Made available in DSpace on 2017-07-10T17:37:25Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Clair Aparecida Viecelli.pdf: 557659 bytes, checksum: 04dd69a9f737d5b596647fd8663a566f (MD5) Previous issue date: 2008-01-31 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / The alternative control of plants disease aims to minimize ambient impacts by the use of natural products. With the possibility of using Pycnoporus sanguineus extracts for the control of pathogenic fungus, this work was conduced to verify the antimicrobial activity in vitro against Pseudocercospora griseola and the induction of enzyme defense in bean plant as peroxidase, polyphenol oxidase and β-1,3-glucanase and activation of physiological mechanisms related to the energy supply, as proteins and chlorophyll. The experiments in vitro and in greenhouse had been constituted by extracts from basidiocarps, mycelium and liquid medium culture filtrate of P. sanguineus. Water, acibenzolar-S-methyl (ASM: 75 mg i.a. L-1) and fungicide (azoxystrobin: 40 mg i.a. L-1) were the control treatments. In vitro, the extract of mycelium at 5%, sterilized by filtration, significantly inhibited the mycelial growth, sporulation and conidia germination of P. griseola, what did not occur in the extract sterilized in autoclave, indicating the presence of thermo-sensible compounds. In greenhouse, bean plants had been treated three days before the inoculation with the pathogen and were evaluated the severity and the activity of plant defense enzymes peroxidase, β-1,3-glucanase and polyphenol oxidase in 3rd leaves treated as well as in 4th leaves not treated, to verify the occurrence of local or systemic resistance induction, respectively. Severity was reduced in 82.4% and 77% in 3rd leaves and in 71.6% and 69.4% in 4th leaves to P. sanguineus extracts at concentrations of 10% and 20%, respectively. In the field, severity was reduced in 19.2% and 63.8% in 1st and 2nd application, respectively, in relation to the control water. The activities of peroxidase, polyphenol oxidase, proteins and chlorophylls had an increment in plants treated with extracts. These results indicate the potential of P. sanguineus for alternative control of the angular leaf spot in bean plants / O controle alternativo de doenças de plantas visa minimizar impactos ambientais por meio da utilização de produtos naturais. Com a possibilidade de utilizar extratos de Pycnoporus sanguineus no controle de fitopatógenos, realizou-se esse trabalho com o objetivo de verificar a atividade antimicrobiana in vitro contra Pseudocercospora griseola e a indução de enzimas de defesa em feijoeiro como peroxidase, polifenoloxidase e β-1,3-glucanase e ativação de mecanismos fisiológicos relacionados ao fornecimento de energia, como proteínas e clorofilas. Os experimentos in vitro e em casa de vegetação foram constituídos pelos extratos do basidiocarpo, micélio e filtrado de cultura de P. sanguineus, além dos controles água, acibenzolar-S-metil (ASM: 75 mg i.a. L-1) e fungicida (azoxystrobin: 40 mg i.a. L-1). In vitro o extrato de micélio esterilizado por filtração inibiu significativamente o crescimento micelial, a esporulação e a germinação de esporos de P. griseola a partir da concentração 5%, o que não ocorreu no extrato esterilizado em autoclave, indicando a presença de compostos termolabeis. Em casa de vegetação, plantas de feijão foram tratadas três dias antes da inoculação do patógeno, avaliando-se a severidade e a atividade de enzimas envolvidas no processo de defesa, na 3º folha tratada bem como na 4º folha não tratada, para verificar a ocorrência da resistência local e/ou sistêmica respectivamente. A severidade em casa de vegetação foi reduzida na 3ª folha em 82,4 e 77% e na 4ª folha em 71,6 e 69,4% com os extratos de P. sanguineus em concentrações de 10% e 20%, respectivamente. A campo, reduções de até 19,2% e 63,8% na 1ª e 2ª aplicação, respectivamente, foram observadas, em relação ao controle água. A atividade das enzimas peroxidase e polifenoloxidase, o teor de proteínas e clorofilas foram maiores nas plantas tratadas com os extratos de P. sanguineus. Estes resultados indicam a eficiência de P. sanguineus para o controle alternativo da mancha angular do feijoeiro

Made available in DSpace on 2015-03-26T13:42:26Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1757825 bytes, checksum: 4e0395e0f72e73520cb71461e4c59bbe (MD5) Previous issue date: 2012-07-24 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / The common bean (Phaseolus vulgaris L.) is a major component of the diet in Brazil and an important primary source of protein and iron. Brazil is the largest common bean producer and the yield of this crop in the country could be higher if it were not, among other reasons, for the numerous diseases affecting this crop. Among the fungal diseases affecting the aerial portion of the plant are the angular leaf spot, caused by Pseudocercospora griseola, and anthracnose, caused by Colletotrichum lindemuthianum. These diseases can cause losses of more than 70% depending on weather conditions, degree of resistance of the cultivar and pathogenicity of the fungal isolates. Understanding how plants respond to pathogen attack is of fundamental importance for the development of resistant cultivars that can ensure the sustainability of agricultural production. This work aimed to identify proteins differentially expressed by the common bean genotype AND 277 in response to P. griseola and C. lindemuthianum. Two independent experiments were conducted. In the first one, leaf samples were collected and evaluated 12, 24 and 48 hours after inoculation (h.a.i.) with P. griseola race 31.31. In the second one, leaf samples were collected and evaluated 12 and 