Merkel cell carcinoma (MCC) is a rare but highly aggressive neuroendocrine cutaneous cancer whose molecular biology is poorly characterized. Our broad research objective is to identify microRNAs (miRNA) that are biologically and/or clinically important in MCC. While attempting to establish an MCC-specific miRNA signature, we observed that microRNA-375 was the most highly expressed miRNA in primary MCC tumours relative to normal skin – an observation that I propose reflects miR-375’s specific association with neuroendocrine (NE) and secretory subpopulations within normal tissues. Here, I report that miR-375 is strikingly elevated in a range of NE tumour types compared with tissue-matched cancers of non-neuroendocrine origin. Furthermore, I show that miR-375 is expressed abundantly in a subset of MCC cell lines that possess the biochemical and immunohistochemical characteristics of NE cells, but is silenced in cell lines that fail to retain these markers. I demonstrate that the enforced expression of miR-375 induces a NE gene expression signature – a phenomenon that is mechanistically driven by the post-transcriptional repression of multiple Notch pathway components by miR-375. This work identifies the Notch pathway as a novel mechanistic link between the association of miR-375 and a NE cell fate, provides new insights into the cellular ancestry of MCC, and suggests that miR-375 could facilitate clinicopathological diagnosis of MCC and other NE tumours as a novel biomarker. miR-375 is silenced in “variant” MCC cell lines, and inversely correlates with cell doubling time and overall aggressiveness. Therefore, despite its high expression in most MCC tumours, I propose that miR-375 is an endogenous tumour suppressor. I show that the enforced expression of miR-375 inhibits cell viability, impairs cell migration and invasion, can oppose survival under stress, and represses the AKT pro-survival signaling pathway. Only siRNA-mediated inhibition of Notch2 and Recombination signal binding protein for immunoglobulin kappa J region (RBPJ) phenocopied the effects of miR-375 overexpression. Because variant (miR-375low) cell lines originate from more aggressive tumours in both MCC and small cell lung carcinoma, I postulate that miR-375 silencing occurs in a subset of MCC patients and might predispose them to a highly virulent clinical course through the disinhibition of Notch signaling. / Thesis (Master, Pathology & Molecular Medicine) -- Queen's University, 2013-08-15 09:59:09.832

Les papillomavirus humains (HPV) sont des petits virus non enveloppés à ADN double brin, qui infectent les épithéliums cutanés et muqueux. Très largement répandus dans la population humaine, les infections sont la plupart du temps asymptomatiques, tandis qu'une minorité provoquent des verrues cutanées, des condylomes acuminés et des carcinomes. Les cancers induits par HPV représentent 640 000 cas en 2012 dans le monde et sont localisés au niveau anogénital et au niveau des voies aérodigestives supérieures.La transformation des cellules est induite en particulier par la surexpression de deux oncoprotéines virales : E6 et E7, qui sont nécessaires à l'initiation, la promotion et la progression du phénotype cancéreux. Leur extinction provoque d'ailleurs la mort des cellules cancéreuses. E6 et E7 favorisent par exemple la dégradation de p53 et pRb, induisant ainsi une prolifération non contrôlée et accrue des cellules infectées. Mais les deux oncoprotéines virales interagissent aussi avec plus de 150 partenaires protéiques et dérégulent l'homéostasie cellulaire. Fait intéressant, E6 et E7 modulent l'expression de nombreuses protéines impliquées dans l'établissement des marques épigénétiques, impliquées dans la régulation de l'expression des gènes. D'ailleurs, la surexpression des oncoprotéines virales peut être liée à la méthylation de l'ADN d'une partie du génome viral.Puisque E6 et E7 détournent la machinerie épigénétique de la cellule, l'objectif du travail de thèse a été d'étudier les mécanismes moléculaires régulant l'expression des oncoprotéines lors du traitement des cellules de cancers du col par un agent déméthylant de l'ADN, le 5-aza-2'-déoxycytidine (5azadC).Dans des cellules issues de cancers du col de l'utérus, nous avons observé qu'un traitement déméthylant induisait une répression de la protéine E6 et une déstabilisation de ses transcrits, suggérant l'implication d'un miARN. Parmi les miARN ciblant les transcrits viraux, le miR-375 était le plus susceptible d'être impliqué dans la déstabilisation des transcrits