Ao longo dos últimos anos observou-se um aumento no número de idosos no mundo, com isso faz-se necessário buscar terapias que amenizem os danos relacionados e também elucidar os mecanismos envolvidos neste processo. O exercício físico tem sido sugerido como uma ferramenta importante, não farmacológica, para atenuar os déficits relacionados à idade. Ainda, estudos recentes sugerem uma relação entre o processo de envelhecimento cerebral e o desequilíbrio de mecanismos epigenéticos, contudo, estes dados ainda não são conclusivos. Sabe-se que o grau de neuroplasticidade varia com a idade e que as estruturas encefálicas podem responder diferentemente à exposição ao exercício. Estudos demonstram que o córtex pré-frontal está envolvido em funções de alta ordem como atenção, tomada de decisão e memória de trabalho. Portanto, o objetivo deste trabalho foi avaliar os efeitos de diferentes protocolos de exercício físico (sessão única e exercício diário moderado) sobre a modulação de marcadores epigenéticos em córtex pré-frontal de ratos Wistar de 3 e 21 meses de idade. Os animais foram submetidos ao protocolo de sessão única (20 minutos) ou o exercício diário moderado (20 minutos durante 14 dias), 1 hora após a última sessão foram eutanasiados. O córtex pré-frontal foi dissecado e a acetilação da H4, o conteúdo da DNA metiltransferase (DNMT1 e DNMT3b), assim como a atividade da histona metiltransferase H3K27 foram analisadas. Os resultados serão apresentados na versão completa desta dissertação. / Over the past few years the number of elderly people has increased in the world, therefore it is necessary to search therapies that ameliorate age-related deficits as well as elucidate the mechanisms involved in this process. Physical exercise has been suggested as an important non-pharmacological approach to alleviate the age-related decline. Furthermore, recent studies have suggested a relationship between the process of brain aging and imbalance of epigenetic mechanisms, however, these data are not conclusive. It is well described that prefrontal cortex is involved in higher functions like attention, decision making and working memory. Then, the aim of this study was to investigate the effects of two exercise protocols (single session and daily moderate exercise) on the modulation of epigenetic markers in the prefrontal cortex from Wistar rats of 3- and 21- months-old. Animals were submitted to single session protocol (20 minutes) or the daily moderate exercise (20 minutes for 14 days), and 1hour after the last exercise session animals were euthanized. Prefrontal cortex was dissected out and acetylation of H4, the content of DNA methyl transferase (DNMT1 and DNMT3B), as well as histone methyltransferase H3K27 activity were analyzed. Results will be presented in the full version.

La traduction représente un processus central au sein de la cellule, elle assure le transfert de l’information génétique de l’ARNm vers les protéines. De nombreux acteurs y sont impliqués directement ou indirectement et parmi eux, chez les eucaryotes, la petite protéine Trm112. Celle-ci participe à la modification de plusieurs acteurs directs en interagissant et en activant quatre MTases. Le facteur de terminaison eRF1 est méthylé par le complexe Mtq2-Trm112, l’ARNr 18S par Bud23-Trm112 et certains ARNt par les complexes Trm9-Trm112 et Trm11-Trm112. Au cours de ce travail, les structures cristallographiques de Trm9-Trm112 et de Bud23-Trm112 de levure ont été résolues. L’étude comparative structurale de ces complexes et de la structure connue de Mtq2-Trm112, a permis de mettre en évidence que dans un même organisme, les séquences des trois protéines ont évolué de manière à conserver l’interaction avec Trm112. Même si les quatre partenaires présentent moins de 20% d’identité de séquence, les résidus clés pour l’interaction avec la petite protéine activatrice sont conservés ou partagent des caractéristiques identiques. En plus de l’analyse structurale, le complexe Trm9-Trm112 a fait l’objet d’une étude fonctionnelle chez S. cerevisiae ce qui a permis de cartographier le site actif de l’enzyme et de proposer un modèle de mécanisme d’action. Enfin, les premières études in vivo réalisées chez Haloferax volcanii suggèrent que cette plateforme serait également présente chez certains organismes procaryotes. / Protein synthesis is a central process in the cell; it ensures the transfer of genetic information from mRNA in to protein. A lot of actors are involved directly or indirectly in translation. In Eukaryotes, Trm112, a small protein, interacts with and activates four methyltransferases modifying direct actors of translation. The termination factor eRF1 is methylated by the Mtq2-Trm112 complex, the 18S rRNA by Bud23-Trm112 and some tRNA by the Trm9-Trm112 and Trm11-Trm112 complexes. During this work, the crystal structures of Trm9-Trm112 and Bud23-Trm112 complexes from yeast were solved. The comparative analysis of these two new structures with Mtq2-Trm112 structure highlights the structural plasticity allowing Trm112 to interact through a very similar mode with its partners although those share less than 20% sequence identity. In the same organism, the key residues for the interaction with Trm112 are conserved or share similar characteristics. In addition to the structural analysis, the function of the Trm9-Trm112 complex was studied in S. cerevisiae. This analysis allowed to map the active site of the enzyme and to propose a model of its mechanism of action. Finally, the first data obtained in vivo, with the Archaea Haloferax volcanii suggest that the Trm112 platform might also be present in some prokaryotic organisms.

