Orientador : Rosemeire Cristina Linhari Rodrigues Pietro / Coorientador: Ana Cláudia Pavarina / Banca: Edwil Aparecida de Lucca Gattas / Banca: Hérida Regina Nunes Salgado / Banca: Silvio Silverio da Silva / Banca: Carlos Henrique Gomes Martins / Resumo: O surgimento de biofilmes de Candida albicans como uma forma de resistência microbiana em superfícies sólidas é um problema de saúde pública crescente, uma vez que as opções terapêuticas eficientes para a redução e eliminação deste são escassas, sobretudo devido à sua alta resistência a antifúngicos. As enzimas produzidas por micro-organismos despertam um grande interesse por representarem uma opção biotecnológica aos enxaguatórios e antifúngicos disponíveis no mercado. O objetivo deste estudo foi produzir, determinar a atividade, fracionar três diferentes enzimas fúngicas (protease, amilase e lipase) e estabelecer a efetividade destas na redução de biofilme de C. albicans, além de avaliar os possíveis mecanismos de ação destas enzimas sobre o biofilme. A produção enzimática foi realizada por diferentes linhagens fúngicas a partir de fermentação submersa em biorreator, acompanhada de estudo dos parâmetros bioquímicos de cada enzima. A avaliação da efetividade frente ao biofilme de C. albicans foi realizada por diferentes métodos: redução de biofilme de C. albicans em microplaca de 96 orifícios por XTT; redução do número de unidades formadoras de colônia de biofilme por contagem em ágar Sabouraud dextrose com cloranfenicol (SDA); redução de biofilme em corpos de prova de resina acrílica por XTT e redução do número de unidades formadoras de colônia dos corpos de prova por contagem em ágar SDA. Ainda, foi analisada também a influência destas enzimas sobre fatores de virulência, ergosterol de parede e sobre o desenvolvimento e arquitetura do biofilme com a análise por microscopia eletrônica de varredura. As três enzimas foram eficientes nos ensaios de redução de biofilme, sobretudo frente a biofilmes maduros, de 48 horas, reduzindo cerca de 80-90% deste tanto em microplacas como em corpos de prova. Nos ensaios em microplacas, a amilase foi mais ativa dentre as três, em contato de 30 ... / Abstract: The emergence of Candida albicans biofilms as a form of microbial resistance on solid surfaces is a increasing public health problem, since the effective therapeutic options for the few reduction and elimination, mainly due to its high resistance to antifungals. The enzymes produced by microorganisms attract great interest because they represent an option to biotechnology and antifungal mouthwashes available in the market. The aim of this study was to produce, determine the activity, fractionate three different microbial enzymes (protease, amylase and lipase), and to evaluate the effectiveness in reducing biofilm of C. albicans besides the possible mechanisms of action of these enzymes on the biofilm. For enzyme production were used fungal strains submitted the liquid fermentation in bioreactor, accompanied by study of biochemical parameters of each enzyme. The assessment of effectiveness against biofilms of C. albicans was performed by different methods: Evaluation of the ability to reduce biofilm of C. albicans in microplate 96 wells by XTT; Evaluation of the reduction in the number of colony forming units of biofilm by counting in Sabouraud dextrose agar with chloramphenicol; Evaluation of biofilm reduction capacity of C. albicans in specimens of acrylic resin by XTT and reduction capacity of the number of colony forming units per count Sabouraud dextrose agar with chloramphenicol. In addition, it is also analyzed the influence of these enzymes on virulence factors and the development of biofilm architecture and by analysis in scanning electron microscopy. The three enzymes were effective in reducing assays well microplate as specimens, especially against mature biofilms, 48 hours. The assays in microplates, amylase was the most active enzyme of the three, in contact of 30 minutes, while the protease was more effective in contact of 60 minutes and the lipase was less active in both periods analyzed. However, in specimens, the enzymes ... / Doutor

