Primary wool follicles are initiated in the skin of sheep foetuses at approximately day 50 of gestation as the result of complex reciprocal molecular interactions between the mesenchyme and overlying epithelium. The lifetime wool production potential and fibre diameter of the Merino sheep is dependent on the total number of follicles initiated in utero. Understanding the molecular events that surround primary wool follicle initiation may provide approaches to enhance or manipulate this process in order to maximise the profitability of wool production enterprises. In order to study the morphological and molecular changes occurring during early wool follicle development, a foetal skin series spanning primary follicle initiation was generated. Foetal skin was sampled from the shoulder, midside and rump of four foetuses at 8 time points between day 43 and day 68 of gestation. Histological characterisation of the shoulder skin samples revealed that primary epidermal placodes emerged at around day 53, dermal condensates were visible from day 57 and downgrowth of the follicle began at day 68. An equation relating age of the foetus (day of gestation post AI) and crown-rump length, specific to Merino foetuses, was developed for use in future studies of this nature. Molecular markers of fibroblast migration, epidermal and dermal stem cells and cell proliferation were selected to test the hypothesis that dermal condensates are initiated at discrete sites beneath the epidermis as a result of a combination of migration and arrangement of multipotent pre-papilla cells. Quantitative reverse transcription polymerase chain reaction (qRT-PCR) analysis of RAC1 and RHOa (migration markers), β1-integrin and alkaline phosphatase (stem cell markers), proliferative nuclear cell antigen and cyclinB1 (proliferation markers), patched-1, selected tumor necrosis factor (TNF) signalling molecules and eleven reference genes was conducted using midside and rump skin samples from each of four foetuses from the 8 time points. geNorm analysis of the reference and target genes revealed that the migration markers RAC1 and RHOa along with GAPDH were the most stably expressed genes in this sample series. Significant changes in mRNA expression were detected for β1-integrin, alkaline phosphatase, patched-1 and the TNF members EDA, EDAR, TROY and TRAF6. Many of these significant differences in expression coincided with key morphological events. Significant differences in expression were also detected between the midside and rump samples for numerous transcripts. Laser capture microdissection (LCM) was implemented for analysis of the target transcripts within particular structures of foetal sheep skin. Frozen tissue sectioning, staining, LCM, RNA extraction and cDNA synthesis were optimised for qRT-PCR analysis of endogenous controls and selected TNF transcripts. Several RNA extraction methods and reverse transcription approaches were trialled to ensure optimum extraction and reverse transcription efficiency for this tissue type. Exogenous mRNA transcripts were also incorporated prior to RNA extraction and reverse transcription to track reaction efficiency between samples. A comparison of different slide types revealed that laser pressure catapulting from membrane slides was an absolute requirement for foetal skin tissue studies. Follicle regions (including the epidermal placode and dermal condensate) and the adjacent non-follicle regions were laser captured from foetal skin, and the mRNA expression levels of patched-1 and selected TNF members was compared. Preliminary qRT-PCR analysis using this technique revealed that EDAR, TROY and PTCH1 mRNA levels were higher in the follicle regions than the non-follicle regions. The TNF signalling pathway appears to play an important role in primary wool follicle initiation and patterning at different sites on the body. Spatial differences in expression of some of these regulators may be involved in initiating different types of follicles. The molecular events surrounding primary wool follicle initiation also show a high degree of conservation between sheep, humans, and mice. Considering the high degree of DNA sequence conservation as well as the histological, signalling and cycling similarities between sheep and humans, sheep may represent a better model for the study of human hair follicle initiation and disease than the currently used mice and rat models. / http://proxy.library.adelaide.edu.au/login?url= http://library.adelaide.edu.au/cgi-bin/Pwebrecon.cgi?BBID=1523639 / Thesis (Ph.D.) -- University of Adelaide, School of Agriculture, Food and Wine, 2010

