitrato de chumbo nas concentrações 2,5 mM. Já em 5 mM, apenas um isolado foi capaz de se desenvolver. Os resultados, apresentados mostram a importância de Methylobacterium spp., sobre a comunidade endofítica cultivável de citros em dois diferentes patossistema avaliados, uma vez que em ambos foi observada uma maior quantidade de isolados do gênero em plantas doentes, sugerido uma associação com os respectivos fitopatógenos. A produção de ACCd por Methylobacterium está relacionada entre outros fatores, a interrupção da rota de síntese do etileno, composto relacionado ao estresse vegetal. Assim, a grande quantidade de Methylobacterium em plantas doentes e a produção de ACCd pelas mesmas, possivelmente, estão relacionadas ao favorecimento do patógeno mediante a redução da capacidade de resposta da planta / The aiming of this study was the evaluation of the diversity of endophytic culturable bacterial community associated with Huanglongbing (HLB) symptomatic and no-symptomatic Citrus sinensis (L.) Osbeck plants, highlighting the Methylobacterium spp. Simultaneously, it was evaluated the endophytic Methylobacterium community in sweetie orange with and without Citrus Variegated Chlorosis (CVC) symptoms. Thus, it was sampled ten healthy and no-health plants with HLB and CVC symptoms in raining (November 2008 and February are 2009) and dryed (may 2009) seasons in two provinces at São Paulo State. The presence or absence of the plant-pathogens Candidatus Liberibacter americanus, Ca. L. asiaticus e Ca. L africanus, HLB agents and Xylella fastidiosa, CVC agent, was confirmed using specific primer by PCR for all plant samples. The bacterial communities was accessed by isolation and posteriori quantification of colony forming unit (CFU) to total and Methylobacterium group that was identified according its pink coloration. To the identification and phylogenetic clusterization of the isolates was partially sequenced the 16S DNAr gene. The results showed a higher amount of isolated Methylobacterium spp. from symptomatic plants to HLB and CVC than healthy plant. M. fujisawaense and M. radiotolerans were present in these samples. The plants sampled in dryed season showed a high amount of methilotrific isolates. It was not observed a significant difference of the amount of total bacteria isolated from HLB symptomatic and no-symptomatic plants The identified classes was: Actinobacteria, Alfaproteobacteria, Betaproteobacteria, Gamaproteobacteria and Firmicutes. Brevundimonas, Alcaligenes and Pantoea were the most frequent genera. It was verified the acid aminocyclopropane-1-carboxylate deaminase (ACCd) production and the lead and cadmium tolerance as the adaptative characteristic of Methylobacterium to stress conditions. 63% of the 62 evaluated isolates were able to use the aminocyclopropane-1-carboxylate (ACC) as nitrogen source. Just 3 isolates were able to grow in supplemented CHOI media at 2.5 e 5.0 mM of sulphate of cadmium. Two isolates showed lead tolerance in the same media supplemented with nitrate of lead at 2.5 mM and just one at 5.0mM.The results showed the importance of Methylobacterium spp. to citrus culturable endophytic community in two pathossystem. In both the amount of methylotrofic isolates was higher in symptomatic plants, suggesting its association with the plant-pathogens. The Methylobacterium ACCd production has a relationship with the breaking of ethylen route. This compound is associated with vegetal stress. For this reason the high amount of Methylobacterium from symptomatic plants and the ACCd production probably is correlated with the disease development under the reduction of plant response capacity

A Clorose Variegada dos Citros (CVC), doença que causa graves prejuízos à citricultura no estado de São Paulo, é causada pela bactéria Xylella fastidiosa que é transmitida pelas cigarrinhas Bucephalogonia xanthophis (Berg), Dilobopterus costalimai (Young), Acrogonia citrina (Marucci & Cavichioli) e Oncometopia facialis (Signoret). Durante a alimentação em plantas afetadas, esses insetos adquirem a bactéria, que coloniza o pré-cibário e o cibário, e depois são capazes de transmitir a doença para plantas sadias. Colonizando o xilema das plantas de citros encontram-se também bactérias endofíticas, que são microrganismos capazes de colonizar internamente