Submitted by MARCOS LEANDRO TEIXEIRA DE OLIVEIRA (marcosteixeira@ufv.br) on 2018-09-18T13:33:07Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 2023955 bytes, checksum: c00bada9d7cdc721128642c40a1fc2a1 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-09-18T13:33:07Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 2023955 bytes, checksum: c00bada9d7cdc721128642c40a1fc2a1 (MD5) Previous issue date: 2017-03-31 / Na natureza, um fitopatógeno geralmente está sob influência de um complexo de microrganismos, que associados garantem o equilibrio ecológico estável. Com foco no fungo nematófago Pochonia chlamydosporia, começamos investigando sua compatibilidade com Bradyrhizobium japonicum em soja e a influência dessa interação sobre o controle do nematoide das galhas e sobre a absorção de nutrientes pela planta. Constatou-se que a aplicação conjunta desses dois organismos não prejudica a ação de controle de nematoides por P. chlamydosporia e nem a fixação de N 2 por B. japonicum. Adicionalmente, quando os dois agentes estavam juntos, ocorreu maior produção de nódulos da bactéria nas raízes e aumento do conteúdo de Fe na parte aérea das plantas de soja. No segundo capítulo, a compatibilidade dos agentes de controle biológico de nematoides, P. chlamydosporia e P. penetrans foi avaliada. A co-aplicação dos microrganismos possibilitou maior redução do número de ovos do nematoide do que a aplicação em separado e foi possível observar a associação do fungo nas raízes infectadas por nematoides colonizados por P. penetrans. Pesquisamos ainda, no terceiro capítulo, a presença de vírus em isolados de P. chlamydosporia. Dos dezoito isolados avaliados, apenas um (Pc-M4) estava infectado por dois virus, um com genoma de RNA fita dupla (dsRNA) e outro de RNA fita simples sentido negativo (-ssRNA). Os nomes propostos para os micovírus são Pochonia chlamydosporia chrysovirus 1 (PcCV1) e Pochonia chlamydosporia negative-stranded RNA virus 1 (PcNSRV1). Ensaios biológicos do isolado fúngico Pc-M4 revelaram que este foi capaz de parasitar ovos, produzir metabólitos e proteases letais aos juvenis e reduzir a reprodução do nematoide de galhas M. javanica. Os resultados apresentados indicam que o fungo P. chlamydosporia é capaz de interagir com diferentes organismos sem perder a capacidade de controlar o nematoide de galhas e de promover o crescimento vegetal, o que faz dele um excelente agente de biocontrole de nematoides. / In nature, a plant pathogen is usually under the influence of a complex of microorganisms, which guarantees stable ecological balance. Focusing on the nematophagous fungus Pochonia chlamydosporia, we started investigating its compatibility with Bradyrhizobium japonicum in soybean. We also looked at the influence of this interaction on the control of the root knot nematode and on the nutrient uptake by the plant. It was found that the joint application of these two organisms does not affect the action of control of nematodes by P. chlamydosporia nor the fixation of N 2 by B. japonicum. In addition, when the two agents were together, there was a higher production of nodules of the bacteria in the roots and an increase in the Fe content in the aerial part of the soybean plants. In the second chapter, the compatibility of biological control agents of nematodes, P. chlamydosporia and P. penetrans was evaluated. The co-application of the microorganisms allowed a greater reduction in the number of nematode eggs than the separate application. It was possible to observe the association of the fungus in the roots infected by nematodes colonized by P. penetrans. We also investigated the presence of viruses in isolates of P. chlamydosporia in the third chapter. Of the eighteen isolates evaluated, only one (Pc-M4) was infected by two viruses, one with double-stranded RNA genome (dsRNA) and the other with RNA single-stranded sense negative (-ssRNA). The proposed names for the mycoviruses are Pochonia chlamydosporia chrysovirus 1 (PcCV1) and Pochonia chlamydosporia negative-stranded RNA virus 1 (PcNSRV1). Biological assays of the fungal isolate Pc-M4 revealed that it was able to parasitize eggs, produce metabolites, lethal proteases to juveniles and reduce reproduction of M. javanica. The results indicated that the fungus P. chlamydosporia is capable of interacting with different organisms without losing the ability to control the root knot nematode and to promote plant growth. This makes it an excellent biocontrol agent for plant parasitic nematodes.