Made available in DSpace on 2014-12-02T11:16:36Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2014-02-26Bitstream added on 2014-12-02T11:21:11Z : No. of bitstreams: 1 000798443_20150226.pdf: 399987 bytes, checksum: 543d4cc46e39f73299988030facaa4b7 (MD5) Bitstreams deleted on 2015-02-27T13:20:33Z: 000798443_20150226.pdf,Bitstream added on 2015-02-27T13:21:09Z : No. of bitstreams: 1 000798443.pdf: 3592822 bytes, checksum: 340bdbff7002bc9a19186e1b6b64a169 (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / O surgimento de biofilmes de Candida albicans como uma forma de resistência microbiana em superfícies sólidas é um problema de saúde pública crescente, uma vez que as opções terapêuticas eficientes para a redução e eliminação deste são escassas, sobretudo devido à sua alta resistência a antifúngicos. As enzimas produzidas por micro-organismos despertam um grande interesse por representarem uma opção biotecnológica aos enxaguatórios e antifúngicos disponíveis no mercado. O objetivo deste estudo foi produzir, determinar a atividade, fracionar três diferentes enzimas fúngicas (protease, amilase e lipase) e estabelecer a efetividade destas na redução de biofilme de C. albicans, além de avaliar os possíveis mecanismos de ação destas enzimas sobre o biofilme. A produção enzimática foi realizada por diferentes linhagens fúngicas a partir de fermentação submersa em biorreator, acompanhada de estudo dos parâmetros bioquímicos de cada enzima. A avaliação da efetividade frente ao biofilme de C. albicans foi realizada por diferentes métodos: redução de biofilme de C. albicans em microplaca de 96 orifícios por XTT; redução do número de unidades formadoras de colônia de biofilme por contagem em ágar Sabouraud dextrose com cloranfenicol (SDA); redução de biofilme em corpos de prova de resina acrílica por XTT e redução do número de unidades formadoras de colônia dos corpos de prova por contagem em ágar SDA. Ainda, foi analisada também a influência destas enzimas sobre fatores de virulência, ergosterol de parede e sobre o desenvolvimento e arquitetura do biofilme com a análise por microscopia eletrônica de varredura. As três enzimas foram eficientes nos ensaios de redução de biofilme, sobretudo frente a biofilmes maduros, de 48 horas, reduzindo cerca de 80-90% deste tanto em microplacas como em corpos de prova. Nos ensaios em microplacas, a amilase foi mais ativa dentre as três, em contato de 30 ... / The emergence of Candida albicans biofilms as a form of microbial resistance on solid surfaces is a increasing public health problem, since the effective therapeutic options for the few reduction and elimination, mainly due to its high resistance to antifungals. The enzymes produced by microorganisms attract great interest because they represent an option to biotechnology and antifungal mouthwashes available in the market. The aim of this study was to produce, determine the activity, fractionate three different microbial enzymes (protease, amylase and lipase), and to evaluate the effectiveness in reducing biofilm of C. albicans besides the possible mechanisms of action of these enzymes on the biofilm. For enzyme production were used fungal strains submitted the liquid fermentation in bioreactor, accompanied by study of biochemical parameters of each enzyme. The assessment of effectiveness against biofilms of C. albicans was performed by different methods: Evaluation of the ability to reduce biofilm of C. albicans in microplate 96 wells by XTT; Evaluation of the reduction in the number of colony forming units of biofilm by counting in Sabouraud dextrose agar with chloramphenicol; Evaluation of biofilm reduction capacity of C. albicans in specimens of acrylic resin by XTT and reduction capacity of the number of colony forming units per count Sabouraud dextrose agar with chloramphenicol. In addition, it is also analyzed the influence of these enzymes on virulence factors and the development of biofilm architecture and by analysis in scanning electron microscopy. The three enzymes were effective in reducing assays well microplate as specimens, especially against mature biofilms, 48 hours. The assays in microplates, amylase was the most active enzyme of the three, in contact of 30 minutes, while the protease was more effective in contact of 60 minutes and the lipase was less active in both periods analyzed. However, in specimens, the enzymes ...