tecidos de plantas sem causar dano aparente, e que podem interagir com patógenos no interior do hospedeiro. Este trabalho teve como objetivo avaliar a comunidade bacteriana associada as cigarrinhas vetoras de CVC, e observar as possíveis interações que ocorrem entre insetos vetores de X. fastidiosa e bactérias endofíticas de citros. Primeiramente foi feito um isolamento das bactérias da cabeça de cigarrinhas coletadas em pomares de citros afetados com CVC. Foram isoladas um total de 17230 bactérias de três espécies de cigarrinhas (O. facialis, D. costalimai e A. citrina) em três datas diferentes (22/março, 05/maio e 14/junho de 2002), que foram primeiramente classificadas em 9 grupos morfológicos. Do total, 120 bactérias representantes foram avaliadas por ARDRA e classificadas em 16 haplótipos, dos quais alguns foram identificados, por seqüenciamento da região 16S do rDNA, como Methylobacterium sp. e Curtobacterium sp., que são bactérias endofíticas de citros já descritas e que interagem com X. fastidiosa em citros. Primers específicos para estas bactérias foram utilizados para PCRs com o DNA total da cabeça de cigarrinhas e variou de 39,1% a 89,6% nas diferentes espécies. A comunidade bacteriana associada às cigarrinhas foi também avaliada por DGGE e apresentou variações quanto ao inseto hospedeiro e quanto à época das avaliações. Um isolado de M. mesophilicum expressando o gene da proteína verde fluorescente (GFP ? Green Fluorescent Protein) foi utilizado para experimento de transmissão deste endófito por B. xanthophis. Os insetos se alimentaram em membrana contendo a solução da bactéria e depois foram colocados em plantas de Catharanthus roseus. Das plantas, 13% apresentaram a bactéria fluorescente colonizando tecidos endofiticamente, o que indica que a cigarrinha é capaz de transmitir o endófito. Testes para a avaliação da produção de moléculas de quorum sensing (AHLs - Acil Homocerina Lactonas) foram feitos para M. mesophilicum e M. extorquens. Foram ainda desenvolvidos mutantes de M. extorquens, defectivos para a produção de biofilme e AHLs. / The Citrus Variegated Chlorosis (CVC), a very important disease which attacks citrus trees in the state of São Paulo, is caused by the xylem-limited bacteria, Xylella fastidiosa, which is transmitted by four species of sharpshooters (Cicadellidae) Bucephalogonia xanthophis (Berg), Dilobopterus costalimai (Young), Acrogonia citrina (Marucci & Cavichioli) and Oncometopia facialis (Signoret) which are capable of acquiring X. fastidiosa from the xylem while feeding. In plants, endophytic bacteria, which inhabit the interior of aerial plant parts developing an asymptomatic infection and show potential benefits as biocontrol agents of pests and diseases, may colonize the same niche of pathogens, such as X. fastidiosa, what could allow endophytes to interact with the pathogen. Bacteria were isolated from head of insect vectors, collected on affected citrus plants. From 17230 bacteria isolated from the heads of three insect species (O. facialis, D. costalimai and A. citrina) in three different days (22/march, 05/may and 14/june of 2002), 120 bacteria were tested with ARDRA and classified into 16 different haplotypes. The most frequent strains had their 16S rDNA fragment sequenced and they were identified as Methylobacterium sp. and Curtobacterium sp., bacteria which have been described as citrus endophytes which interact with X. fastidiosa. Total DNA of insect heads was used in Nested PCRs for detection of these citrus endophytes in insects. The frequencies of detection ranged from 39,1% to 89,6%. The bacterial community associated to sharpshooters was also evaluated by DGGE and presented variations due to insect host and time of the evaluations. One M. mesophilicum isolate, expressing the GFP (Green Fluorescent Protein), was used to test the transmission of endophytes by B. xanthophis. Insects fed on membranes containing a bacterial solution and after were trapped on Catharanthus roseus. From the evaluated plants, 13% presented the fluorescent protein colonizing endophytically, indicating that the insect is able to transmit the endophytic bacteria. Biofilm and quorum sensing molecules (AHLs - Acyl Homocerine Lactones) production by Methylobacterium sp. were tested, and M. extorquens mutants for both features were produced.