O Brasil é o país líder no uso do fungo entomopatogênico Metarhizium anisopliae para o controle pragas agrícolas. Pouco se conhece sobre a diversidade e o impacto dos micovírus em M. anisopliae sensu stricto. Este trabalho mostra a riqueza dos micovírus associados a isolados de M. anisopliae da coleção de entomopatógenos da Universidade de São Paulo, usinas sucroalcooleiras e produtos microbianos à base do entomopatógeno. RNAfd foram encontrados em 55% dos 36 isolados de Metarhizium e apresentaram 16 diferentes padrões eletroforéticos consistindo de 3 a 18 bandas de RNAfd em gel de poliacrilamida. RNAfd não foram detectados em nenhum dos produtos comerciais utilizados no presente estudo. Os diferentes padrões de vírus encontrados nos isolados aqui estudados, aparentemente, não têm relação com os locais onde foram coletados. O inibidor de síntese protéica ciclohexamida não foi eficiente na eliminação dos vírus de RNAfd em nenhum dos isolados de fungos testados. Colônias dos isolados de M. anisopliae ESALQ 866, M. anisopliae ESALQ 1256 e M. anisopliae CTC F8 foram curadas por meio do cultivo monoconidial ou isolamento de ponta de hifas. Alguns segmentos do isolado M. anisopliae PL26 foram perdidos após o subcultivo de ponta das hifas. Colônias de M. anisopliae ESALQ PL26 obtidas por meio do cultivo monoconidial ou subcultivo de ponta de hifas apresentaram grande variabilidade morfológica, no entanto, essa variação não foi correlacionada com a presença de micovírus. Colônias isogênicas de M. anisopliae ESALQ 1256 mostraram diferenças no crescimento, na produção de conídios e na virulência, no entanto, essas diferenças não foram associadas à presença de RNAfd. Não foram observadas diferenças na tolerância aos raios ultravioleta e ao calor entre as colônias de M. anisopliae ESALQ 1256, com e sem vírus de RNAfd. Colônias oriundas de setores formados no isolado M. anisopliae PL26 produziram menor quantidade de conídios e apresentaram menor quantidade de vírus RNAfd em comparação com as colônias oriundas de outras regiões da colônias originais com características normais. A repicagem sucessiva dos isolados de M. anisopliae ESALQ PL26, ESALQ 1256, CTC F8 e CTC F15, infectados por diferentes vírus de RNAfd, nos meios de cultura BDA, SDAY e meio de arroz, bem como a passagem dos fungos em larvas de Tenebrio molitor, em geral, não afetaram a replicação dos micovírus. / Brazil is the leading country in the use of the entomopathogenic fungus Metarhizium anisopliae against agricultural pests. Little is known about the diversity and the impact of mycovirus in M. anisopliae sensu stricto. This study shows the richness of mycovirus associated with M. anisopliae isolates from the collections of entomopathogens of the University of São Paulo, from sugar-alcohol factories and microbial based products. dsRNA were found in 55% of the 36 Metarhizium isolates and showed 16 different electrophoretic patterns consisting of 3 to 18 dsRNA bands in polyacrylamide gels. dsRNA was not detected in any of the commercial products used in this study. The different viral patterns found in the isolates studied here apparently have no relation to the locations where they were collected. The inhibitor of protein synthesis cycloheximide culture was efficient in eradicating dsRNA virus from fungi. Colonies of isolates of M. anisopliae ESALQ 866, M. anisopliae ESALQ 1256 and M. anisopliae F8 were cured by monoconidial or by hyphal tip isolation of. Some segments of the M. anisopliae PL26 isolate were lost following hyphal tip subculture. Colonies both from monoconidial culture and hyphal tip subculture of M. anisopliae ESALQ PL26 showed great morphological variability; however, this variation was not correlated with the presence of mycoviruses. Isogenic colonies of M. anisopliae ESALQ 1256 showed differences in growth, conidia production and virulence; however, these differences were not associated to the presence of the dsRNA. No difference was observed regarding tolerance to ultraviolet rays and heat among the colonies of M. anisopliae ESALQ 1256, with and without the dsRNA virus. Sectors formed in the isolate M. anisopliae PL26 produced a smaller number of conidia and fewer dsRNA virus in comparison to the original colonies with normal characteristics. The repeated subculture of isolates of M. anisopliae ESALQ PL26, ESALQ 1256, CTC F8 and CTC F15, infected by different virus of dsRNA, in the PDA, SDAY culture media and in rice, as well as the fungi passage in larvae of Tenebrio molitor, in general, did not affect the replication of the mycovirus.

