Made available in DSpace on 2016-06-02T20:20:27Z (GMT). No. of bitstreams: 1 1613.pdf: 2733672 bytes, checksum: 5d28936faff68884f2e78dbc12f2ebcb (MD5) Previous issue date: 2007-04-27 / Financiadora de Estudos e Projetos / Chromosomes of distinct species of Triportheus (Characiformes, Characidae) from different hydrographic basins in Brazil, as well as in Argentina, were analyzed in the present work. Triportheus nematurus, from Piracicaba River (São Paulo State, Brazil), was analyzed for the first time, using conventional cytogenetic techniques, base-specific fluorochromes and physical mapping of 18S rDNA and 5S rDNA. The diploid number found in all species was 2n= 52 chromosomes, in both males and females. Females presented a pair of quite differentiated heteromorphic chromosomes, characterizing a ZZ/ZW sex chromosome system. The Z chromosome is the largest in the karyotype, bearing constitutive heterochromatin at pericentromeric and telomeric regions. The W chromosome is mostly heterochromatic, showing a heterogeneous heterochromatin, composed of GC- and AT-rich regions The Ag-NORs were equivalent to 18S rDNA sites detected through fluorescent in situ hybridization. The 5S rDNA is syntenic and adjacent to 18S rDNA site, characterizing an uncommon situation amongst fishes. The results obtained in T. nematurus agree with previous studies in this group, reinforcing the basal condition of the system ZZ/ZW in the phylogeny of this genus, prior to speciation events. Besides T. nematurus, other seven species/populations of Triportheus were analyzed by FISH with 18S and 5S rDNA probes. The results confirmed the presence of 18S sites on the W chromosome in all Triportheus species herein studied, even when Ag-NORs showed to be inactive. The 5S rDNA sites, not reported in this group so far, were always located on short arms of a single chromosomal pair, close to centromeres. The only exception was T. auritus, which presented ten 5S rDNA sites. Two distinct T. nematurus populations (Piracicaba River SP and Paraná River Argentina) presented synteny between 18S and 5S ribosomal genes, located on short arm of a NOR-bearing chromosomal pair. A probe for whole chromosome painting (WCP), specific to the Z chromosome of T. nematurus (Piracicaba River), was obtained by microdissection, followed by unspecific amplification via DOP-PCR (Degenerate Oligonucleotide Primed-PCR). Fluorescent in situ hybridization with such probe was performed in Triportheus species, as well as in other Characidae species belonging to genus closed to Triportheus. In male specimens of Triportheus, both Z chromosomes (1st large metacentric pair) presented conspicuous marks over their whole extension. In females, the Z chromosome showed the same pattern observed in males while the W chromosome bears only a subtle signal on the short arm, or on the long arm close to centromere, according to species. Therefore, the region of the W chromosome with homology to Z chromosome is relatively small. All the other Characidae species analyzed presented no positive signals after hybridization using Z chromosome of Tirportheus nematurus as a probe, even in those apparently closely related to this genus. Thus, these results stress out, positively, that the ZZ/ZW system should actually correspond to a synapomorphy shared by Triportheus species, likely to be unique to this Characidae group. / No presente estudo foram analisados os cromossomos de distintas espécies de Triportheus (Characiformes, Characidae), de diferentes bacias hidrográficas do Brasil, assim como da Argentina. Triportheus nematurus, proveniente do rio Piracicaba - SP, foi analisada pela primeira vez, utilizando técnicas de estudo convencionais, fluorocromos base-específicos e o mapeamento físico dos sitos de rDNA 18S e de rDNA 5S. O número diplóide encontrado foi de 2n=52 cromossomos, tanto em machos como em fêmeas. As fêmeas apresentaram um par de cromossomos heteromórficos bem diferenciados, caracterizando um sistema de cromossomos sexuais do tipo ZZ/ZW. O cromossomo Z é o maior do complemento, com a ocorrência de heterocromatina constitutiva nas regiões pericentromérica e teloméricas. O cromossomo W é em grande parte heterocromático, evidenciando heterocromatina heterogênea, composta por regiões GC- e AT-ricas. As Ag-RONs, em concordância com os sítios de rDNA 18S, detectados pela hibridação fluorescente in situ. O rDNA 5S, mostra uma localização sintênica e adjacente ao rDNA 18S, caracterizando uma situação pouco freqüente entre os peixes. Os resultados obtidos em T. nematurus concordam com estudos prévios nesse