car (i) la méthylation de son promoteur augmente avec la gravité des lésions du col de l'utérus, (ii) il cible les transcrits viraux au niveau de cinq régions différentes, et (iii) son expression est augmentée lors du traitement de cellules dérivées du cancer du col de l'utérus avec le 5azadC. Il s'est avéré que le miR-375 était effectivement impliqué dans la répression partielle des transcrits viraux lors du traitement. Les résultats de cette étude suggèrent par ailleurs qu'un autre mécanisme moléculaire pourrait être impliqué dans cette répression. C'est pourquoi, dans un deuxième temps, nous avons étudié l'implication possible d'un facteur de transcription, TBX2, dans la répression des transcrits viraux. Bien que le taux transcriptionnel de TBX2 soit augmenté lors du traitement des cellules avec des fortes concentrations de 5azadC, nos résultats suggèrent que la protéine n'est pas exprimée dans les cellules, même après traitement, et que TBX2 ne régule pas l'activité du promoteur viral intégré au génome cellulaire.Le traitement des cellules par l'agent déméthylant entraîne aussi une perte de viabilité en particulier des cellules Ca Ski. En effet, le 5azadC induit un blocage du cycle en G2/M dans ces cellules, une augmentation du pourcentage de cellules en Sub-G1 et un clivage de la PARP. Si le 5azadC est déjà utilisé en clinique pour le traitement d'autres cancers, nos données apportent un éclairage nouveau sur les mécanismes moléculaires du 5azadC dans les cancers induits par HPV, qui pourraient ainsi être traités par cette molécule. / Human papillomaviruses (HPV) are small, non-enveloped double-stranded DNA viruses and infect cutaneous and mucosal epithelia. Highly widespread in the human population, infections are mostly asymptomatic, while a minority causes cutaneous and genital warts, and carcinomas. HPV-induced cancers represent 640 000 cases in 2012 worldwide and are localized at the anogenital and head and neck sites.Cell transformation is induced by the overexpression of two viral oncoproteins E6 and E7, which are necessary for the initiation, promotion and progression of the cancerous phenotype. Indeed, their extinction causes cancer cell death. E6 and E7, for example, promote the degradation of p53 and pRb, thus inducing uncontrolled and increased proliferation of infected cells. But the two viral oncoproteins also interact with more than 150 protein partners and deregulate cell homeostasis. Interestingly, E6 and E7 modulate the expression of many proteins involved in the establishment of epigenetic marks, regulating gene expression. Furthermore, the overexpression of viral oncoproteins may be related to viral genome DNA methylation.Since E6 and E7 hijack epigenetic mechanisms, the aim of the thesis was to study the molecular mechanisms regulating the oncoprotein expression during the treatment of cervical cancer cells by a DNA demethylating agent, the 5-aza-2'-deoxycytidine (5azadC).In cervical cancer cells, we observed that a demethylating treatment induced E6 protein repression and destabilization of its transcripts, suggesting the involvement of a miRNA. Among miRNAs targeting viral transcripts, miR-375 was most likely to be involved this destabilization because (i) its promoter methylation increases with the severity of cervical lesions, (ii) it targets viral transcripts at five different regions, and (iii) its expression is increased in cervical cancer cells treated with 5azadC. In our experiences, miR-375 was indeed involved in the partial repression of viral transcripts during treatment. The results of this study further suggest that another molecular mechanism might be implicated in this repression. This is why, in a second step, we studied the possible involvement of a transcription factor, TBX2, in the viral transcript repression. Although the transcriptional rate of TBX2 is increased in cells treated with high concentrations of 5azadC, our results suggest that the protein is not expressed in cells, even after treatment, and that TBX2 does not regulate the viral promoter activity integrated into the cellular genome.Cell treatment with demethylating agent also leads to loss of viability, in particular in Ca Ski cells. Indeed, 5azadC induces a G2/M cycle arrest in these cells, an increase of Sub-G1 cells percentage and a PARP cleavage. While 5azadC is already used in clinical practice for the treatment of other cancers, our data shed new light on the molecular mechanisms of 5azadC in cancers induced by HPV, which could be treated by this molecule or analogues.