Les méthyltransférases de l'ADN (DNMT) catalysent la méthylation de l'ADN, l'une des marques épigénétiques les plus étudiées. Dans les cancers, on observe une hyperméthylation spécifique de promoteurs de gènes suppresseurs de tumeurs (GST) conduisant à leur extinction génique, ce qui participe au maintien et à la progression de tumeurs. A ce jour, les mécanismes responsables de cette hyperméthylation spécifique des promoteurs de GST dans les cancers sont indéterminés. Ces travaux de thèse sont consacrés à l'inhibition des DNMT dans les cancers afin de restaurer l'expression des GST mais également à l'utilisation d'une approche innovante de chemobiologie pour l'identification de partenaires des DNMT potentiellement responsables de leur adressage vers les régions promotrices des GST. Les partenaires ainsi identifiés peuvent constituer de nouvelles cibles épigénétiques pour le ciblage indirect de la méthylation de l'ADN dans les cancers. Deux séries d'inhibiteurs de DNMT ont été étudiées. La première est la famille des chloronitro-flavanones, précédemment identifiée par criblage, pour laquelle de nouveaux dérivés de type bromonitro-flavanones ont été synthétisés afin d'améliorer la stabilité en conditions physiologiques. J'ai réalisé l'étude des effets pharmacologiques de cette famille de molécules. J'ai également entrepris la synthèse et la caractérisation pharmacologique de nouveaux inhibiteurs de type bi-substrats, analogues de l'adénosine et de la désoxycytidine, conçus par une approche rationnelle. Ces deux études ont permis respectivement d'identifier un dérivé flavanone plus stable et plus actif que le composé de référence et deux dérivés quinazoline-quinoléine très prometteurs, actifs sur les DNMT et dans les lignées cellulaires, à la fois pour la réexpression d'un gène rapporteur mais surtout dans l'induction de la déméthylation du GST CDKN2A et de sa réexpression. Pour identifier les partenaires de DNMT, nous avons employé une approche de chemobiologie (" Activity-Based Protein Profiling - ABPP ") basée sur la conception de sondes chimiques comportant un inhibiteur de DNMT. Ces sondes, utilisées sur des cellules vivantes, permettent, grâce à une étape de fonctionnalisation par chimie bioorthogonale, de purifier les protéines partenaires des DNMT. Vingt sondes ont été synthétisées et leurs activités ont été évaluées sur des modèles enzymatiques et cellulaires. Les sondes sélectionnées ont été utilisées dans des lignées cellulaires cancéreuses pour purifier les protéines partenaires qui ont ensuite été identifiées par analyse protéomique. Suite à leur validation, ces protéines pourront constituer de nouvelles cibles de la méthylation aberrante de l'ADN dans les cancers. / DNA methyltransferases (DNMTs) catalyse DNA methylation, one of the most studied epigenetic marks. In cancers, a specific hypermethylation of the promoters of the tumour suppressor genes (TSGs) is observed, which leads to their silencing. This abnormal DNA methylation pattern participates to the maintenance and the progression of the tumour. Today, the mechanisms that direct this specific hypermethylation of TSG promoters and their transcriptional repression in cancers are still unknown. The aim of my PhD is to identify DNMT inhibitors that are able to reactivated TSGs in cancer cells but also to identify the DNMT partners that address specifically these enzymes to TSG promoter regions. Such partners can constitute new anticancer "epitargets" to indirectly target DNA methylation specifically in cancer cells. Two families of DNMT inhibitors were studied. The first one starts from the chloronitro-flavanones previously identified by screening. New derivatives including bromonitro-flavanones were synthesised aiming at improving compound stability. I pharmacologically characterised these compounds and show for one of them an increased stability and activities compared to reference compound. In parallel, I synthesised and pharmacologically characterised new bi-substrate analogue inhibitors, mimicking the adenosine and the deoxycytidine. Two very promising quinazoline-quinoline derivatives were identified. They are active against DNMT and in cell lines, both for reexpression of a reporter gene but mostly in CDKN2A TSG demethylation inducing its reexpression. To identify DNMT partners we adopted a chemical biology approach (Activity-Based Protein Profiling (ABPP)) based on the use of chemical probes including in-house non- nucleoside DNMT inhibitors as bait to trap the DNMT partners. We designed and synthesised twenty chemical probes and evaluate them using enzymatic and cellular-based assays. Selected probes were used to carry out ABPP directly in living cells. After functionalization by bioorthogonal chemistry, DNMT protein partners were purified and identified by proteomic analysis. Target validation would enable to determine new targets for the aberran

The N-7 methylguanosine cap structure is conserved from yeast to man. It is essential for cell proliferation as it influences several steps in eukaryotic gene expression including transcription, pre-mRNA processing, RNA export and translation. The N-7 methylguanosine cap is added co-transcriptionally to RNA pol II transcripts. In mammals, two enzymes catalyse the synthesis of the N7-methylguanosince cap. RNGTT adds an inverted guanosine group to the first transcribed nucleotide and RNMT methylates the guanosine cap at the N7-position. RNMT consists of a catalytic domain and an N-terminal domain that is absent in lower eukaryotes. Experiments presented in this thesis revealed that the N-terminus mediates RNMT recruitment to transcription start sites. Furthermore, it was found that the RNMT N-terminal domain is phosphorylated at Threonine-77 (T77) by CDK1/Cyclin B in a cell cycle-dependent manner during G2/M-phase. RNMT T77 phosphorylation activates cap methyltransferase activity in vitro. Furthermore, it negatively regulates the interaction of RNMT with KPNA2 (Importin-a), which was found to inhibit RNMT activity in vitro. RNMT T77 phosphorylation is required for normal cell proliferation suggesting an important biological function. Initial experiments indicated that RNMT T77 phosphorylation functions to regulate gene expression in a gene-specific manner. Future work is focused on establishing an experimental system to perform a genome-wide study in order to elucidate which transcripts are affected by RNMT T77 phosphorylation. To summarise, this study for the first time revealed that the RNA cap methyltransferase activity is regulated in a cell-cycle dependent manner.