O eucalipto é uma das espécies arbóreas mais plantadas no mundo atualmente, principalmente devido ao seu uso como matéria prima para as indústrias de celulose, papel e madeireira. Eucalyptus globulus e seus híbridos possuem baixos teores de lignina e despertam grande interesse da indústria, já que essa característica facilita e diminui o custo do processo de extração da celulose. Entretanto, essa espécie é recalcitrante ao enraizamento adventício, o que dificulta a propagação vegetativa de suas mudas. Com o objetivo de melhor entender os mecanismos moleculares envolvidos na recalcitrância ao enraizamento em E. globulus, o presente estudo envolveu análises de parâmetros morfológicos, anatômicos e moleculares durante a rizogênese adventícia nesta espécie. A exposição à auxina exógena reverteu o fenótipo recalcitrante em E. globulus, aumentando significativamente a porcentagem de enraizamento. O câmbio vascular foi identificado como uma região de acúmulo de auxina e local de origem das raízes adventícias. Através de análises da expressão gênica em células do câmbio, observou-se que TOPLESS e IAA12, repressores da sinalização de auxina, e ARR1, envolvido na rota de sinalização de citocininas, parecem atuar como reguladores negativos do enraizamento adventício. A alta expressão destes genes em plantas controle foi significativamente diminuída com aplicação de auxina exógena. Comparativamente, em espécie de fácil enraizamento, E. grandis, a expressão destes genes se manteve em níveis mais baixos em ambas as condições de tratamento, e a concentração de ácido indol-3-acético endógeno em plantas controle mostrou-se mais elevada. Análises do padrão proteico durante o enraizamento em plantas de E. globulus tratadas ou não com auxina exógena identificaram proteínas envolvidas em diversos processos biológicos, principalmente estresse oxidativo e metabolismo energético. Diferenças interessantes foram identificadas ao comparar as diferentes condições e fases do enraizamento. Várias proteínas foram claramente relacionadas com o respectivo fenótipo apresentado pela planta em cada situação, principalmente considerando plantas controle. Os resultados aqui apresentados representam avanços relevantes no conhecimento sobre a rizogênese adventícia em plantas lenhosas, podendo ser utilizados como ferramentas no desenho de estratégias visando melhorar o enraizamento em genótipos recalcitrantes de valor para a indústria. / Eucalyptus is one of the most planted tree species in the world today, mainly due to its use as raw material for paper, cellulose and wood industries. Eucalyptus globulus and its hybrids have low lignin contents and are of great interest to industry, as this feature facilitates and reduces costs of the cellulose extraction process. However, this species is recalcitrant to adventitious rooting, making vegetative propagation by cuttings difficult. Aiming at a better understanding of the molecular mechanisms involved in rooting recalcitrance in E. globulus, this study analyzed changes in morphological, anatomical and molecular patterns during adventitious rooting in this species. Exogenous auxin exposure reversed the recalcitrant phenotype in E. globulus, significantly increasing rooting percentage. The vascular cambium was identified as a region of auxin accumulation and also the site from where adventitious roots originated. Gene expression analysis in cambium cells indicated that TOPLESS and IAA12, auxin signaling repressors, and ARR1, involved in cytokinin signaling pathway, appear to act as negative regulators of adventitious rooting. The high expression of those genes in control plants was significantly decreased by exogenous auxin treatment. Comparatively, in an easy-to-root species, E. grandis, the expression of these genes was significantlylower in both treatment conditions, and the concentration of endogenous indole- 3-acetic acid in control plants was higher. Analysis of the protein pattern during rooting in E. globulus plants treated or not with exogenous auxin allowed the identification of proteins involved in diverse biological processes, mainly oxidative stress and energy metabolism. Interesting differences were identified when comparing different rooting conditions or phases. Several proteins were clearly associated with the respective plant phenotype in each situation, particularly considering control plants. These results represent relevant advances in the knowledge about adventitious rooting in woody plants and can be used as tools in the design of strategies aiming at improving adventitious rooting in recalcitrant genotypes of industrial value.