O objetivo principal do presente estudo foi avaliar a diversidade bacteriana endofítica cultivável associada a plantas de Citrus sinensis (L.) Osbeck sintomáticas e assintomáticas para a doença Greening, com destaque para Methylobacterium spp. Simultaneamente, como objetivo secundário, foi realizado o estudo da comunidade bacteriana endofítica de Methylobacterium spp. presente em plantas de laranja doce com e sem sintomas da Clorose Variegada dos Citros (CVC). Assim, em período chuvoso (novembro de 2008 e fevereiro de 2009) e seco (maio de 2009) foram amostradas dez plantas sadias e dez plantas doentes (Greening e/ou CVC), em dois municípios citrícolas da região central do estado de São Paulo. A confirmação da presença e/ou ausência dos fitopatógenos Candidatus Liberibacter americanus, Ca. L. asiaticus e Ca. L africanus, agentes causadores do Greening e, também, de Xylella fastidiosa, agente causador da CVC foram realizadas para todas as amostras pela técnica PCR a partir da utilização de iniciadores específicos para os respectivos fitopatógenos. Em relação à comunidade bacteriana estudada, foi realizado o isolamento e posterior quantificação do número de unidades formadoras de colônia (UFCs) totais e de Methylobacterium, caracterizadas pela presença de coloração rósea. A análise do sequenciamento parcial da região do gene 16S DNAr e agrupamentos filogenéticos dos isolados amostrados foram as metodologias adotadas para a geração dos resultados. Os resultados revelaram que a quantidade de Methylobacterium spp. isoladas em plantas sintomáticas para as doenças Greening e CVC foi expressivamente superior em relação as plantas sadias, destacando-se as espécies M. fujisawaense e M. radiotolerans, que foram os filotipos mais encontrados nas referidas amostras. As amostras vegetais coletadas em período seco, também, apresentaram maior presença da comunidade metilotrófica. A observação dos resultados da comunidade endofítica cultivável total associada a plantas sintomáticas e assintomáticas para Greening, mostrou que não houve diferenças relevantes quanto as UFCs encontradas nas plantas doentes e sadias. Foram encontradas as classes: Actinobacteria, Alfaproteobacteria, Betaproteobacteria, Gamaproteobacteria e Firmicutes e os gêneros mais frequentes foram Brevundimonas, Alcaligenes e Pantoea. Em relação às características adaptativas de Methylobacterium spp. quanto a situações de estresses, foram verificadas in vitro a produção da enzima ácido aminociclopropano-1-carboxilato deaminase (ACCd) e tolerância aos metais pesados cádmio e chumbo. Dos 62 isolados avaliados, 63% foram capazes de utilizar a molécula de 1-aminociclopropano-1-carboxilato (ACC) como fonte de nitrogênio para seu desenvolvimento. Os testes para tolerância ao metais pesados revelaram que apenas 3 isolados foram capazes de crescer em meio CHOI suplementado com sulfato de cádmio nas concentrações de 2,5 e 5,0 mM. Somente dois isolados se mostraram tolerantes ao chumbo, presente no meio CHOI suplementado com nitrato de chumbo nas concentrações 2,5 mM. Já em 5 mM, apenas um isolado foi capaz de se desenvolver. Os resultados, apresentados mostram a importância de Methylobacterium spp., sobre a comunidade endofítica cultivável de citros em dois diferentes patossistema avaliados, uma vez que em ambos foi observada uma maior quantidade de isolados do gênero em plantas doentes, sugerido uma associação com os respectivos fitopatógenos. A produção de ACCd por Methylobacterium está relacionada entre outros fatores, a interrupção da rota de síntese do etileno, composto relacionado ao estresse vegetal. Assim, a grande quantidade de Methylobacterium em plantas doentes e a produção de ACCd pelas mesmas, possivelmente, estão relacionadas ao favorecimento do patógeno mediante a redução da capacidade de resposta da planta / The aiming of this study was the evaluation of the diversity of