Made available in DSpace on 2015-03-26T13:51:44Z (GMT). No. of bitstreams: 1 01 - capa_abstract.pdf: 74907 bytes, checksum: 25176f30d42e87ea51768c28726ca1bd (MD5) Previous issue date: 2008-07-29 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / The common bean Phaseolus vulgaris shows great importance under feeding and economical aspects for the Brazilian people. However, its productivity has been low due to the occurrence of diseases and other factors. The angular leaf spot is distinguished among those diseases. Its causal agent is the Pseudocercospora griseola (Sacc.) Crous & U. Braun. Some mycovirus or virus-like particles were already described in several phytopathogenic fungus. Those viruses are unable to penetrating and lysing the host cells, and the intracytoplasmic transmission is accomplished by anastomosis among hyphae and the sporogenesis. Most mycovirus are found as multiple dsRNA fragments. In general, the mycovirus are cryptic (latent) concerning to the effects caused into phenotype of the host fungus, but they can affect the biology of their host by provoking morphological changes, hyper or hypovirulence. Because they are associated to the hypovirulence phenomenon, the mycoviruses show a potential use in the biocontroll of the phytopathogenic fungus. The general objective of this work was to characterize the mycovirus in the isolates of P. griseola, since they were recently detected in this fungus species for the first time. To reach this objective, the following were performed: the characterization of the dsRNA in different isolates; the vertical transmission analysis; and the obtainment of isogenic lines by the virus cure. The dsRNAs were detected in 31 from those 49 isolates of P. griseola under analysis. In the present study, most isolates showed multiple dsRNA fragments varying from zero to 10, as being the sizes estimated between 0.8 and 4.8 kb. The dsRNA fragment of 4.8 kb from the isolate was efficiently transmitted to the asexual spores. However, not all dsRNA fragments (between 1 and 6) found in the isolate Ig848 were transmitted to monosporic colonies. The cycloheximide was used at concentration of 20 µg/mL in order to obtain the mycovirus cure. This treatment was ineffective for the isolate 29-3, since those three colonies transplanted to cyclohexymide during four generations showed the same profile as the total nucleic acids found in the wild isolate. In the case of the isolate Ig848, this same chemical treatment eliminated the fragments 2.2; 2.0; 1.8; 1.2 and 1.0 kb of the colonies Ch2 and Ch4 after seven successive transplantings in medium containing cycloheximide. Several phytopathogenic fungus are attacked by viral infections, and this variation in the profile of the nucleic acid found in the P. griseola isolates is also observed in other plant pathogens. The presence of multiple fragments in only one isolate may be due to the infection by virus with segmented genome, RNA satellite, defective RNA or mixed infections. The efficiency of the transmission by conidia is variable, as depending on the fungus species under consideration, but it is usually near 100% as occurred for the isolate 29-3 of P. griseola. Either cure of some dsRNA fragments and the spontaneous loss during conidiogenesis observed for the isolate Ig848 rather indicate the infection by independent replicons. In those isogenic lines with and without some dsRNA fragments, the effect of the viral infection will be evaluated under some aspects such as the sporulation rate, growth and pathogenicity. The characterization of those viruses found in P. griseola will allow for further studies concerning to their