48 h.a.i. of C. lindemuthianum race 73 of. Protein samples were extracted by the phenol-SDS method and separated by two-dimensional electrophoresis. Proteins differentially expressed between inoculated and non-inoculated plants were excised from the gels, cleaved with trypsin and analyzed by mass spectrometry. In the first experiment, 13 differentially expressed proteins were identified, five were detected only in inoculated plants, three showed increased expression and five had reduced expression upon inoculation. These proteins are associated with the defense process, hormone synthesis, photosynthesis, metabolism of reactive oxygen species, cellular respiration and porphyrin synthesis. In the second experiment, 35 differentially expressed proteins were identified, 13 of which were present only in inoculated plants and six only in non- inoculated plants, 10 had increased expression and six were reduced upon inoculation. These proteins participate in cellular detoxification processes, defense against pathogens, metabolism of reactive oxygen species, photosynthesis, cellular respiration, protein biosynthesis and signaling. These results contribute for a better understanding of the defense response of common bean to these pathogens. The identified proteins and their corresponding genes (candidate genes) can be used as tools breeding programs to develop resistant plants. / O feijoeiro comum (Phaseolus vulgaris L.) é um dos principais componentes da dieta do brasileiro além de ser uma importante fonte primária de proteína e ferro. O Brasil é o maior produtor dessa leguminosa. Um dos fatores que limitam a produtividade brasileira é o grande número de doenças. Dentre as doenças fúngicas da parte aérea destacam-se a mancha angular causada por Pseudocercospora griseola e a antracnose, causada por Colletotrichum lindemuthianum. Essas doenças podem causar perdas superiores a 70% dependendo das condições climáticas, suscetibilidade da cultivar e patogenicidade dos isolados. A compreensão de como as plantas respondem ao ataque de patógenos é de fundamental importância para o desenvolvimento de cultivares resistentes que possam garantir a sustentabilidade da produção agrícola. Com este trabalho objetivou-se identificar proteínas diferencialmente expressas pelo genótipo de feijoeiro comum AND 277 em resposta a P. griseola e C. lindemuthianum. Foram realizados dois experimentos independentes. No primeiro, foram avaliadas amostras de folhas coletadas 12, 24 e 48 horas após a inoculação (h.a.i.) da raça 31.31 de P. griseola. No segundo, foram avaliadas amostras de folhas coletadas 12 e 48 h.a.i. da raça 73 de C. lindemuthianum. Amostras de proteínas foram extraídas pelo método fenol-SDS e separadas por eletroforese bidimensional. Proteínas diferencialmente expressas entre plantas inoculadas e não inoculadas com o patógeno foram excisadas dos géis, clivadas com tripsina e analisadas por espectrometria de massa. No primeiro experimento, foram identificadas 13 proteínas diferencialmente expressas, sendo que cinco foram detectadas somente nas plantas inoculadas, três apresentaram aumento de expressão e cinco tiveram redução da expressão após inoculação. Essas proteínas estão associadas a processos de defesa, síntese de hormônios, fotossíntese, metabolismo de espécies reativas de oxigênio, respiração celular e síntese de porfirinas. No segundo experimento, foram identificadas 35 proteínas diferencialmente expressas, sendo que 13 estavam presentes somente nas plantas inoculadas e seis somente nas plantas não inoculadas, 10 proteínas tiveram aumento de expressão e seis tiveram redução após a inoculação. Essas proteínas participam de processos de detoxificação celular, defesa contra patógenos, metabolismo de espécies reativas de oxigênio, fotossíntese, respiração celular, biossíntese de proteínas e sinalização. Esses resultados contribuem para um melhor entendimento do mecanismo de resposta de defesa do feijoeiro comum a esses patógenos. As proteínas identificadas e os genes que as codificam (genes candidatos) poderão auxiliar como ferramentas em programas de melhoramento genético no desenvolvimento de plantas resistentes.

Made available in DSpace on 2015-03-26T13:51:44Z (GMT). No. of bitstreams: 1 01 - capa_abstract.pdf: 74907 bytes, checksum: 25176f30d42e87ea51768c28726ca1bd (MD5) Previous issue date: 2008-07-29 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / The common bean Phaseolus vulgaris shows great importance under feeding and economical aspects for the Brazilian people. However, its productivity has been low due to the occurrence of diseases and other factors. The angular leaf spot is distinguished among those diseases. Its causal agent is the Pseudocercospora griseola (Sacc.) Crous & U. Braun. Some mycovirus or virus-like particles were already described in several phytopathogenic fungus. Those viruses are unable to penetrating and lysing the host cells, and the intracytoplasmic transmission is accomplished by anastomosis among hyphae and the sporogenesis. Most mycovirus are found as multiple dsRNA fragments. In general, the mycovirus are cryptic (latent) concerning to the effects caused into phenotype of the host fungus, but they can affect the biology of their host by provoking morphological changes, hyper or hypovirulence. Because they are associated to the hypovirulence phenomenon, the mycoviruses show a potential use in the biocontroll of the phytopathogenic fungus. The general objective of this work was to characterize the mycovirus in the isolates of P. griseola, since they were recently detected in this fungus species for the first time. To reach this objective, the following were performed: the characterization of the dsRNA in different isolates; the