grupo, reforçando a condição basal do sistema ZZ/ZW na filogenia do gênero, provavelmente pré-datando os eventos de especiação. Além de T. nematurus, mais sete espécies/populações de Triportheus foram analisas por FISH com sondas de rDNA 18S e 5S. Os resultados confirmaram a presença de sítios 18S no cromossomo W em todas as espécies de Triportheus aqui analisadas, mesmo nos casos onde as Ag-RONs mostraram-se inativas. Os sítios de rDNA 5S, que ainda não tinham sido descritos para o grupo, encontram-se sempre localizados no braço curto de um só par de cromossomos, adjacentes ao centrômero. A única exceção ocorreu em T. auritus, que apresentou 10 sítios de rRNA 5S. Duas populações distintas de T. nematurus (rio Piracicaba SP e rio Paraná Argentina) apresentaram sintenia dos genes ribossomais no braço curto de um par cromossômico correspondente ao portador de Ag-RONs. Uma sonda para pintura cromossômica total (WCP - Whole Chromosome Painting), específica do cromossomo Z de T. nematurus (rio Piracicaba), foi obtida por intermédio de microdissecção, seguida por amplificação inespecífica por DOP-PCR (Degenerate Oligonucleotide Primed-PCR). Hibridações fluorescentes in situ, utilizando-se esta sonda, foram realizadas em espécies/populações de Triportheus, assim como em espécies de outros gêneros da família Characidae filogenticamente próximos de Triportheus. Nos espécimes machos de Triportheus, os dois cromossomos Z (1º par metacêntrico grande) apresentaram uma forte marcação em toda sua extensão. Nas fêmeas, o cromossomo Z (1o metacêntrico grande) mostra o mesmo padrão observado nos machos e o cromossomo W se apresenta apenas com sutil marcação no braço curto ou no braço longo, em uma região adjacente ao centrômero, conforme a espécie. Assim sendo, a região do cromossomo W que mantém homologia com o cromossomo Z é relativamente pequena, demonstrando a grande diferenciação desse cromossomo ao longo da evolução do sistema ZZ/ZW no grupo. Todas as demais espécies de Characidae testadas não apresentaram sinais positivos de hibridação com a sonda do cromossomo Z de Triportheus, mesmo sendo relativamente próximas desse gênero. Assim sendo, esses resultados reforçam, de modo mais positivo, que o sistema ZZ/ZW deve de fato corresponder à uma sinapomorfia entre as espécies de Triportheus, aparentemente exclusiva desse grupo de Characidae

Made available in DSpace on 2016-06-02T20:20:30Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2828.pdf: 14647874 bytes, checksum: 8fb4ecaf07755c78ec51b1069a9943aa (MD5) Previous issue date: 2010-01-29 / Universidade Federal de Sao Carlos / Cyphocharax nagelii, Cyphocharax modestus, and Steindachnerina insculpta were the curimatid species analyzed in the present work. The objectives for all species were to identify sequences that could be used as chromosomal markers, to infer on the active mechanisms in their chromosomal evolution and of the family Curimatidae, and to determine indirectly the nucleotide composition of chromosomal regions. Additionally, the present work also aimed to analyze the B chromosome of C. nagelii, investigating the mitotic and meiotic behavior of this element and making inferences on its origins and evolution. The encountered diploid number was of 2n=54 with meta- and submetacentric chromosomes, corroborating the karyotypic macrostructure of the family Curimatidae. B chromosomes were detected in C. nagelii and analyses indicated that this element is potentially stable during mitosis. The presence of B chromosomes in other curimatid species suggests that this element represents an additional karyotypic differentiation mechanism. In the analyses of metaphase I cells of C. nagelii, the B chromosome behaved as a univalent, indicating possible segregation instability of this element. The C-banding technique evidenced heterochromatin blocks in the pericentromeric region of all chromosomes of the complement, as well as a few telomeric blocks, in the three studied species (B chromosomes in C. nagelii are heterochromatic). No chromosomal heteromorphisms regarding size, morphology, or C-banding pattern that could be associated with the presence of sex chromosomes were found in any of the three curimatid species. Microdissection of the B chromosome and consequent in situ hybridization with the produced probe showed that these elements share many mutual sequences, but the same does not occur with chromosomes of complement A of C. nagelii, C. modestus, or S. insculpta. The use of the base-specific CMA3/DAPI fluorochromes, silver nitrate staining, and 18S rDNA probes allowed the identification of 45S