Chez les eucaryotes, le génome est organisé en chromatine, une structure nucléoprotéique essentielle pour la régulation de l’expression génique ainsi que pour le maintien de la stabilité du génome. Les ciliés sont d’excellents organismes modèles pour étudier les mécanismes généraux qui maintiennent l’intégrité du génomes eucaryote. Chez Paramecium tetraurelia, la différentiation du génome somatique à partir du génome germinal est caractérisée par des événements massifs et reproductibles d’élimination d’ADN. D’une part, des éléments répétés (transposons,régions minisatellites), de plusieurs kilobases de long, sont imprécisément éliminés.D’autre part, 45000 séquences courtes et uniques, appelées IES, sont précisément éliminées au nucléotide près. Une classe de petits ARN, appelé scnRNAs, est impliquée dans la régulation epigénétique de l’élimination d’ADN, mais comment les scnRNA contrôlent l’élimination d’ADN reste mystérieux. Nous avons testé l’hypothèse selon laquelle une organisation particulière de la chromatine, en particulier des modifications post-traductionelles des histones associées à des formes répressives de la chromatine, est impliquée dans le processus d’élimination d’ADN. Nous avons montré que la triméthylation de l’histone H3 sur la lysine 9 et la lysine 27 (H3K9me3 et H3K27me3)apparaît transitoirement dans le noyau somatique en développement au moment où se produisent les événements d’élimination d’ADN. Nous avons identifié la protéine de type Polycomb, Ezl1, et montré qu’elle est une histone methyltransferase qui présente une dualité de substrat et catalyse à la fois la mise en place de K9me3 et K27me3 sur l’histone H3. Nous avons montré que la déposition de H3K9me3 et H3K27me3 dans le noyau en développement requiert les scnRNAs. Des analyses de séquençage haut débit ont montré que Ezl1 est requise pour l’élimination des longues séquences répétées germinales, suggérant que les scnRNA guident la déposition des marques d’histones au niveau de ces séquences. Au contraire des régions répétées du génome, les IES montrent une sensibilité différente aux scnRNAs et à Ezl1, suggérant que plusieurs voies partiellement chevauchantes sont impliquées dans leur élimination. Notre étude montre que des caractéristiques intrinsèques des séquences d’ADN, telles que leur taille, peut contribuer à la définition des séquences germinales à éliminer. De manière intéressante, nous avons aussi montré que Ezl1 est requise pour la répression transcriptionnelle des éléments transposables. Nous suggérons que les voies H3K9me3et H3K27me3 coopèrent et contribuent à préserver le génome somatique de Paramecium des parasites génomiques. / Eukaryotic genomes are organized into chromatin, a complex nucleoprotein structureessential for the regulation of gene expression and for maintaining genome stability.Ciliates provide excellent model organisms with which to gain better understandinginto the regulation of genome stability in eukaryotes. In the ciliate Parameciumtetraurelia, differentiation of the somatic genome from the germline genome ischaracterized by massive and reproducible programmed DNA elimination events. Longregions of several kilobases in length, containing repeated sequences and transposableelements are imprecisely eliminated, whereas 45,000 short, dispersed, single-copyInternal Eliminated Sequences (IESs) are precisely excised at the nucleotide level. Aspecific class of small RNAs, called scnRNAs, is involved in the epigenetic regulation ofDNA deletion. How scnRNAs may guide DNA elimination in Paramecium remains tobe discovered. Here, we investigated whether chromatin structure, in particular histonepost-translational modifications known to be associated with repressive chromatin,might control DNA elimination. We showed that trimethylated lysine 9 and 27 onhistone H3 (H3K9me3 and H3K27me3) appear in the developing somaticmacronucleus when DNA elimination occurs. We identified the Polycomb-groupprotein, Ezl1, and showed that it is a dual histone methyltransferase that catalyzes bothH3K9me3 and H3K27me3 in vitro and in vivo. Genome-wide analyses show thatscnRNA-mediated H3K9me3 and H3K27me3 deposition is necessary for theelimination of long, repeated germline DNA. Conversely, single copy IESs displaydifferential sensitivity to depletion of scnRNAs and Ezl1, unveiling the existence ofpartially overlapping pathways in programmed DNA elimination. Our study revealsthat cis-acting determinants, such as DNA length, also contribute to the definition ofgermline sequences to delete. We further showed that Ezl1 is required fortranscriptional repression of transposable elements. We suggest that H3K9me3 andH3K27me3 pathways cooperate and contribute to safeguard the Paramecium somaticgenome against intragenomic parasites.