vertical transmission analysis; and the obtainment of isogenic lines by the virus cure. The dsRNAs were detected in 31 from those 49 isolates of P. griseola under analysis. In the present study, most isolates showed multiple dsRNA fragments varying from zero to 10, as being the sizes estimated between 0.8 and 4.8 kb. The dsRNA fragment of 4.8 kb from the isolate was efficiently transmitted to the asexual spores. However, not all dsRNA fragments (between 1 and 6) found in the isolate Ig848 were transmitted to monosporic colonies. The cycloheximide was used at concentration of 20 µg/mL in order to obtain the mycovirus cure. This treatment was ineffective for the isolate 29-3, since those three colonies transplanted to cyclohexymide during four generations showed the same profile as the total nucleic acids found in the wild isolate. In the case of the isolate Ig848, this same chemical treatment eliminated the fragments 2.2; 2.0; 1.8; 1.2 and 1.0 kb of the colonies Ch2 and Ch4 after seven successive transplantings in medium containing cycloheximide. Several phytopathogenic fungus are attacked by viral infections, and this variation in the profile of the nucleic acid found in the P. griseola isolates is also observed in other plant pathogens. The presence of multiple fragments in only one isolate may be due to the infection by virus with segmented genome, RNA satellite, defective RNA or mixed infections. The efficiency of the transmission by conidia is variable, as depending on the fungus species under consideration, but it is usually near 100% as occurred for the isolate 29-3 of P. griseola. Either cure of some dsRNA fragments and the spontaneous loss during conidiogenesis observed for the isolate Ig848 rather indicate the infection by independent replicons. In those isogenic lines with and without some dsRNA fragments, the effect of the viral infection will be evaluated under some aspects such as the sporulation rate, growth and pathogenicity. The characterization of those viruses found in P. griseola will allow for further studies concerning to their use in the biological control of the angular leaf spot, which will turn possible to reduce the economical losses caused by this disease in agriculture. / O feijoeiro comum Phaseolus vulgaris apresenta grande importância alimentar e econômica para o brasileiro. No entanto, sua produtividade é baixa devido, em parte, à ocorrência de doenças. Entre essas doenças, destaca-se a mancha-angular, cujo agente causal é o fungo Pseudocercospora griseola (Sacc.) Crous & U. Braun. Micovírus ou partículas semelhantes a vírus já foram descritas em diversos fungos fitopatogênicos. Esses vírus são incapazes de penetrar e lisar as células hospedeiras, sendo a transmissão intracitoplasmática por meio da anastomose entre hifas e da esporogênese. A maior parte dos micovírus é encontrada como múltiplos fragmentos de dsRNA. Em geral, os micovírus são crípticos (latentes) em relação aos efeitos provocados no fenótipo do fungo hospedeiro, mas podem influenciar a biologia de seu hospedeiro, provocando alterações morfológicas, hiper ou hipovirulência. Por estarem associados ao fenômeno de hipovirulência, os micovírus apresentam uso potencial no biocontrole de fungos fitopatogênicos. O objetivo geral deste trabalho foi caracterizar micovírus presentes em isolados de P. griseola, uma vez que recentemente estes foram detectados, pela primeira vez, nesta espécie de fungo. Para atingir este objetivo, foi realizada a caracterização de dsRNAs presentes em diferentes isolados, a análise da transmissão vertical e a obtenção de linhagens isogênicas por meio da cura de vírus. dsRNAs foram detectados em 31 dos 49 isolados de P. griseola analisados. Neste trabalho, a maioria dos isolados apresentou múltiplos fragmentos de dsRNA, que variaram de zero a 10, com tamanhos estimados entre 0,8 e 4,8 kb. O fragmento de dsRNA de 4,8 kb do isolado 29-3 foi eficientemente transmitido para os esporos assexuais. Entretanto, nem todos os fragmentos de dsRNA, entre um e seis, presentes no isolado Ig848 foram transmitidos para colônias monospóricas. Cicloheximida foi utilizada em concentração de 20 μg/mL a fim de obter a cura de micovírus. Para o isolado 29-3, este tratamento foi ineficaz, pois as três colônias repicadas em cicloheximida durante quatro gerações apresentaram o mesmo perfil de ácidos nucléicos totais presente no isolado selvagem. No caso do isolado Ig848, este mesmo tratamento eliminou os fragmentos de 2,2; 2,0; 1,8; 1,2 e 1,0 kb das colônias Ch2 e Ch4, após sete repicagens sucessivas em meio contendo cicloheximida. Diversos fungos fitopatogênicos são acometidos por infecções virais, sendo que essa variação no perfil de ácidos nucléicos presente nos isolados de P. griseola também é observada em outros patógenos de plantas. A presença de múltiplos fragmentos, em um único isolado, pode ser devido à infecção por vírus com genoma segmentado, RNA satélite, RNA defectivo ou infecções mistas. A eficiência de transmissão por meio dos conídios é variável, dependendo da espécie de fungo considerada, mas geralmente é próxima a 100%, conforme ocorreu para o isolado 29-3 de P. griseola. Tanto a cura de alguns fragmentos de dsRNA quanto a perda espontânea durante a conidiogênese, observada para o isolado Ig848, indicam a infecção por replicons independentes. Estas linhagens isogênicas, com e sem alguns fragmentos de dsRNA, terão o efeito da infecção viral avaliados em aspectos como a taxa de esporulação, o crescimento e a patogenicidade. A caracterização destes vírus, presentes em P. griseola, permitirá estudos posteriores sobre o uso destes no controle biológico da mancha-angular, o que poderá reduzir as perdas econômicas causadas por essa doença na lavoura.