Mehr als 300 Millionen Menschen sind weltweit von Diabetes betroffen, die Mehrheit davon leidet an Typ-2-Diabetes. Typ-2-Diabetes ist durch eine Insulinresistenz charakterisiert, welche meistens durch Übergewicht und Adipositas verursacht wird. Diese Insulinresistenz kann zunächst durch eine erhöhte pankreatische Insulinsekretion kompensiert werden, jedoch können langfristig die pankreatischen beta-Zellen den erhöhten Insulinbedarf nicht mehr decken. Dies verursacht einen starken Anstieg der Blutglucosespiegel und stellt den Beginn der Typ-2-Diabetes Erkrankung dar. Neben genetischen Veränderungen sind Umweltfaktoren, wie erhöhte Nahrungsaufnahme und reduzierte Bewegung, wichtige Faktoren in der Pathogenese des Typ-2-Diabetes. Frühere Forschungsergebnisse zeigten eine wichtige Rolle von microRNA 375 (miR-375) im Wachstum und in der Funktion der Insulin produzierenden beta-Zellen. Die Genexpression von miR-375 ist in diabetischen Nagetieren und Menschen verändert, was auf eine wichtige Rolle dieser microRNA in der Pathogenese des Typ-2-Diabetes hindeutet. Gene, die durch miR-375 reguliert werden, wurden in den pankreatischen beta-Zellen beschrieben, jedoch ist der Mechanismus wie miR-375 das Wachstum und die Funktion der pankreatischen beta-Zellen beeinflusst noch nicht im Detail verstanden. Das Cell Adhesion Molecule 1 (CADM1) ist ein bekanntes Zielgen der miR-375 und vor allem im Gehirn als Regulator von Anzahl und Funktion der Synapsen bekannt. Da es außerdem in den pankreatischen beta Zellen exprimiert ist, könnte es auch dort an der Regulation von beta-Zellwachstum und –funktion beteiligt sein und die Glucose- und Energiehomöostase verändern. Ziel dieser Arbeit war es, in vollständig oder konditionell Cadm1-defizienten Mäusen den Einfluss von CADM1 in pankreatischen beta-Zellen und neuronalem Gewebe an der Regulation von Glucose- und Energiehomöostase zu untersuchen. / More than 300 million people world-wide are affected by diabetes, the majority suffering from type 2 diabetes. Type 2 diabetes is characterized by insulin resistance, usually caused by obesity and overweight. Enhanced pancreatic insulin secretion largely compensates insulin resistance for years. A failure of pancreatic beta-cells to meet increased insulin demands drastically increases blood glucose levels and marks the onset of type 2 diabetes. Besides environmental influences, mainly elevated food intake and reduced physical activity, also genetic mutations are important factors in the pathophysiology of type 2 diabetes. Recent literature highlights the role of microRNA 375 (miR-375) in the growth and function of pancreatic insulin-producing beta-cells. MiR-375 gene expression is regulated in diabetic humans and rodents, suggesting that this microRNA is involved in the pathogenesis of type 2 diabetes. Genes regulated by miR-375 have been described in pancreatic beta-cells. Nevertheless, the exact mechanisms how miR-375 regulates beta-cell growth and insulin secretion have not been understood. Cell adhesion molecule 1 (CADM1) is a known target of miR-375 and has mainly been described as regulator of synapse number and synaptic function in the brain. CADM1 is also expressed in pancreatic beta-cells and might regulate beta-cell growth and function and might be involved in the control of glucose and energy homeostasis. The aim of this work was to investigate whether CADM1 in pancreatic beta-cells or neuronal tissue contributes to the regulation of energy and glucose homeostasis by using total and conditional Cadm1 deficient mice. Total Cadm1 deficient (Cadm1KO) mice showed increased sensitivity to glucose and insulin as well as enhanced glucose-stimulated insulin secretion compared to littermate control mice. Elevated glucose-stimulated insulin secretion after Cadm1 depletion could be confirmed in an in vitro beta-cell model.