endophytic culturable bacterial community associated with Huanglongbing (HLB) symptomatic and no-symptomatic Citrus sinensis (L.) Osbeck plants, highlighting the Methylobacterium spp. Simultaneously, it was evaluated the endophytic Methylobacterium community in sweetie orange with and without Citrus Variegated Chlorosis (CVC) symptoms. Thus, it was sampled ten healthy and no-health plants with HLB and CVC symptoms in raining (November 2008 and February are 2009) and dryed (may 2009) seasons in two provinces at São Paulo State. The presence or absence of the plant-pathogens Candidatus Liberibacter americanus, Ca. L. asiaticus e Ca. L africanus, HLB agents and Xylella fastidiosa, CVC agent, was confirmed using specific primer by PCR for all plant samples. The bacterial communities was accessed by isolation and posteriori quantification of colony forming unit (CFU) to total and Methylobacterium group that was identified according its pink coloration. To the identification and phylogenetic clusterization of the isolates was partially sequenced the 16S DNAr gene. The results showed a higher amount of isolated Methylobacterium spp. from symptomatic plants to HLB and CVC than healthy plant. M. fujisawaense and M. radiotolerans were present in these samples. The plants sampled in dryed season showed a high amount of methilotrific isolates. It was not observed a significant difference of the amount of total bacteria isolated from HLB symptomatic and no-symptomatic plants The identified classes was: Actinobacteria, Alfaproteobacteria, Betaproteobacteria, Gamaproteobacteria and Firmicutes. Brevundimonas, Alcaligenes and Pantoea were the most frequent genera. It was verified the acid aminocyclopropane-1-carboxylate deaminase (ACCd) production and the lead and cadmium tolerance as the adaptative characteristic of Methylobacterium to stress conditions. 63% of the 62 evaluated isolates were able to use the aminocyclopropane-1-carboxylate (ACC) as nitrogen source. Just 3 isolates were able to grow in supplemented CHOI media at 2.5 e 5.0 mM of sulphate of cadmium. Two isolates showed lead tolerance in the same media supplemented with nitrate of lead at 2.5 mM and just one at 5.0mM.The results showed the importance of Methylobacterium spp. to citrus culturable endophytic community in two pathossystem. In both the amount of methylotrofic isolates was higher in symptomatic plants, suggesting its association with the plant-pathogens. The Methylobacterium ACCd production has a relationship with the breaking of ethylen route. This compound is associated with vegetal stress. For this reason the high amount of Methylobacterium from symptomatic plants and the ACCd production probably is correlated with the disease development under the reduction of plant response capacity

A Clorose Variegada dos Citros (CVC), doença que causa graves prejuízos à citricultura no estado de São Paulo, é causada pela bactéria Xylella fastidiosa que é transmitida pelas cigarrinhas Bucephalogonia xanthophis (Berg), Dilobopterus costalimai (Young), Acrogonia citrina (Marucci & Cavichioli) e Oncometopia facialis (Signoret). Durante a alimentação em plantas afetadas, esses insetos adquirem a bactéria, que coloniza o pré-cibário e o cibário, e depois são capazes de transmitir a doença para plantas sadias. Colonizando o xilema das plantas de citros encontram-se também bactérias endofíticas, que são microrganismos capazes de colonizar internamente tecidos de plantas sem causar dano aparente, e que podem interagir com patógenos no interior do hospedeiro. Este trabalho teve como objetivo avaliar a comunidade bacteriana associada as cigarrinhas vetoras de CVC, e observar as possíveis interações que ocorrem entre insetos vetores de X. fastidiosa e bactérias endofíticas de citros. Primeiramente foi feito um isolamento das bactérias da cabeça de cigarrinhas coletadas em pomares de citros