Made available in DSpace on 2015-03-26T13:52:03Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 868663 bytes, checksum: 23683551a9b1133991133585463f9959 (MD5) Previous issue date: 2007-08-15 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / The angular leaf spot, caused by Phaeoisariopsis griseola, also known as Pseudocercospora griseola (Sacc.) Crous & U. Braun, is one of the most important diseases in the bean plant, causing serious damages to the production. The most efficient cost strategy for the management of plant diseases is the use of resistant cultivars. However, studies related to the genetic diversity of P. griseola have been demonstrating great genetic variability in this fungus, what has been hardening the achievement of those cultivars. Therefore, the aim of this work was to verify if the techniques of ERIC-PCR, BOX-PCR, ISSR-PCR and PCR- RFLP of the rDNA ITS region are able to detect the genetic diversity of the P. griseola isolates from Goiás, Minas Gerais, Espírito Santo and Paraná states. The total DNA of the 29 P. griseola isolates were extracted and, later, amplified using specific primers for ERIC, BOX, ISRR and ITS sequences. The cleavages of the ITS region with the restriction enzymes AluI, HaeIII, HhaI, HpaII, MboI, MspI e RsaI produced identical restriction profiles for all the isolates, and, therefore, the ITS sequence under used conditions supply markers that could differ the isolates of P. griseola. Through the grouping analysis of the results obtained by the BOX-PCR, ERIC-PCR and ISSR-PCR techniques, 2, 5, and 28 genotypes were revealed, respectively, among the isolates studied. Those results showed that BOX-PCR and ERIC-PCR techniques were less efficient to detect the genetic variability of P. griseola isolates. The best results were obtained using the ISSR- PCR technique, revealing high capacity in the polymorphism detection among the isolates. The genetic diversity observed can help in the development of appropriate strategies to obtain resistant bean plant varieties to this fungus. / A mancha-angular, causada pelo fungo Phaeoisariopsis griseola, também conhecido como Pseudocercospora griseola (Sacc.) Crous & U. Braun, é uma das doenças mais importantes que ocorre no feijoeiro, causando sérios prejuízos na produção. A forma mais econômica de controle dessa doença é a utilização de cultivares resistentes. Entretanto, estudos relacionados à diversidade genética de P. griseola têm demonstrado grande variabilidade genética nesse fungo, o que tem dificultado a obtenção dessas cultivares. Diante disso, o objetivo desse trabalho foi verificar se as técnicas ERIC-PCR, BOX-PCR, ISSR-PCR e PCR-RFLP da região ITS do rDNA são apropriadas para a detecção de polimorfismos genéticos que permitam estimar a diversidade genética de isolados de P. griseola provenientes dos estados de Goiás, Minas Gerais, Espírito Santo e Paraná. O DNA total de 29 isolados de P. griseola foi extraído e, posteriormente, utilizado para amplificação de seqüências ERIC, BOX, ISSR e ITS utilizando oligonucleotídeos específicos. As clivagens da região ITS com as enzimas de restrição AluI, HaeIII, HhaI, HpaII, MboI, MspI e RsaI produziram perfis de restrição idênticos para todos os isolados, e, portanto, a sequência ITS nas condições empregadas não forneceu marcadores que pudessem diferenciar os isolados de P. griseola. Por meio da análise de agrupamento dos resultados obtidos pelas técnicas BOX-PCR, ERIC-PCR e ISSR-PCR, foram detectados 2, 5 e 28 genótipos, respectivamente, entre os isolados estudados. Os resultados obtidos mostraram que as técnicas BOX-PCR e ERIC-PCR foram menos eficientes na detecção de polimorfismo genético entre os isolados de P. griseola. Os melhores resultados foram obtidos com o emprego da técnica ISSR- PCR, que mostrou grande capacidade de detecção de marcadores polimórficos entre os isolados. A diversidade genética estimada poderá auxiliar no desenvolvimento de estratégias adequadas para a obtenção de variedades de feijoeiro resistentes a esse fungo.

Orientadores: Luciana Lasry Benchimol Reis, Luis Eduardo Aranha Camargo / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-23T04:26:18Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Oblessuc_PaulaRodrigues_D.pdf: 15432495 bytes, checksum: 30c1cd638125be03e494a50fae4fe12b (MD5) Previous issue date: 2013 / Resumo: O feijão comum (Phaseolus vulgaris L.) é uma importante fonte de proteínas na dieta humana. A mancha angular (ALS), causada pelo fungo Pseudocercospora griseola (Sacc.) Crous & Braun, acarreta grandes prejuízos na produção do feijão. O melhoramento do feijoeiro busca ferramentas que agilizem a transferência de genes de resistência às doenças para cultivares em desenvolvimento. Assim, foi objetivo deste trabalho estudar os mecanismos genéticos e moleculares envolvidos na resposta do feijão à ALS, e com isso contribuir para o melhoramento dessa cultura. Primeiramente, QTLs (Quantitative Trait Locus) de resistência à ALS foram identificados utilizando a população de mapeamento UC (IAC-UNA x CAL 143) a partir do mapa genético previamente desenvolvido com marcadores microssatélites. O estudo quantitativo da severidade da ALS revelou distribuição normal e transgressiva na população UC, com resistência quantitativa observada em CAL 143. Ao todo foram mapeados sete QTLs em cinco diferentes grupos de ligação de feijão. Dentre estes, o loco ALS10.1 mostrou maior efeito (16% - 22%) e estabilidade nos três ambientes analisados: (1) condições naturais de infecção em época chuvosa de plantio; (2) condições naturais de infecção em época seca de plantio; e (3) condições controladas de infecção raça-específica em casa de vegetação. A região do loco ALS10.1 foi saturada com marcadores microssatélites, SCARs e Sequence-Tagged Site-DArTs (STS-DArTs); este último através da técnica de bulk segregant analysis (BSA). O intervalo de confiança foi reduzido de 13.4 cM para 3.0 cM após a saturação do loco, que teve seu número de marcadores aumentado de quatro para 10. O estudo do contexto genômico do ALS10.1 através do alinhamento dos marcadores com o rascunho do genoma do feijão possibilitou definir uma região core para o QTL na extremidade do cromossomo Pv10, com aproximadamente 5,3 Mb. Análise de Gene Onthology (GO) dos 323 genes preditos nesta região do genoma demonstrou