use in the biological control of the angular leaf spot, which will turn possible to reduce the economical losses caused by this disease in agriculture. / O feijoeiro comum Phaseolus vulgaris apresenta grande importância alimentar e econômica para o brasileiro. No entanto, sua produtividade é baixa devido, em parte, à ocorrência de doenças. Entre essas doenças, destaca-se a mancha-angular, cujo agente causal é o fungo Pseudocercospora griseola (Sacc.) Crous & U. Braun. Micovírus ou partículas semelhantes a vírus já foram descritas em diversos fungos fitopatogênicos. Esses vírus são incapazes de penetrar e lisar as células hospedeiras, sendo a transmissão intracitoplasmática por meio da anastomose entre hifas e da esporogênese. A maior parte dos micovírus é encontrada como múltiplos fragmentos de dsRNA. Em geral, os micovírus são crípticos (latentes) em relação aos efeitos provocados no fenótipo do fungo hospedeiro, mas podem influenciar a biologia de seu hospedeiro, provocando alterações morfológicas, hiper ou hipovirulência. Por estarem associados ao fenômeno de hipovirulência, os micovírus apresentam uso potencial no biocontrole de fungos fitopatogênicos. O objetivo geral deste trabalho foi caracterizar micovírus presentes em isolados de P. griseola, uma vez que recentemente estes foram detectados, pela primeira vez, nesta espécie de fungo. Para atingir este objetivo, foi realizada a caracterização de dsRNAs presentes em diferentes isolados, a análise da transmissão vertical e a obtenção de linhagens isogênicas por meio da cura de vírus. dsRNAs foram detectados em 31 dos 49 isolados de P. griseola analisados. Neste trabalho, a maioria dos isolados apresentou múltiplos fragmentos de dsRNA, que variaram de zero a 10, com tamanhos estimados entre 0,8 e 4,8 kb. O fragmento de dsRNA de 4,8 kb do isolado 29-3 foi eficientemente transmitido para os esporos assexuais. Entretanto, nem todos os fragmentos de dsRNA, entre um e seis, presentes no isolado Ig848 foram transmitidos para colônias monospóricas. Cicloheximida foi utilizada em concentração de 20 μg/mL a fim de obter a cura de micovírus. Para o isolado 29-3, este tratamento foi ineficaz, pois as três colônias repicadas em cicloheximida durante quatro gerações apresentaram o mesmo perfil de ácidos nucléicos totais presente no isolado selvagem. No caso do isolado Ig848, este mesmo tratamento eliminou os fragmentos de 2,2; 2,0; 1,8; 1,2 e 1,0 kb das colônias Ch2 e Ch4, após sete repicagens sucessivas em meio contendo cicloheximida. Diversos fungos fitopatogênicos são acometidos por infecções virais, sendo que essa variação no perfil de ácidos nucléicos presente nos isolados de P. griseola também é observada em outros patógenos de plantas. A presença de múltiplos fragmentos, em um único isolado, pode ser devido à infecção por vírus com genoma segmentado, RNA satélite, RNA defectivo ou infecções mistas. A eficiência de transmissão por meio dos conídios é variável, dependendo da espécie de fungo considerada, mas geralmente é próxima a 100%, conforme ocorreu para o isolado 29-3 de P. griseola. Tanto a cura de alguns fragmentos de dsRNA quanto a perda espontânea durante a conidiogênese, observada para o isolado Ig848, indicam a infecção por replicons independentes. Estas linhagens isogênicas, com e sem alguns fragmentos de dsRNA, terão o efeito da infecção viral avaliados em aspectos como a taxa de esporulação, o crescimento e a patogenicidade. A caracterização destes vírus, presentes em P. griseola, permitirá estudos posteriores sobre o uso destes no controle biológico da mancha-angular, o que poderá reduzir as perdas econômicas causadas por essa doença na lavoura.