afetados com CVC. Foram isoladas um total de 17230 bactérias de três espécies de cigarrinhas (O. facialis, D. costalimai e A. citrina) em três datas diferentes (22/março, 05/maio e 14/junho de 2002), que foram primeiramente classificadas em 9 grupos morfológicos. Do total, 120 bactérias representantes foram avaliadas por ARDRA e classificadas em 16 haplótipos, dos quais alguns foram identificados, por seqüenciamento da região 16S do rDNA, como Methylobacterium sp. e Curtobacterium sp., que são bactérias endofíticas de citros já descritas e que interagem com X. fastidiosa em citros. Primers específicos para estas bactérias foram utilizados para PCRs com o DNA total da cabeça de cigarrinhas e variou de 39,1% a 89,6% nas diferentes espécies. A comunidade bacteriana associada às cigarrinhas foi também avaliada por DGGE e apresentou variações quanto ao inseto hospedeiro e quanto à época das avaliações. Um isolado de M. mesophilicum expressando o gene da proteína verde fluorescente (GFP ? Green Fluorescent Protein) foi utilizado para experimento de transmissão deste endófito por B. xanthophis. Os insetos se alimentaram em membrana contendo a solução da bactéria e depois foram colocados em plantas de Catharanthus roseus. Das plantas, 13% apresentaram a bactéria fluorescente colonizando tecidos endofiticamente, o que indica que a cigarrinha é capaz de transmitir o endófito. Testes para a avaliação da produção de moléculas de quorum sensing (AHLs - Acil Homocerina Lactonas) foram feitos para M. mesophilicum e M. extorquens. Foram ainda desenvolvidos mutantes de M. extorquens, defectivos para a produção de biofilme e AHLs. / The Citrus Variegated Chlorosis (CVC), a very important disease which attacks citrus trees in the state of São Paulo, is caused by the xylem-limited bacteria, Xylella fastidiosa, which is transmitted by four species of sharpshooters (Cicadellidae) Bucephalogonia xanthophis (Berg), Dilobopterus costalimai (Young), Acrogonia citrina (Marucci & Cavichioli) and Oncometopia facialis (Signoret) which are capable of acquiring X. fastidiosa from the xylem while feeding. In plants, endophytic bacteria, which inhabit the interior of aerial plant parts developing an asymptomatic infection and show potential benefits as biocontrol agents of pests and diseases, may colonize the same niche of pathogens, such as X. fastidiosa, what could allow endophytes to interact with the pathogen. Bacteria were isolated from head of insect vectors, collected on affected citrus plants. From 17230 bacteria isolated from the heads of three insect species (O. facialis, D. costalimai and A. citrina) in three different days (22/march, 05/may and 14/june of 2002), 120 bacteria were tested with ARDRA and classified into 16 different haplotypes. The most frequent strains had their 16S rDNA fragment sequenced and they were identified as Methylobacterium sp. and Curtobacterium sp., bacteria which have been described as citrus endophytes which interact with X. fastidiosa. Total DNA of insect heads was used in Nested PCRs for detection of these citrus endophytes in insects. The frequencies of detection ranged from 39,1% to 89,6%. The bacterial community associated to sharpshooters was also evaluated by DGGE and presented variations due to insect host and time of the evaluations. One M. mesophilicum isolate, expressing the GFP (Green Fluorescent Protein), was used to test the transmission of endophytes by B. xanthophis. Insects fed on membranes containing a bacterial solution and after were trapped on Catharanthus roseus. From the evaluated plants, 13% presented the fluorescent protein colonizing endophytically, indicating that the insect is able to transmit the endophytic bacteria. Biofilm and quorum sensing molecules (AHLs - Acyl Homocerine Lactones) production by Methylobacterium sp. were tested, and M. extorquens mutants for both features were produced.