que 61,6% destes genes estão envolvidos na resposta a estresse. Cluster de genes TIR-NB-ARC (domínios altamente conservado em genes (R) de Resistência) foi identificado cobrindo aproximadamente 849 Kb na região core de ALS10.1; além de esta região conter outros genes sabidamente relacionados à imunidade de plantas. Sete genes presentes na região core de ALS10.1 foram selecionados com base na função na resistência à patógenos dos respectivos ortólogos em Arabidopsis thaliana, e tiveram sua expressão gênica avaliada na resposta à P. griseola. Gene R TIR-NB-ARC (Phvul.010G025700) foi induzido em resposta compatível no genótipo IAC-UNA, com isso deve permitir a proliferação do patógeno, possivelmente através do reconhecimento do Avr (avirulência) do fungo, bloqueando a resposta de defesa. Além disso, genes putativos de regulação negativa da resposta imune pela inativação da via do ácido salicílico (SA) foram reprimidos durante resposta incompatível no genótipo CAL 143. O AS é um hormônio chave para resposta de defesa induzida por patógenos em plantas. Com isso, o reconhecimento do patógeno pelo feijão deve ocorrer através de genes R para sinalização downstream da resposta de defesa mediada por AS. Os resultados deste trabalho permitirão que o melhorista manipule a diversidade genética do feijão, seja pela introgressão e piramidação dos genes de resistência através de seleção assistida por marcadores ou transgenia; seja pela identificação de cultivares geneticamente resistentes pela análise de expressão gênica / Resumo: O feijão comum (Phaseolus vulgaris L.) é uma importante fonte de proteínas na dieta humana. A mancha angular (ALS), causada pelo fungo Pseudocercospora griseola (Sacc.) Crous & Braun, acarreta grandes prejuízos na produção do feijão. O melhoramento do feijoeiro busca ferramentas que agilizem a transferência de genes de resistência às doenças para cultivares em desenvolvimento. Assim, foi objetivo deste trabalho estudar os mecanismos genéticos e moleculares envolvidos na resposta do feijão à ALS, e com isso contribuir para o melhoramento dessa cultura. Primeiramente, QTLs (Quantitative Trait Locus) de resistência à ALS foram identificados utilizando a população de mapeamento UC (IAC-UNA x CAL 143) a partir do mapa genético previamente desenvolvido com marcadores microssatélites. O estudo quantitativo da severidade da ALS revelou distribuição normal e transgressiva na população UC, com resistência quantitativa observada em CAL 143. Ao todo foram mapeados sete QTLs em cinco diferentes grupos de ligação de feijão. Dentre estes, o loco ALS10.1 mostrou maior efeito (16% - 22%) e estabilidade nos três ambientes analisados: (1) condições naturais de infecção em época chuvosa de plantio; (2) condições naturais de infecção em época seca de plantio; e (3) condições controladas de infecção raça-específica em casa de vegetação. A região do loco ALS10.1 foi saturada com marcadores microssatélites, SCARs e Sequence-Tagged Site-DArTs (STS-DArTs); este último através da técnica de bulk segregant analysis (BSA). O intervalo de confiança foi reduzido de 13.4 cM para 3.0 cM após a saturação do loco, que teve seu número de marcadores aumentado de quatro para 10. O estudo do contexto genômico do ALS10.1 através do alinhamento dos marcadores com o rascunho do genoma do feijão possibilitou definir uma região core para o QTL na extremidade do cromossomo Pv10, com aproximadamente 5,3 Mb. Análise de Gene Onthology (GO) dos 323 genes preditos nesta região do genoma demonstrou que 61,6% destes genes estão envolvidos na resposta a estresse. Cluster de genes TIR-NB-ARC (domínios altamente conservado em genes (R) de Resistência) foi identificado cobrindo aproximadamente 849 Kb na região core de ALS10.1; além de esta região conter outros genes sabidamente relacionados à imunidade de plantas. Sete genes presentes na região core de ALS10.1 foram selecionados com base na função na resistência à patógenos dos respectivos ortólogos em Arabidopsis thaliana, e tiveram sua expressão gênica avaliada na resposta à P. griseola. Gene R TIR-NB-ARC (Phvul.010G025700) foi induzido em resposta compatível no genótipo IAC-UNA, com isso deve permitir a proliferação do patógeno, possivelmente através do reconhecimento do Avr (avirulência) do fungo, bloqueando a resposta de defesa. Além disso, genes putativos de regulação negativa da resposta imune pela inativação da via do ácido salicílico (SA) foram reprimidos durante resposta incompatível no genótipo CAL 143. O AS é um hormônio chave para resposta de defesa induzida por patógenos em plantas. Com isso, o reconhecimento do patógeno pelo feijão deve ocorrer através de genes R para sinalização downstream da resposta de defesa mediada por AS. Os resultados deste trabalho permitirão que o melhorista manipule a diversidade genética do feijão, seja pela introgressão e piramidação dos genes de resistência através de seleção assistida por marcadores ou transgenia; seja pela identificação de cultivares geneticamente resistentes pela análise de expressão gênica / Abstract: The common bean (Phaseolus vulgaris L.) is an important protein source in human diet. The angular leaf spot (ALS), caused by the fungus Pseudocercospora griseola (Sacc.) Crous & Braun, leads to great common bean yield losses. The common bean breeding search for tools that improve the transferring of disease resistance genes to developing cultivars. Therefore, the objective of the present work was study the genetic and molecular mechanisms enrolled in the common bean responses to ALS, and with this contribute to this crop breeding. Initially, ALS resistance QTLs were identified using the UC (IAC-UNA x CAL 143) mapping population based on the genetic map previously developed with microsatellites markers. The quantitative study of the ALS disease severity reveals normal and transgressive distribution on the UC population, with quantitative resistance observed in CAL 143. Seven QTLs were mapped in five different common bean linkage groups. Of these, the ALS10.1 locus showed major effect (16% - 22%) and stability in all three environments analyzed: (1) natural infection conditions in the dry season; (2) natural infection conditions in wet season; and (3) race-specific controlled infection conditions in greenhouse. The ALS10.1 locos region was saturated with microsatellites, SCARs