Acute lymphoblastic leukemia, one of the most malignant cancer forms in children is commonly treated with the thiopurine 6-mercaptopurine (6-MP) in combination with a high dose of methotrexate (MTX). 6-Mercaptopurine is in the body metabolized by the enzyme thiopurine S-methyltransferase (TPMT). Polymorphic variants of TPMT express different catalytic activities, and for this reason the dosage of 6-MP needs to be individualized. In order to better optimize the treatment it is important to understand how mutations in TPMT affect its enzymatic activity. In this thesis we have investigated how the wild type and two variants of TPMT interact with different ligands using fluorescence and isothermal titration calorimetry. Experiments with MTX, ANS and furosemide resulted in a similar binding strength for the wild type and the variant TPMT*8, while the other variant TPMT*6 showed a slightly weaker binding. A binding affinity for polyglutamated MTX to TPMTwt was also determined which resulted in an almost twice as strong binding compared to MTX. Today’s methods to determine enzymatic activity are either based on radioactivity, time consuming or expensive. As an alternative the use of a spectrophotometric assay using 5-thio-2-nitrobenzoic acid (TNB) was investigated. The method showed positive results and could hopefully be adapted to plate readers in future experiments. Using 5.5’-dithiobis-(2-nitrobenzoic acid) (DTNB, also known as Ellman’s reagent) the amount of accessible thiol groups on the protein was estimated. This revealed a similar relationship between TPMTwt and TPMT*6, while the result for TPMT*8 was inconclusive.

Unsere Bemühungen die Natur individueller Unterschiede der Emotionsregulation zu verstehen, involviert das Verständnis der Gene. In dieser Arbeit werden Gene (Kandidatengene), die für Proteine als Rezeptoren, Transporter oder Enzyme im Neurotransmitterstoffwechsel Serotonin und Dopamin kodieren, untersucht. Serotonin und Dopamin sind mit Angststörungen in verschiedener Weise assoziiert. Sie sind wichtige Neurotransmitter in Teilen des Gehirns, die mit Angstkonditionierung im Zusammenhang stehen. Polymorphismen in diesen Genen verändern die Struktur und Funktion der Genprodukte und nehmen damit Einfluss auf die Funktion von Hirnstrukturen und -systemen. Phobien sind äußerst intensive und persistente Furchtreaktionen, welche durch spezifische Situationen oder Objekte ausgelöst werden und von dem zwingenden Wunsch begleitet sind, diese Situationen oder Objekte zu vermeiden. Die Intensität der Furchtreaktion erscheint einem Außenstehenden, entsprechend der realen Gefahr dieser Situation, unangemessen und eigentümlich. Zumeist hat der Phobiker selbst auch Einsicht in diese Irrationalität seiner Furchtreaktion, vermag sie aber nicht willentlich unter Kontrolle zu halten. In dieser Arbeit wurden als Beispiel einer assoziierten Angst die Zahnbehandlungsphobie und als Beispiel einer nicht-assoziierten Angst die Spinnenphobie untersucht. Es wurden 53 Zahnbehandlungsängstliche, 52 Spinnenphobiker und 37 Kontrollpersonen mittels Fragebogen (SPF,FAS,STAI trait, DCQ, DFS, ASI, PANAS, R-IDCI) getestet. Die Probanden wurden durch PCR-Analyse von Mundschleimhautabstriche je einem Polymorphismus der untersuchten Kandidatengene zugeordnet. Es handelte sich dabei um die Gene für den Serotonintransporter 5HTT, den Serotoninrezepor 5HT1A, den Dopaminrezeptor DRD4, den Dopamintransporter DAT, BDNF und das in den Katecholaminabbau involvierte COMT-Enzym. Die untersuchten Polymorphismen weisen in der Literatur einen Einfluss auf die Angstausprägungen auf. In der statistischen Auswertung wurde auf signifikante Zusammenhänge zwischen einem Polymorphismus und der Ausprägung einer Phobie geachtet. Desweiteren wurden die verschiedenen Polymorphismen mit den Ergebnissen der Fragebogentests in Zusammenschau gebracht. Ein direkter Einfluss eines der untersuchten Gene auf die Ausprägung einer Phobie konnte nicht nachgewiesen werden. In der Gruppe der Dentalphobiker zeigten sich Hinweise auf einen Einfluss des BDNF G-Allels und des COMT G-Allels auf erhöhte Ängstlichkeit. / Understanding of individual differences in emotions is related to the understanding of genes. This paper analyses genes (candidate genes) that code for proteins as receptors, transporters or enzymes in the metabolism of neurotransmitter serotonin and dopamine. Serotonin and dopamine are in different ways associated with anxiety disorders. They are important neurotransmitter in parts of the brain that are associated with anxiety conditioning. Polymorphisms in these genes change the structure and function of gene products and have effect on the function of brain structures. In literature the analysed polymorphisms show influence on characteristics of anxiety. Phobias are very intense and persistent fearreactions, which are triggered by specific situations or objects. They are accompanied by the desire to avoid these specific objects/situations. The intensity of this fearreactions seems inadequate according to real danger. The phobic person himself realises the irrationality of the reaction, but cannot control it. In this paper dental phobia, as an example for associated anxiety, and spider phobia, as an example for non-associated anxiety, are analysed. 53 dentalphobic, 52 spiderphobic and 37 control persons are tested by questionnaires (SPF,FAS,STAI trait, DCQ, DFS, ASI, PANAS, R-IDCI). The test persons were related to each one polymorphism of a candidate gene by PCR-analysing of mouth mucosa samples. Analysed candidate genes are serotonin-transporter 5HTT, serotonin-receptor 5HT1A, COMT, dopamine-receptor DRD4, dopamine-transporter and neutrophin BDNF. The relationship between a polymorphism and the characteristics of a phobia was examined statistically. Further the questionnaire results and polymorphisms were analysed for relations. No direct influence could be shown for candidate genes on phobia characteristics. In the group of dental phobia, hints for influence of the BFNF G-allele and COMT G-allele on anxiety could be made.