O Brasil é o país líder no uso do fungo entomopatogênico Metarhizium anisopliae para o controle pragas agrícolas. Pouco se conhece sobre a diversidade e o impacto dos micovírus em M. anisopliae sensu stricto. Este trabalho mostra a riqueza dos micovírus associados a isolados de M. anisopliae da coleção de entomopatógenos da Universidade de São Paulo, usinas sucroalcooleiras e produtos microbianos à base do entomopatógeno. RNAfd foram encontrados em 55% dos 36 isolados de Metarhizium e apresentaram 16 diferentes padrões eletroforéticos consistindo de 3 a 18 bandas de RNAfd em gel de poliacrilamida. RNAfd não foram detectados em nenhum dos produtos comerciais utilizados no presente estudo. Os diferentes padrões de vírus encontrados nos isolados aqui estudados, aparentemente, não têm relação com os locais onde foram coletados. O inibidor de síntese protéica ciclohexamida não foi eficiente na eliminação dos vírus de RNAfd em nenhum dos isolados de fungos testados. Colônias dos isolados de M. anisopliae ESALQ 866, M. anisopliae ESALQ 1256 e M. anisopliae CTC F8 foram curadas por meio do cultivo monoconidial ou isolamento de ponta de hifas. Alguns segmentos do isolado M. anisopliae PL26 foram perdidos após o subcultivo de ponta das hifas. Colônias de M. anisopliae ESALQ PL26 obtidas por meio do cultivo monoconidial ou subcultivo de ponta de hifas apresentaram grande variabilidade morfológica, no entanto, essa variação não foi correlacionada com a presença de micovírus. Colônias isogênicas de M. anisopliae ESALQ 1256 mostraram diferenças no crescimento, na produção de conídios e na virulência, no entanto, essas diferenças não foram associadas à presença de RNAfd. Não foram observadas diferenças na tolerância aos raios ultravioleta e ao calor entre as colônias de M. anisopliae ESALQ 1256, com e sem vírus de RNAfd. Colônias oriundas de setores formados no isolado M. anisopliae PL26 produziram menor quantidade de conídios e apresentaram menor quantidade de vírus RNAfd em comparação com as colônias oriundas de outras regiões da colônias originais com características normais. A repicagem sucessiva dos isolados de M. anisopliae ESALQ PL26, ESALQ 1256, CTC F8 e CTC F15, infectados por diferentes vírus de RNAfd, nos meios de cultura BDA, SDAY e meio de arroz, bem como a passagem dos fungos em larvas de Tenebrio molitor, em geral, não afetaram a replicação dos micovírus. / Brazil is the leading country in the use of the entomopathogenic fungus Metarhizium anisopliae against agricultural pests. Little is known about the diversity and the impact of mycovirus in M. anisopliae sensu stricto. This study shows the richness of mycovirus associated with M. anisopliae isolates from the collections of entomopathogens of the University of São Paulo, from sugar-alcohol factories and microbial based products. dsRNA were found in 55% of the 36 Metarhizium isolates and showed 16 different electrophoretic patterns consisting of 3 to 18 dsRNA bands in polyacrylamide gels. dsRNA was not detected in any of the commercial products used in this study. The different viral patterns found in the isolates studied here apparently have no relation to the locations where they were collected. The inhibitor of protein synthesis cycloheximide culture was efficient in eradicating dsRNA virus from fungi. Colonies of isolates of M. anisopliae ESALQ 866, M. anisopliae ESALQ 1256 and M. anisopliae F8 were cured by monoconidial or by hyphal tip isolation of. Some segments of the M. anisopliae PL26 isolate were lost following hyphal tip subculture. Colonies both from monoconidial culture and hyphal tip subculture of M. anisopliae ESALQ PL26 showed great morphological variability; however, this variation was not correlated with the presence of mycoviruses. Isogenic colonies of M. anisopliae ESALQ 1256 showed differences in growth, conidia production and virulence; however, these differences were not associated to the presence of the dsRNA. No difference was observed regarding tolerance to ultraviolet rays and heat among the colonies of M. anisopliae ESALQ 1256, with and without the dsRNA virus. Sectors formed in the isolate M. anisopliae PL26 produced a smaller number of conidia and fewer dsRNA virus in comparison to the original colonies with normal characteristics. The repeated subculture of isolates of M. anisopliae ESALQ PL26, ESALQ 1256, CTC F8 and CTC F15, infected by different virus of dsRNA, in the PDA, SDAY culture media and in rice, as well as the fungi passage in larvae of Tenebrio molitor, in general, did not affect the replication of the mycovirus.