and Sequence-Tagged Site-DArTs (STS-DArTs) markers; the latter using the bulk segregant analysis (BSA). The confidence interval was reduced from 13.4 cM to 3.0 cM after the locus saturation, which had the markers number increased from four to 10. The study of the ALS10.1 genomic context through the alignment of the markers to the draft of the common bean genome enabled the identification of the QTL core at the end of the chromosome Pv10, with approximately 3.5 Mb. The Gene Ontology (GO) analyses of the 323 predicted genes for this genomic region demonstrated that 61.6% of the genes are involved in stress responses. A TIR-NB-ARC gene cluster (domains highly conserved in Resistance (R) genes), was observed covering approximately 849 Kb on the ALS10.1 core region; besides this region also presents other genes known to be related to plant immunity. Seven genes on ALS10.1 core region were selected based on the role in pathogen resistance of the respective Arabidopsis thaliana orthologs, and had their gene expression pattern evaluated in response to P. griseola. The R gene TIR-NB-ARC was induced during the compatible response of the genotype IAC-UNA; therewith it should enable the pathogen proliferation, probably through the fungus Avr recognition, blocking the defense response. In addition, putative negative regulator genes of immune response through the inactivation of salicylic acid (SA) via were repressed during the incompatible response of the CAL 143. The SA is a key hormone to pathogen induced plant defense response. Therefore, the common bean pathogen recognition should take place through the R genes to the downstream signaling of the SA-mediated defense response. The results of the present work will enable the manipulation of the bean genetic diversity by the breeder either by introgression and pyramiding of resistance genes through marker assisted selection or transgenesis; or by the identification of genetically resistant cultivars through gene expression analysis / Doutorado / Genetica Vegetal e Melhoramento / Doutora em Genética e Biologia Molecular

Made available in DSpace on 2015-03-26T13:42:23Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1356987 bytes, checksum: 030b61d243d62bcfe2b52e6110cb33b0 (MD5) Previous issue date: 2009-07-31 / The angular leaf spot, incited by the fungus Pseudocercospora griseola (Sacc.) Crous & U. Braun is one of the major diseases that affect the culture of the bean, can be found in all producing regions, especially when the culture is subjected to condition of mild temperatures in irrigated crops. This condition coupled with the use of susceptible cultivars favors the occurrence of the disease causes losses in production reaching 80%. An option to control the disease is the use of resistant cultivars. However, the efficiency in the use of resistance depends on knowledge of pathogenic variability and geographical distribution of the pathogen. Several studies have shown the extensive pathogenic variability of P. griseola and their co-evolution with the Andean and Mesoamerican gene pools of common bean. By the process of co-evolution, populations of P. griseola can also be divided into two gene pools: Andean (P. griseola formae griseola) that had parallel evolution with varieties of Andean origin beans, being able to bring the disease only in Andean beans; and Mesoamerican (P. griseola formae mesoamericana) that had parallel evolution with varieties of Mesoamerican origin beans, being able of inciting disease in Mesoamerican beans and also in some Andean beans. The main objectives of this study were characterized isolates of P. griseola, from nine cities in three regions of Minas Gerais State - Brazil, using the differential varieties; evaluate sources of resistance to the pathogen used by the Beans Improvement Program of BIOAGRO/UFV against these isolates; and, through the ITS region (ITS1-5,8S-ITS2) of the rDNA gene cluster, to characterize the genetic diversity of 48 isolates of P. griseola, using the universal primers ITS1 and ITS4. With the support of differential varieties were characterized 31 isolates monosporic of P. griseola, obtaining 15 distinct pathotypes, which demonstrates the highvariability of this pathogen. The pathotype 63-63 was the most frequent with 12 of the 31 isolates characterized and was detected in seven of the nine cities visited. The pathotype 63-23 occurred in three cities with the frequency of three isolates, the pathotypes 63-7, 15-7 and 47-39 occurred in two cities each with a frequency of two isolates and the other occurred in a single city with the frequency of one isolate. The fact that several isolates were characterized as pathotype 63-63, in other words, which present reaction of compatibility with all differential varieties, suggests that the differential series needs to be revised, possibly with the inclusion of new varieties and/or exclusion of certain vatieties, in order to better discrimination in pathotypes. All isolates showed reaction compatibility with the of Andean and Mesoamerican varieties, which classifies them as belonging to the Mesoamerican group. Varieties Mexico 54, BAT 332, Cornell 49-242, AND 277 and MAR-2, used by the Beans Improvement Program of BIOAGRO/UFV, were resistant, respectively, 11, 10, 11, 10 and 8 of the 15 pathotypes characterized. Nevertheless, none of the sources used was resistant to pathotype 63-63 characterized from isolates identified as A18, A212, AJ12, B146, B750, C11, SM17, SM20 and SM211 showing the need to seek new access that offer resistance to angular leaf spot. Another finding is that some isolates characterized as the same pathotype provided differing responses when inoculated into sources of resistance, showing that there are differences in relation to pathogenicity. The analysis of the inoculations in this differential series also showed that the varieties Don Timoteo, G11796 and Bolón Bayo are not relevant in discrimination of pathotypes. These two findings provide, once again, support for the proposed revision of the genotypes used in the differential series of angular leaf spot. The genetic variability of P. griseola is also examined through several other types of analysis involving morphological and molecular characters. In this work, through analysis of the ITS region (ITS1-5,8S-ITS2) of