Myeloid Derived Suppressor Cells (MDSC) represent a significant hurdle to cancer immunotherapy because they dampen anti-tumor cytotoxic T cell responses. Previous studies have reported on the myelo-depletive effects of certain chemotherapies. Using guadecitabine, a next-generation DNA methyltransferase inhibitor (DNMTi), we observed significantly reduced tumor burden in the 4T1 murine mammary carcinoma model. Guadecitabine treatment prevents excessive tumor-induced myeloid proliferation and systemic accumulation, and skews remaining MDSCs toward a beneficial antigen-presenting phenotype. Together, this alters the splenic environment to improve T cell activation and interferon-gamma (IFNg) production. Additionally, guadecitabine enhances the therapeutic effect of adoptively transferred antigen-experienced lymphocytes to diminish tumor growth and improve overall survival. Based on these findings, the immune-modulatory effects of guadecitabine can help rescue the anti-tumor immune response and could contribute to the overall effectiveness of current cancer immunotherapies. Allergies and asthma are common ailments that are on the rise around the world. Mast cells play a direct role in the signs and symptoms characteristic in allergic patients. The family of A Disintegrin And Metalloproteinases (ADAMs) are involved in regulating many cellular processes by cleaving surface receptors, ligands, and signaling molecules. We sought to determine the role of ADAM17 in mast cell activity. In studies using ADAM17-deficient mast cells, percent degranulation and cytokines released by IgE-mediated activation were significantly reduced. Interestingly, ionomycin-activation was unchanged, suggesting ADAM17 may be involved in IgE-mediated mast cell activation upstream of calcium release. Additionally, ADAM17MC-/- mice showed protection from IgE-, but not histamine-, mediated passive systemic anaphylaxis (PSA). The underlying mechanism behind the reduced degranulation occurs through signaling deficiencies downstream of Lyn phosphorylation. Together, the data suggest that ADAM17 is required for proper mast cell signaling through its interaction with the Src family kinase, Lyn.

Der brustgewebsspezifische Metabolismus des weiblichen Sexualhormons 17β-Estradiol (E2) spielt eine wichtige Rolle bei der Brustkrebsentstehung. In der Brust wird E2 durch die humanen Cytochrom P450-abhängigen Monooxygenasen (CYP) Isoenzyme 1A1 (hCYP1A1) und 1B1 (hCYP1B1) zu 2-Hydroxy (2-OH) und 4-HO-E2 oxidiert und vorrangig durch die Catechol-O-Methyltransferase (COMT) entgiftet. Bei unzureichender O-Methylierung können diese Catecholestrogene zu elektrophilen Chinonen oxidiert werden, welche mit der DNA reagieren und somit Mutationen induzieren können. Eine niedrige COMT-Aktivität, durch Polymorphismen und/oder durch Nahrungsbestandteile, die mit dem Enzym selbst oder seiner Genexpression wechselwirken, könnte daher die Mutagenität von E2 und dessen Catecholestrogenen beeinflussen. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde der Einfluss der Hemmung der COMT-Aktivität auf die Mutagenität von E2 und dessen Catecholestrogenen untersucht. Zu diesem Zweck wurden der Hypoxanthin-Guanin-Phosphoribosyltransferase (HPRT)-Test und der Mikrokern-Test eingesetzt. Die Untersuchungen erfolgten in kultivierten Lungenfibroblasten des Chinesischen Hamsters (V79-Zellen) und in V79-Zellen, die mit hCYP1A1 transfiziert wurden. Begleitend zu den Mutagenitätsuntersuchungen wurde das Metabolitenprofil der Testsubstanzen anhand von Gaschromatographie gekoppelt mit Massenspektrometrie bestimmt. Nach Inkubation mit 0,08 µM 2 HO-E2 wurde dieses vollständig zu dessen Methylcatecholen umgesetzt, ab 2,5 µM hingegen war zusätzlich 2 HO-E2 im Medium nachweisbar. Demnach war die Hemmung der COMT-Aktivität bei der Inkubation mit 0,08 µM 2 HO-E2 vollständig und ab 2,5 µM partiell. Mit und ohne Hemmung der COMT-Aktivität war 2 Methoxyestradiol der Hauptmetabolit. 2-HO-E2 induzierte im Konzentrationsbereich 0,08 µM - 5 µM, mit und ohne Hemmung der COMT-Aktivität, keine Erhöhung der Mutantenfrequenz im hprt-Lokus von V79-Zellen. Im Gegensatz hierzu induzierte 2 HO-E2 ab 2,5 µM, mit und ohne Hemmung der COMT-Aktivität, mindestens eine Verdreifachung der Mikrokernrate im Vergleich zur Kontrollpopulation, wobei dieser Effekt ohne Inhibierung der COMT-Aktivität stärker ausgeprägt war. Über den gesamten getesteten Konzentrationsbereich (5 - 40 µM) wurde 4 HO-E2 zu dessen beiden Methylcatecholen umgesetzt, wobei 4-Methoxyestradiol den größten Anteil der detektierten Verbindungen (≥ 86%) ausmachte. Nach der Behandlung mit 3,5-Dinitrocatechol waren keine Methylierungsprodukte mehr nachweisbar, weswegen von einer vollständigen Hemmung der COMT-Aktivität im gesamten getesteten Konzentrationsbereich auszugehen war. 4-HO-E2 induzierte über den gesamten getesteten Konzentrationsbereich keine Genmutationen im hprt-Lokus. Erst nach Hemmung der COMT-Aktivität