rDNA sites. These sites are present in an autossome pair in the three studied species, as well as in most curimatids. In C. nagelii and C. modestus, the 5S rDNA region is present in chromosome pairs 3 and 20; in S. insculpta only pair 3 contained the 5S rDNA gene. The presence of 5S rDNA in the third pair of the three described species points to a possible conserved location of this gene. A size difference was seen between the 5S rDNA sites, probably owing to the presence of two quantitavely different clusters of this ribosomal sequence. The B chromosomes of C. nagelii do not support 5S or 18S rDNA sequences and were not differentially marked by DAPI or CMA3. The hypothesis that karyotypic evolution in curimatids involves rearrangements of the centric fission/fusion and pericentric inversion type was suggested. Telomeric DNA sequences (TTAGGG)n were used in C. nagelii. The chromosomes of complement A as well as of complement B showed signs in the telomeric region. Furthermore, at least two autosome pairs exhibited telomeric sequences in an interstitial position, thus corroborating the hypothesis of centric fission/fusion evolution combined with pericentric inversion for the family Curimatidae. / Cyphocharax nagelii, Cyphocharax modestus e Steindachnerina insculpta, foram as espécies de curimatídeos analisadas no presente trabalho. Nas três espécies investigadas, os objetivos foram identificar sequências que pudessem ser usadas como marcadores cromossômicos, inferir sobre os mecanismos atuantes na evolução cromossômica destas espécies e paralelamente na família Curimatidae e ainda, determinar indiretamente a composição nucleotídica de regiões cromossômicas. Além disso, também foi objetivo do presente trabalho a análise do cromossomo B de C. nagelii, procurando investigar o comportamento mitótico e meiótico deste elemento e fazer inferências sobre sua origem e evolução. O número diplóide encontrado foi 2n=54 com cromossomos meta- ou submetacêntricos, corroborando a macroestrutura cariotípica da família Curimatidae. Foi detectada a presença de cromossomos B em C. nagelii, e as análises indicaram que este elemento seria mitoticamente estável. A presença de cromossomos B em outras espécies de curimatídeos sugere que este elemento represente um mecanismo de diferenciação cariotípica adicional. Nas análises de células metafásicas I de C. nagelii, o cromossomo B comportou-se como um univalente, indicando uma possível instabilidade segregacional desse elemento. A técnica de bandamento C, evidenciou blocos de heterocromatina na região pericentromérica de todos os cromossomos do complemento, e alguns blocos teloméricos, nas três espécies estudadas; os cromossomos B de C. nagelii são heterocromáticos. Nas três espécies de curimatídeos não foram encontrados heteromorfismos cromossômicos, quanto ao tamanho, morfologia ou padrão de bandamento C, que pudessem estar associados à presença de cromossomos sexuais. A microdissecção cromossômica do B e a conseqüente hibridação in situ com a sonda produzida, mostraram que estes elementos compartilham muitas seqüências entre si, mas, o mesmo não ocorre com os cromossomos do complemento A de C. nagelii ou de C. modestus e S. insculpta. O uso dos fluorocromos base-específicos CMA3/DAPI, impregnação por nitrato de prata e sondas de rDNA 18S, permitiram a identificação dos sítios de rDNA 45S. Estes sítios estão presentes em um par de autossomos nas três espécies estudadas, assim como na maioria dos curimatídeos. Em C. nagelii e em C. modestus a região de rDNA 5S, está presente nos pares cromossômicos 3 e 20; em S. insculpta apenas o par 3 continha o gene de rRNA 5S. A presença de rDNA 5S no par 3 das três espécies descritas, aponta para uma possível localização conservada desse gene. Foi constatada uma diferença de tamanho entre os sítios de rDNA 5S, devido provavelmente a presença de dois clusters quantitativamente diferentes desta seqüência ribossômica. Os cromossomos B de C. nagelii não comportam seqüências de rDNA 5S ou 18S e não foram marcados diferencialmente pelo DAPI ou CMA3. A hipótese de que a evolução cariotípica nos curimatídeos envolveria, rearranjos do tipo fissão/fusão cêntrica e inversão pericêntrica, foi sugerida. Seqüências de DNA telomérico (TTAGGG)n foram utilizadas em C. nagelii. Os cromossomos do complemento A, bem como os cromossomos B mostraram sinais na região telomérica. Além disso, pelo menos dois pares autossômicos mostraram seqüências teloméricas na posição intersticial, corroborando a hipótese de evolução por fissão/fusão cêntrica e inversão pericêntrica para família Curimatidae.