rDNA, using the universal primers ITS1 and ITS4, held a study on the genetic diversity of isolates of P. griseola, obtained in the State of Minas Gerais (Brazil) and elsewhere in the world, showing the efficiency of the ITS region for this purpose. It was found that there are five different haplotypes, grouped by the existence of five mutations among the sequences studied. These haplotypes formed two haplogroups: one consisting by all isolates ofMesoamerican origin (three haplotypes) and other consisting by isolates of Andean origin and isolates that do not have information about the gene pool (two haplotypes). This result indicates that the isolates that lack the gene pool defined, possibly belonging to the collection of Andean P. griseola. The finding that all isolates obtained in State of Minas Gerais belong to the Mesoamerican gene pool proves the existence of co-evolution between Phaseolus vulgaris and Pseudocercospora griseola, since in Brazil predominate the cultivation of beans Mesoamerican gene pool. / A mancha angular, incitada pelo fungo Pseudocercospora griseola (Sacc.) Crous & U. Braun é uma das principais doenças que acometem a cultura do feijoeiro, podendo ser encontrada em todas as regiões produtoras, principalmente quando a cultura é submetida à condição de temperaturas amenas em cultivos irrigados. Esta condição aliada ao uso de cultivares suscetíveis favorece a ocorrência da doença ocasionando perdas na produção que atingem 80%. Uma opção de controle da enfermidade é o uso de cultivares resistentes. No entanto, a eficiência no uso da resistência depende do conhecimento sobre a variabilidade patogênica e distribuição geográfica do patógeno. Diversos trabalhos têm mostrado a ampla variabilidade patogênica de P. griseola e a sua co-evolução com os pools gênicos Andino e Mesoamericano do feijoeiro. Pelo processo de co-evolução, populações de P. griseola também podem ser divididas em dois pools gênicos: Andino (P. griseola formae griseola) que tiveram evolução paralela com variedades de feijão de origem Andina, sendo capazes de incitar a doença apenas em feijões Andinos; e Mesoamericano (P. griseola formae mesoamericana) que tiveram evolução com variedades de feijão de origem Mesoamericana, sendo capazes de incitar a doença em feijões Mesoamericanos e também em alguns feijões Andinos. Os principais objetivos deste estudo foram: caracterizar isolados de P. griseola, provenientes de nove cidades de três regiões do Estado de Minas Gerais - Brasil, utilizando as variedades diferenciadoras da mancha angular; avaliar fontes de resistência ao patógeno utilizadas pelo Programa de Melhoramento do Feijoeiro do BIOAGRO/UFV frente a estes isolados; e através da região ITS (ITS1-5,8S-ITS2) do cluster gênico do rDNA caracterizar a diversidade genética de 48 isolados de P. griseola, utilizando os primers universais ITS1 e ITS4. Com o auxílio das variedades diferenciadoras, foramcaracterizados 31 isolados monospóricos de P. griseola, obtendo-se 15 patótipos distintos, o que demonstra a alta variabilidade deste patógeno. O patótipo 63-63 foi o mais frequente com 12 dos 31 isolados caracterizados e foi detectado em sete das nove cidades visitadas. O patótipo 63-23 ocorreu em três cidades com a frequência de três isolados; os patótipos 63-7, 47-39 e 15-7 ocorreram em duas cidades cada um, com a frequência de dois isolados e os demais patótipos ocorreram em uma única cidade com a frequência de um isolado. A constatação de que vários isolados foram caracterizados como patótipo 63-63, ou seja, apresentam reação de compatibilidade com todas as variedades diferenciadoras, sugere que a série diferenciadora necessita ser revista, possivelmente, com a inclusão de novas variedades e/ou exclusão de determinadas variedades, visando melhor discriminação em patótipos. Todos os isolados apresentaram reação de compatibilidade com as variedades Andinas e Mesoamericanas, o que os classifica como pertencentes ao grupo Mesoamericano. As variedades México 54, BAT 332, Cornell 49-242, AND 277 e MAR-2, utilizadas pelo Programa de Melhoramento do Feijoeiro do BIOAGRO/UFV, foram resistentes, respectivamente, a 11, 10, 11, 10 e 8 dos 15 patótipos caracterizados. Apesar disso, nenhuma das fontes utilizadas foi resistente ao patótipo 63-63 caracterizado a partir dos isolados identificados como A18, A212, AJ 12, B1 46, B7 50, C11, SM 17, SM 20 e SM211 evidenciando a necessidade de se buscar novos acessos que ofereçam resistência à mancha angular. Outra constatação é que alguns isolados caracterizados como um mesmo patótipo proporcionaram reações diferenciadas quando inoculados nas fontes de resistência, mostrando que existem diferenças em relação à patogenicidade. As análises das inoculações na série diferenciadora ainda evidenciaram que as variedades Don Timóteo, G11796 e Bolón Bayo não estão sendo relevantes na discriminação dos patótipos. Estas duas constatações oferecem, mais uma vez, suporte para a proposta de revisão dos genótipos utilizados na série diferenciadora da mancha angular. A variabilidade genética de P. griseola tem sido examinada também através de diversos outros tipos de análises envolvendo caracteres morfológicos e moleculares. Neste trabalho, através de análises da região ITS (ITS1-5,8S-ITS2) do rDNA, utilizando os primers universais ITS1 e ITS4, realizou-se um estudo acerca da diversidadegenética de isolados de P. griseola, obtidos no Estado de Minas Gerais (Brasil) e em outras localidades do mundo, evidenciando a eficiência da região ITS para este propósito. Verificou-se a existência de cinco haplótipos distintos, agrupados pela existência de cinco mutações entre as sequências estudadas. Estes haplótipos formaram dois haplogrupos: um constituído por todos os isolados de origem Mesoamericana (três haplótipos) e outro constituído por isolados de origem Andina e por isolados que não possuem informações acerca do pool gênico (dois haplótipos). Este resultado indica que os isolados que não possuem o pool gênico definido, possivelmente, pertencem ao acervo Andino de P. griseola. A constatação de que todos os isolados obtidos no Estado de Minas Gerais pertencem ao pool gênico Mesoamericano comprova a existência de co-evolução entre Phaseolus vulgaris e Pseudocercospora griseola, já que no Brasil predomina o cultivo de feijão do pool gênico Mesoamericano.