Resumo: A família Eriocaulaceae apresenta cerca de 1.200 espécies e 11 gêneros, com distribuição pantropical. Suas espécies são conhecidas popularmente como „sempre viva‟. Leiothrix spiralis Ruhland e Syngonanthus nitens (Bong) Ruhland são espécies de Eriocaulaceae, estudos químicos tem mostrado predominantemente a presença de xantonas e flavonas, principalmente O-glicosídeos e C-glicosídeos derivados da luteolina. Propriedades etnofarmacológicas de Eriocaulaceae são pouco conhecidas. Por esta razão, foi avaliado o potencial biológico dos extratos e compostos isolados das espécies L. spiralis e S. nitens. Os extratos metanólicos de escapos, capítulos e folhas destas espécies e os compostos fenólicos isolados do extrato metanólico de folhas de L. spiralis mostraram significativa atividade antimicrobiana contra bactérias Gram-positivas e Gram-negativas e leveduras, a capacidade antioxidante pelo ensaio de redução do ABTS●+ pode ser observada. Os extratos foram avaliados quanto à capacidade de inibir a formação de hifas de C. albicans, sendo verificado que o extrato de escapos de S. nitens foi capaz de inibir a fase de transição para a forma filamentosa. As atividades citotóxica e hemolítica dos extratos foram investigadas e o extrato metanólico de folhas de L. spiralis apresentou ação citotóxica sobre as células HeLa. O extrato de escapos de S. nitens foi incorporado a um creme vaginal e avaliada a atividade antifúngica e mutagênica em um modelo animal de candidíase vaginal. Os resultados mostraram que o tratamento com este produto foi eficaz neste modelo animal, erradicando a carga fúngica vaginal de ratas infectadas após 8 dias de tratamento. A atividade mutagênica foi avaliada pelo teste do micronúcleo, em tratamento agudo e subagudo, e o produto não apresentou mutagenicidade nessas condições. O presente estudo sugere que estas espécies podem ser uma fonte promissora para aplicação como antifúngico / Abstract: Eriocaulaceae is a pantropical family, comprising around 1200 species in 11 genera. Their species are popularly known as „sempre viva‟. Leiothrix spiralis Ruhland and Syngonanthus nitens (Bong.) Ruhland are two species of Eriocaulaceae, and chemical studies of these species showed predominantly flavones, mainly O-glucosides and C-glucosides derivatives of luteolin. The ethnopharmacological properties of Eriocaulaceae are little known. For this reason we evaluate the biological potential of extracts and isolated compounds from L. spiralis and S. nitens. The methanolic extracts from capitula and flower heads from this species and the phenolics isolated from the methanolic extract of leaves of L. spiralis showed significantly antimicrobial activity against Gram-positive and Gram-negative organisms and yeasts, and the antioxidant capacity by the ABTS●+ reduction assay could be observed. The extracts were evaluated as the ability to inhibit the hyphal formation on C. albicans and the extract of flower heads of S. nitens was able to inhibit the transition stage from budding to hyphal growth. The cytotoxic and hemolytic activities of the extracts were investigated and the extract of leaves of L. spiralis showed cytotoxic action on HeLa cells. A vaginal cream containing the methanolic extract of scapes from S. nitens was tested as antifungal and mutagenic in a vaginal candidiasis animal model. The results showed that treatment with this product was very effective in this animal model, and was able eradicate the vaginal fungal burden of infected rats after 8 days on treatment. The in vivo mutagenic activity of the vaginal cream was assessed by the micronucleus assay, in acute and subacute treatment, and it was not mutagenic in this conditions. The present study suggests that these Eriocaulaceae species could be a promising source of compounds to produce antifungal phytomedicines / Orientador: Taís Maria Bauab / Coorientador: Maria Virginia Costa Scarpa / Banca: Marlus Chorilli / Banca: Hérida Regina Nunes Salgado / Banca: Claudia Elena Sotomayor / Banca: Elfriede Marianne Bacchi / Doutor