Cromossomos sexuais evoluíram repetidas vezes independentemente nos grandes grupos de vertebrados. Sistemas sexuais altamente diferenciados e antigos são caracterizados por grandes diferenças morfológicas e de conteúdo gênico entre os dois cromossomos homólogos onde a recombinação é restrita a uma pequena região homóloga. Os sistemas recentes característicos de peixes caracterizam-se pela similaridade entre os cromossomos X e Y (ou Z e W), nos quais as diferenças observadas freqüentemente envolvem a presença de heterocromatina, translocações e inversões. A recombinação ocorre entre o par sexual na maior parte de sua extensão, sendo inibida apenas na região diretamente relacionada com a determinação sexual. Notavelmente, sistemas diferentes de determinação podem ser encontrados em espécies, ou mesmo populações. O gênero Eigenmannia compreende grupos de espécies crípticas do ponto de vista morfológico que exibem variação no número cromossômico e podem apresentar sistemas sexuais XY ou ZW, incluindo sistemas múltiplos (com translocação Y-autossomo). Estes sistemas estão entre os mais recentes descritos (<16ma) e estão dispostos de forma desordenada em árvores de relações filogenéticas, sugerindo origens múltiplas. No presente estudo, a técnicas de pintura cromossômica usando sondas obtidas por microdissecção de cromossomos sexuais foram empregadas para testar a homologia de dois sistemas XY encontrados nos citótipos (ou espécies) E. virescens e E. sp.2. Os resultados mostram que, de fato, ambos são não homólogos. A fusão Y-autossomo provavelmente ocorreu após a separação de E. sp.2 com sua espécie irmã, E. sp.1 uma vez que um evento de fusão independente, envolvendo um dos cromossomos homólogos ao Y, foi detectado em E. sp.1. A hibridação in sit&#956; do cromossomo X de E. virescens em sua população mais próxima (também com 38 cromossomos, mas sem cromossomos sexuais heteromórficos) mostrou que o cromossomo X é homólogo a um par de acrocêntricos, condizente com o modelo proposto de diferenciação por acúmulo de heterocromatina. Essa heterocromatina foi caracterizada e mostrou um padrão complexo de seqüências CG-ricas. Dois fragmentos de DNA repetitivo GC-ricos presentes no cromossomo X foram isolados e seqüenciados. Não foram detectadas similaridades em comparações com bases de dados e entre os fragmentos obtidos. Estes mostraram-se concentrados nas regiões cromomicina-positivas de E. virescens, incluindo regiões periteloméricas de sete pares e os dois maiores blocos heterocromáticos (nos cromossomos X e par n. 8), além de um cromossomo acrocêntrico, possivelmente o Y. Curiosamente, essas seqüências foram detectadas em apenas três pares cromossômicos na população mais próxima, incluindo um par acrocêntrico de morfologia semelhante à condição ancestral do X, sugerindo que processos dinâmicos de expansão e homogenização genômica ocorreram após a separação dessas populações / Sex chromosomes have evolved independently several times in all major groups of vertebrates. Highly differentiated sex chromosomes are characterized by extensive differences in morphology and gene content, whereas recombination is restricted to a small homologous region. Recent sex chromosomes are characteristic of fish, and display a high level of homology between X and Y (or Z and W) chromosomes, recombination is restricted only in a small sex determining region. Notably, different sex chromosome systems can be found in closely related groups, such as species or even populations. The genus Eigenmannia comprises a group of morphologically cryptic species that display a variety of diploid numbers and different sex chromosome systems, including XY, ZW and a multiple XY system (with a Y-autosome fusion). These systems are among the most recent known (<16ma) and occur with a lack of phylogenetic pattern, whereas frequently populations bearing heteromorphic sex chromosomes are closest related to populations displaying no sex chromosomes. In the present study, chromosome painting using probes derived from the microdissection of two different sex chromosomes where used to investigate the homology of both systems. Results show that, in fact, they are non-homologous and evolved independently. The Y-autosome hypothesis gained further support from the observation that a chromosome homologous to the Y in a close population is involved in yet a different fusion event. The X chromosome present in the E. virescens karyotype was found to be homologous to acrocentric chromosomes in all populations analyzed, thus supporting the notion that its differentiations is mainly due to the accumulation of heterochromatin. The X heterochromatic block was shown to form a complex pattern of GC-rich sequences, different from what was previously described. Two GC-rich fragments were isolated and sequenced; both showed no similarities to known sequences and to one another. These sequences were shown to be concentrated viii on the two largest heterochromatic blocks, those of the X and n.8 chromosomes besides peri-telomeric regions of seven additional pairs and the putative Y. Curiously, these sequences were detected in only three pairs in the closest population, including an acrocentric pair morphologically similar to undifferentiated sex pair. This suggests that dynamic evolutionary processes of expansion and genomic homogenization have occurred after the separation of these populations.