und Behandlung mit 20 µM 4 HO-E2 wurde eine Verdreifachung der Mutantenfrequenz im Vergleich zur Kontrollpopulation beobachtet. Mit und ohne Hemmung der COMT-Aktivität induzierte 4 HO E2 ab 20 µM eine Verdopplung der Mikrokernrate im Vergleich zur Kontrollpopulation. Im Kulturmedium der V79 hCYP1A1-Zellen, die mit 0,1 und 1 µM E2 für bis zu drei Wochen behandelt wurden, machten über die gesamte Versuchsdauer E2 (> 86%) und Estron (> 10%, bezogen auf die Summe aller Peakflächen) den größten Anteil der detektierten Verbindungen aus. Wie erwartet, waren nach Hemmung der COMT-Aktivität keine Methylierungsprodukte mehr nachweisbar. Die durchgehende, zwei- und dreiwöchige Behandlung mit jeweils 0,1 und 1 µM E2 bewirkte keine Induktion von Genmutationen im hprt-Lokus. Demgegenüber erhöhte sich die Mutantenfrequenz nach Hemmung der COMT-Aktivität und dreiwöchiger Behandlung mit 0,1 µM E2 um Faktor 4 im Vergleich zur Kontrollpopulation. Was die Mikrokerninduktion betrifft, so wurde nach 24-stündiger Inkubation mit 0,1 und 1 µM E2, mit und ohne Hemmung der COMT-Aktivität, keine Erhöhung der Mikrokernrate im Vergleich zur Kontrollpopulation beobachtet. Über die gesamte Dauer der Mutagenitätstests von E2 und dessen Catecholestrogenen unterschieden sich die Zellzyklusverteilung, die Wachstumskurven und die Koloniebildungsfähigkeit zum Zeitpunkt der Selektion, mit und ohne Hemmung der COMT-Aktivität, nicht statistisch signifikant von denjenigen der Kontrollpopulationen. Demnach war von einer sicheren Detektion von Mutationen im HPRT-Test und im Mikrokerntest auszugehen. Zusammenfassend bestätigen die durchgeführten Untersuchungen, dass die zelluläre COMT-Aktivität eine essentielle Rolle zur Entgiftung mutagener Catecholestrogene spielt. Eine hundertprozentige Inhibierung der Aktivität dieses Enzyms führt zur Induktion von Genmutationen durch 4 HO-E2 in V79-Zellen ohne CYP-Aktivität und durch E2 in V79-Zellen, die hCYP1A1 exprimieren. Demnach könnte eine Reduktion der COMT-Aktivität durch Polymorphismen und/oder durch Nahrungsbestandteile, die mit dem Enzym selbst oder seiner Genexpression wechselwirken, die Induktion von Genmutationen durch E2 und dessen Catecholestrogenen begünstigen. / Oxidative metabolism of the female sex hormone 17β-estradiol (E2) is considered to play a major role in the initiation of hormone-induced carcinogenesis. In extrahepatic tissues, E2 undergoes metabolic activation by human cytochrome P450-dependent monooxygenase (CYP) isozymes 1A1 (hCYP1A1) and 1B1 (hCYP1B1) to 2-hydroxy (HO)- and 4-HO-E2. If not conjugated these catecholestrogens can further oxidize to electrophilic quinones, which may react with DNA and induce thereby mutations. Conjugation of these catechols in extrahepatic tissues is mainly catalyzed by catechol-O-methyltransferase (COMT). A low COMT activity, caused for example by polymorphisms and certain food components, which influence the enzyme activity or its gene expression, may therefore enhance quinone formation and thereby the induction of mutations. The aim of the present work was to determine the effect of inhibition of COMT on the mutagenic potential of a) the catechols 2- and 4-HO-E2 in V79 wild type cells without CYP activity and b) E2 in V79 cells expressing hCYP1A1. 3,5-dinitrocatechol (20 μM) served as COMT inhibitor. Gene and chromosomal mutations were assessed using the hypoxanthine-guanine-phosphoribosyltransferase (HPRT) and the micronuclei assay. In addition, the metabolite profile of E2 and its catechols in the culture medium was analyzed via gas chromatography/mass spectrometry. After incubation of V79 cells with 2-HO-E2, 2-methoxyestradiol was the major metabolite, whereas in the presence of the COMT inhibitor, disappearance (0.08 μM) and a decreased amount (2.5 μM or more) of methylated inactivation products was observed. Treatment of V79 cells with 0.08 μM – 5 μM 2-HO-E2, neither with nor without inhibition of COMT activity induced a significant increase in mutant frequency at the hprt locus. In contrast, at concentrations above or equal to 2.5 μM 2-HO-E2, at least a 3-fold increase of the micronuclei rate compared to control cells was observed with and without inhibition of COMT activity. Over the entire concentration range (5-40 μM) 4-HO-E2 was mainly converted to its methylation products, 4-methoxyestradiol being the major metabolite (≥ 86%) of the detected compounds. After treatment with 3,5-dinitrocatechol no methylation products were detected, thus indicating a complete inhibition of COMT over the entire concentration range. 