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:31:27Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2011-05-20Bitstream added on 2014-06-13T19:20:29Z : No. of bitstreams: 1 araujo_mgf_dr_arafcf.pdf: 2084466 bytes, checksum: cbbeaab6200eb613c54158e1494c0dfd (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Universidade Estadual Paulista (UNESP) / A família Eriocaulaceae apresenta cerca de 1.200 espécies e 11 gêneros, com distribuição pantropical. Suas espécies são conhecidas popularmente como „sempre viva‟. Leiothrix spiralis Ruhland e Syngonanthus nitens (Bong) Ruhland são espécies de Eriocaulaceae, estudos químicos tem mostrado predominantemente a presença de xantonas e flavonas, principalmente O-glicosídeos e C-glicosídeos derivados da luteolina. Propriedades etnofarmacológicas de Eriocaulaceae são pouco conhecidas. Por esta razão, foi avaliado o potencial biológico dos extratos e compostos isolados das espécies L. spiralis e S. nitens. Os extratos metanólicos de escapos, capítulos e folhas destas espécies e os compostos fenólicos isolados do extrato metanólico de folhas de L. spiralis mostraram significativa atividade antimicrobiana contra bactérias Gram-positivas e Gram-negativas e leveduras, a capacidade antioxidante pelo ensaio de redução do ABTS●+ pode ser observada. Os extratos foram avaliados quanto à capacidade de inibir a formação de hifas de C. albicans, sendo verificado que o extrato de escapos de S. nitens foi capaz de inibir a fase de transição para a forma filamentosa. As atividades citotóxica e hemolítica dos extratos foram investigadas e o extrato metanólico de folhas de L. spiralis apresentou ação citotóxica sobre as células HeLa. O extrato de escapos de S. nitens foi incorporado a um creme vaginal e avaliada a atividade antifúngica e mutagênica em um modelo animal de candidíase vaginal. Os resultados mostraram que o tratamento com este produto foi eficaz neste modelo animal, erradicando a carga fúngica vaginal de ratas infectadas após 8 dias de tratamento. A atividade mutagênica foi avaliada pelo teste do micronúcleo, em tratamento agudo e subagudo, e o produto não apresentou mutagenicidade nessas condições. O presente estudo sugere que estas espécies podem ser uma fonte promissora para aplicação como antifúngico / Eriocaulaceae is a pantropical family, comprising around 1200 species in 11 genera. Their species are popularly known as „sempre viva‟. Leiothrix spiralis Ruhland and Syngonanthus nitens (Bong.) Ruhland are two species of Eriocaulaceae, and chemical studies of these species showed predominantly flavones, mainly O-glucosides and C-glucosides derivatives of luteolin. The ethnopharmacological properties of Eriocaulaceae are little known. For this reason we evaluate the biological potential of extracts and isolated compounds from L. spiralis and S. nitens. The methanolic extracts from capitula and flower heads from this species and the phenolics isolated from the methanolic extract of leaves of L. spiralis showed significantly antimicrobial activity against Gram-positive and Gram-negative organisms and yeasts, and the antioxidant capacity by the ABTS●+ reduction assay could be observed. The extracts were evaluated as the ability to inhibit the hyphal formation on C. albicans and the extract of flower heads of S. nitens was able to inhibit the transition stage from budding to hyphal growth. The cytotoxic and hemolytic activities of the extracts were investigated and the extract of leaves of L. spiralis showed cytotoxic action on HeLa cells. A vaginal cream containing the methanolic extract of scapes from S. nitens was tested as antifungal and mutagenic in a vaginal candidiasis animal model. The results showed that treatment with this product was very effective in this animal model, and was able eradicate the vaginal fungal burden of infected rats after 8 days on treatment. The in vivo mutagenic activity of the vaginal cream was assessed by the micronucleus assay, in acute and subacute treatment, and it was not mutagenic in this conditions. The present study suggests that these Eriocaulaceae species could be a promising source of compounds to produce antifungal phytomedicines