Made available in DSpace on 2014-08-20T14:07:36Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertacao__Marilia_ W_ Marques.pdf: 521791 bytes, checksum: 960876c449dcc0e6427e3c297bd7b474 (MD5) Previous issue date: 2008-09-05 / The present work purposes to study the fungus Pseudocercospora griseola (Sacc) Crous & U. Braun, causal agent of angular leaf spot on common bean, to evaluate the incidence and severity in produced beans plants from seeds proceeding from pod with different levels of disease, as well as, to verify the effect in the physiological and sanitary quality of the produced seeds. For the development of the experiment, beans plants have been collected with high incidence of angular leaf spot, natural infestation the field. From the collected material it was elaborated a diagrammatic scales varying of 1 the 5, corresponding each note to a severity level on the physical structure of the pod. Parallel experiment was carried out, evaluating symptoms of angular spot in different places of the seed: hilum and coat. The tests carried through in the deriving seeds of the respective treatments had been: tests of germination (TPG), accelerated aging (EA), test of humidity and health. The results had shown that the incidence and the severity of angular leaf spot on common bean had been differed statistical between itself, where the levels of scale 1 and 5 had presented with minor and greater degree of incidence and severity of P. griseola, respectively. Whereas the seeds with symptoms in hilum and in the coat have presented resultes similar to the incidence and severity of the causal agent. The correlation enters the severity of pod and the severity of the disease in the plants was significant. There wasn´t statistical differences between the test of accelerated aging in the tested treatments, resulting a variation of 82-88% of normal seedlings. In the test of germination, treatment 5 differing statistical from the others treatments. In the sanitary analysis the fungus of storage increase incidence to the measure that increased the level of severity of the treatments. It was concluded in this work that pod with 60 % of symptoms of angular leaf spot have the capacity to intervene in the germination of the beans seeds and and that bigger levels of severity of the string beans cause a bigger development of the disease in field. / O presente trabalho teve por finalidade propor um estudo sobre o fungo Pseudocercospora griseola (Sacc) Crous & U. Braun, agente causal da mancha angular, através da avaliação da incidência e severidade em plantas de feijão produzidas a partir de sementes provenientes de vagens com diferentes níveis de severidade da doença, assim como verificar o efeito sobre a qualidade fisiológica e sanitária das sementes produzidas. Para a realização experimental foram coletadas plantas de feijão com alta incidência de mancha angular, infestação natural. A partir do material coletado procedeu-se separação das vagens a partir de uma escala diagramática variando de 1 a 5, correspondendo cada nota a um nível de severidade sobre a superfície da vagem. Experimento paralelo foi realizado, avaliando sintomas de mancha angular em diferentes locais da semente: hilo e tegumento. Os testes realizados nas sementes oriundas dos respectivos tratamentos foram: teste padrão de germinação (TPG), teste de envelhecimento acelerado (EA), determinação do teor de água e analise sanitária. Os resultados mostraram que a incidência e a severidade da mancha angular nas plantas de feijão diferiram-se estatisticamente entre si, onde os níveis da escala 1 e 5 apresentaram-se com menor e maior grau de incidência e severidade de P. griseola, respectivamente. As sementes com sintomas no hilo e sementes com lesões tegumentares apresentaram resultados semelhantes quanto à incidência e severidade do agente causal. A correlação entre a severidade da vagem e a severidade da doença nas plantas foi significativa. Quanto ao teste de envelhecimento acelerado, os tratamentos não diferiram estatisticamente entre si, resultando numa variação de 82 a 88% de plântulas normais. No teste padrão de germinação, o tratamento 5 diferiu estatisticamente dos demais tratamentos. Na análise sanitária, os gêneros fúngicos relacionados a armazenamento apresentaram maior incidência à medida que ocorreu aumento no nível de severidade dos tratamentos. Os resultados permitiram concluir que vagens com 60% de sintomas de mancha angular apresentam a capacidade de interferir no potencial germinativo das sementes de feijão e que maiores níveis de severidade das vagens ocasionam um maior desenvolvimento da doença em campo.