4-HO-E2 did not induce gene mutations at the hprt locus in V79 cells with active COMT. Yet, after inhibition of COMT and treatment with 20 μM 4-HO-E2, a 3-fold increase in the mutant frequency was observed in comparison to control cells. Like 2-HO-E2, induction of micronuclei by 20 µM 4-hydroxyestradiol and more, was not affected by inhibition of COMT. In the culture medium of V79 cells expressing hCYP1A1, which were incubated with 0.1 and 1 μM E2 for up to three weeks, over the entire assay duration, E2 and estrone (86% and 10% of the sum of all peak areas, respectively) were the major metabolites. As expected, no methylation products were detected after inhibition of COMT. Treatment of V79 cells expressing hCYP1A1, for two and three weeks with 0.1 and 1 μM E2 did not induce gene mutations at the hprt locus. In contrast, a 4-fold increase in mutant frequency was observed in comparison to control cells after inhibition of COMT and treatment with 0.1 μM E2 for three weeks. With and without inhibition of COMT, no increase in micronuclei rate compared to control cells was observed after incubation with 0.1 and 1 μM E2 for 24 hours. Over the entire duration of the mutagenicity assays of E2 and its catechols, cell cycle distribution, cell growth and plating efficiency at the time of mutant selection, with and without inhibition of COMT, did not differ statistically significant from control cells; therefore a reliable detection of mutations in the micronuclei and the HPRT assay can be assumed. The present work confirms that cellular COMT is essential for the inactivation of mutagenic catechols. Complete inhibition of its enzyme activity results in the induction of gene mutations by 4-HO-E2 in V79 wildtype cells without CYP activity and also by E2 in cells expressing hCYP1A1. Polymorphisms and food components lowering COMT activity could therefore mediate the potential of E2 and its metabolites to induce gene mutations.

Theories of attention deficit hyperactivity disorder (ADHD) aetiology have placed a focus on impaired behavioural inhibition presumably leading to executive function (EF) deficits. Neuroimaging studies report neurophysiological findings consistent with these hypothesised impairments, and investigations of functional brain activation from a network perspective report hypoactivation in the frontoparietal network as well as hyperactivation in the dorsal attention network. Studies investigating the acute effects of stimulant medication on EF show an improvement on behavioural EF measures including working memory. In addition, methylphenidate (MPH) was shown to up-regulate the task-positive/ frontoparietal network in children and adolescents with ADHD. So far, there are only few studies investigating the impact of ADHD on behavioural and neurophysiological EF measures as well as the effect of several weeks of stimulant medication in adult patients. The importance of the catechol-O-methyltransferase (COMT) enzyme for subcortical and cortical dopaminergic and noradrenergic functioning furthermore led to studies investigating a potential interactive impact of COMT genotype and ADHD on neuropsychological functioning, with a particular focus on working memory. The results of these studies were very heterogeneous. In addition, as none of the studies compared the results of ADHD patients to those of a healthy control group, possible differential effects of COMT in patients and healthy controls could not be examined. The aim of this dissertation was to investigate selective attention properties of the central executive component during a working memory task and to transfer this task to fMRI. A third study then aimed to investigate the effects of adult ADHD (aADHD), MPH, and COMT genotype on working memory with a particular focus on activation of the task-positive network during the analysis of the fMRI data. The first study (EEG) could replicate and extend the results from previous research. This study could furthermore connect the overall activation in frontal areas to suppression efficiency in posterior visual areas as well as establish the impact of hyperactive/ impulsive ADHD symptoms on task performance. The second study (fMRI) allowed the successful transfer of the paradigm to fMRI, and the further replication and extension of previous findings. In addition, this study showed the sensitivity of the task to the effects of the COMT genotype. The third study (fMRI) was one of the first studies that exploratorily investigated the effects COMT in a sample of aADHD patients and a comparable healthy control group. This study showed an interactive effect of these two factors on neuropsychological measures as well as on fMRI activation during a classic n-back working memory task. In addition, this task led to more activation in the task-positive network of the aADHD group compared to a healthy control group in the absence of performance differences, pointing towards compensatory activation in the aADHD group. Furthermore, activation in the frontal cortex was increased in patients taking MPH compared to a placebo. The fMRI data from the selective attention task moreover showed decreased activation in the right DLPFC of the patient group, which was associated with reduced suppression efficiency across all participants. The clinical effect of MPH in the