Cromossomos sexuais evoluíram repetidas vezes independentemente nos grandes grupos de vertebrados. Sistemas sexuais altamente diferenciados e antigos são caracterizados por grandes diferenças morfológicas e de conteúdo gênico entre os dois cromossomos homólogos onde a recombinação é restrita a uma pequena região homóloga. Os sistemas recentes característicos de peixes caracterizam-se pela similaridade entre os cromossomos X e Y (ou Z e W), nos quais as diferenças observadas freqüentemente envolvem a presença de heterocromatina, translocações e inversões. A recombinação ocorre entre o par sexual na maior parte de sua extensão, sendo inibida apenas na região diretamente relacionada com a determinação sexual. Notavelmente, sistemas diferentes de determinação podem ser encontrados em espécies, ou mesmo populações. O gênero Eigenmannia compreende grupos de espécies crípticas do ponto de vista morfológico que exibem variação no número cromossômico e podem apresentar sistemas sexuais XY ou ZW, incluindo sistemas múltiplos (com translocação Y-autossomo). Estes sistemas estão entre os mais recentes descritos (<16ma) e estão dispostos de forma desordenada em árvores de relações filogenéticas, sugerindo origens múltiplas. No presente estudo, a técnicas de pintura cromossômica usando sondas obtidas por microdissecção de cromossomos sexuais foram empregadas para testar a homologia de dois sistemas XY encontrados nos citótipos (ou espécies) E. virescens e E. sp.2. Os resultados mostram que, de fato, ambos são não homólogos. A fusão Y-autossomo provavelmente ocorreu após a separação de E. sp.2 com sua espécie irmã, E. sp.1 uma vez que um evento de fusão independente, envolvendo um dos cromossomos homólogos ao Y, foi detectado em E. sp.1. A hibridação in sit&#956; do cromossomo X de E. virescens em sua população mais próxima (também com 38 cromossomos, mas sem cromossomos sexuais heteromórficos) mostrou que o cromossomo X é homólogo a um par de acrocêntricos, condizente com o modelo proposto de diferenciação por acúmulo de heterocromatina. Essa heterocromatina foi caracterizada e mostrou um padrão complexo de seqüências CG-ricas. Dois fragmentos de DNA repetitivo GC-ricos presentes no cromossomo X foram isolados e seqüenciados. Não foram detectadas similaridades em comparações com bases de dados e entre os fragmentos obtidos. Estes mostraram-se concentrados nas regiões cromomicina-positivas de E. virescens, incluindo regiões periteloméricas de sete pares e os dois maiores blocos heterocromáticos (nos cromossomos X e par n. 8), além de um cromossomo acrocêntrico, possivelmente o Y. Curiosamente, essas seqüências foram detectadas em apenas três pares cromossômicos na população mais próxima, incluindo um par acrocêntrico de morfologia semelhante à condição ancestral do X, sugerindo que processos dinâmicos de expansão e homogenização genômica ocorreram após a separação dessas populações / Sex chromosomes have evolved independently several times in all major groups of vertebrates. Highly differentiated sex chromosomes are characterized by extensive differences in morphology and gene content, whereas recombination is restricted to a small homologous region. Recent sex chromosomes are characteristic of fish, and display a high level of homology between X and Y (or Z and W) chromosomes, recombination is restricted only in a small sex determining region. Notably, different sex chromosome systems can be found in closely related groups, such as species or even populations. The genus Eigenmannia comprises a group of morphologically cryptic species that display a variety of diploid numbers and different sex chromosome systems, including XY, ZW and a multiple XY system (with a Y-autosome fusion). These systems are among the most recent known (<16ma) and occur with a lack of phylogenetic pattern, whereas frequently populations bearing heteromorphic sex chromosomes are closest related to populations displaying no sex chromosomes. In the present study, chromosome painting using probes derived from the microdissection of two different sex chromosomes where used to investigate the homology of both systems. Results show that, in fact, they are non-homologous and evolved independently. The Y-autosome hypothesis gained further support from the observation that a chromosome homologous to the Y in a close population is involved in yet a different fusion event. The X chromosome present in the E. virescens karyotype was found to be homologous to acrocentric chromosomes in all populations analyzed, thus supporting the notion that its differentiations is mainly due to the accumulation of heterochromatin. The X heterochromatic block was shown to form a complex pattern of GC-rich sequences, different from what was previously described. Two GC-rich fragments were isolated and sequenced; both showed no similarities to known sequences and to one another. These sequences were shown to be concentrated viii on the two largest heterochromatic blocks, those of the X and n.8 chromosomes besides peri-telomeric regions of seven additional pairs and the putative Y. Curiously, these sequences were detected in only three pairs in the closest population, including an acrocentric pair morphologically similar to undifferentiated sex pair. This suggests that dynamic evolutionary processes of expansion and genomic homogenization have occurred after the separation of these populations.