third study was visible but did not reach significance, which is probably attributable to a lack of experimental power. The studies in this dissertation could successfully replicate and extend previous findings. A goal for future studies should be the further investigation of the interactive effects of COMT genotype and aADHD on neuropsychological test results and fMRI activation, but also on medication response and adverse effects. In this context, the adaptation of a network perspective during the analysis of fMRI data seems to be the best way to detect existing between-group differences. / Theorien zur Ätiologie der Aufmerksamkeitsdefizit-/ Hyperaktivitätsstö-rung (ADHS) konzentrieren sich oft auf defizitäre Prozesse der Verhaltensinhibition, die wiederum zu Defiziten der Exekutivfunktionen (EF) führen. Übereinstimmend mit diesen Beeinträchtigungen berichteten Neuroimaging-Studien von Hypoaktivierung im frontoparietalen Netzwerk sowie Hyperaktivierung im dorsalen Aufmerksamkeitsnetzwerk. Studien zur Wirkung von Stimulanzien zeigten eine Verbesserung von EF-Maßen einschließlich des Arbeitsgedächtnisses sowie eine Hochregulierung des aufgabenpositiven/ frontoparietalen Netzwerks durch Methylphenidat (MPH). Bis jetzt untersuchten nur wenige Studien die Auswirkungen von ADHS auf neurophysiologische und Verhaltensmaße der EF sowie den Effekt von länger andauernder Stimulanziengabe bei erwachsenen Patienten. Die Wichtigkeit des Enzyms Catechol-O-Methyltransferase (COMT) für subkortikale und kortikale dopaminerge und noradrenerge Funktionen führte darüber hinaus zu Studien, die eine potentielle Interaktion in der Wirkung des COMT Genotyps und ADHS auf neuropsychologische Funktionen und insbesondere auf das Arbeitsgedächtnis untersuchten. Die Ergebnisse dieser Studien waren recht heterogen. Da zudem keine der Studien die Ergebnisse der ADHS-Patienten mit denen einer gesunden Kontrollgruppe verglich, konnten möglicherweise vorhandene unterschiedliche Einflüsse von COMT bei Patienten und gesunden Kontrollprobanden nicht angemessen ermittelt werden. Das Ziel dieser Dissertation waren zunächst die Untersuchung von selektiven Aufmerksamkeitsprozessen, die durch die Zentrale Exekutive vermittelt werden, sowie die Übertragung der dazu verwendeten Arbeitsgedächtnisaufgabe ins fMRT. Eine dritte Studie strebte die Untersuchung der Auswirkungen von ADHS bei Erwachsenen (aADHS), MPH und COMT Genotyp auf das Arbeitsgedächtnis an. Ein besonderer Fokus bei der Analyse der fMRT-Daten lag hierbei auf der Aktivierung des aufgabenpositiven Netzwerks. Die erste Studie (EEG) konnte bisherige Forschungsergebnisse replizieren und erweitern. Zudem konnte diese Studie die Gesamtaktivierung in frontalen Bereichen mit der Unterdrückungseffizienz in posterioren visuellen Bereichen in Verbindung bringen sowie einen Einfluss von hyperaktiv/ impulsiver ADHS-Symptomatik auf die Verhaltensleistung feststellen. Die zweite Studie (fMRT) zeigte eine erfolgreiche Übertragung des Paradigmas auf das fMRT und eine weitergehende Replizierung und Erweiterung vorheriger Forschungsergebnisse. Es konnte außerdem die Sensitivität der Aufgabe für die Effekte des COMT Genotyps gezeigt werden. Die dritte Studie (fMRT) war eine der ersten Studien, die exploratorisch die Effekte von COMT in einer Stichprobe von aADHS-Patienten und einer vergleichbaren gesunden Kontrollgruppe untersuchte. Hier zeigte sich eine Interaktion von COMT Genotyp und aADHS auf die erhobenen neuropsychologischen Maße sowie auf die fMRT-Aktivierung während einer n-back Arbeitsgedächtnisaufgabe. Die Aufgabe führte zu mehr Aktivierung im aufgabenpositiven Netzwerk der aADHS-Gruppe im Vergleich zur Kontrollgruppe. Da keine Leistungsunterschiede zwischen den Gruppen zu erkennen waren, weist diese Hyperaktivierung auf eine kompensatorische Aktivierung in der aADHS-Gruppe hin. Zudem zeigte sich eine erhöhte Aktivierung im Frontalkortex bei Patienten, die MPH statt einem Placebo einnahmen. Die fMRT-Daten der Aufgabe zur selektiven Aufmerksamkeit zeigten außerdem eine reduzierte Aktivierung im rechten DLPFC der Patientengruppe, die über alle Probanden hinweg mit einer reduzierten Unterdrückungseffizienz assoziiert war. Der klinische Effekt von MPH in der Patientenstichprobe war sichtbar, erreichte aber keine Signifikanz, was vermutlich auf eine zu geringe experimentelle Power zurückzuführen ist. Die Studien in dieser Dissertation konnten vorherige Befunde erfolgreich replizieren und erweitern. Ein Ziel für zukünftige Studien sollte die weitergehende Untersuchung dieser Fragestellungen sein. Vor allem in Bezug auf eine Interaktion von COMT Genotyp und aADHS auf neuropsychologische Testergebnisse und fMRT-Aktivierung, aber auch auf Medikamenten-Response und Nebenwirkungen ist dies von großer Bedeutung. Die Übernahme einer Netzwerkperspektive bei der Analyse von fMRT-Daten scheint zudem der beste Weg, existierende Unterschiede zwischen den Gruppen zu finden.