Introdução: O carcinoma espinocelular (CEC) representa 7% de todos os novos casos de câncer no mundo, sendo o carcinoma espinocelular o tipo mais frequente. Tanto o comportamento biológico quanto o crescimento dos tumores devem ser melhores entendidos, uma vez que a sobrevida dos pacientes apresentou discreta melhora nas últimas décadas. Os modelos PDX foram desenvolvidos para estudar a biologia tumoral e principalmente os mecanismos de crescimento e proliferação através da manutenção da arquitetura e microambiente tumoral do tumor original. Os retinóides possuem a capacidade de restaurar o crescimento e a diferenciação de células normais através da ação dos receptores retinóides nucleares (RARs e RXRs) que são os principais mediadores destas ações que ao sofrerem alterações na sua expressão podem levar ao desenvolvimento e manutenção de tumores. No estudo da carcinogênese o modelo PDX é uma importante ferramenta pois mantém a arquitetura e microambiente do tumor original melhorando a compreensão de algumas vias, entre estas o processo de EMT/MET, na diferenciação das células tronco tumorais e quais receptores nucleares podem estar influenciando nestas vias. Objetivos: Analisar os padrões de comportamento biológico - tempo de formação e expansão do tumor e a manutenção dos padrões histológicos e de arquitetura do tumor original - em F0 e F1 no modelo PDX (xenoenxerto derivado de paciente) das amostras de centro de tumor e epitélio adjacente em camundongos Balb C/nude e avaliar a expressão gênica dos receptores retinóides, ALDH1 e marcadores do processo de EMT/MET por RT-PCR em PDX de carcinoma espinocelular oral em comparação com a amostra dos pacientes doadores nas passagens F(0) e F(1). Método: 24 camundongos Balb C/Nude, divididos em 2 grupos TG(I) – tumor graft paciente (I) e TG(II) – tumor graft paciente (II), subdivididos em 4 grupos de 3 animais: (A) – receberam PDX do centro do tumor; (B) – receberam PDX de epitélio adjacente ao tumor (margem de segurança cirúrgica); (C) receberam PDX de um animal do grupo (A); (D) receberam PDX de um animal do grupo (B). E Após estas fases, as amostras coletadas serão avaliadas por RT-PCR para comparação das expressões gênicas entre a amostra original (CT e EA) com os PDX´s nas passagens F(0) e F(1). Resultados: formação de tumores em todos os grupos – tanto do PDX de fragmento de centro do tumor quanto do PDX do epitélio adjacente. E A expressão gênica dos parâmetros observados não diferem no tumor original e passagem F(0) significativamente diferentes em F(1) (p<0,05). Conclusões: A técnida do PDX para o CEC é possível de ser realizada em menor tempo com a implantação de apenas um fragmento do tumor. Os tumores resultantes do PDX apresentaram tamanho suficiente para novas passagens, bem como para seu 6 uso em estudos de comportamento biológico das células neoplásicas. Quanto ao epitélio adjacente ao tumor (margem de segurança cirúrgica) constatou-se a presença de células tumorais com potencial de promover o crescimento de tumores devendo portanto ser melhor observada nas ressecções. O PDX de primeira passagem F(0) é o que mais se assemelha com o tumor original sendo o melhor para testes terapêuticos e estudos da carcinogênese do CEC oral. Keywords: CECP, modelo PDX, xenoenxerto, margem de segurança cirúrgica, , receptores retinóides, microdissecção a laser. / Introduction: Squamous cell carcinoma (SCC) represents 7% of all new cases of cancer in the world, with squamous cell carcinoma being the most frequent type. Both the biological behavior and the growth of the patients should be better understood, since the patients' survival show unobtrusive improvement in the last decades. PDX models were developed to study a tumor biology and especially the mechanisms of growth and proliferation through maintenance of the architecture and tumor microenvironment of the original tumor. Retinoids have a capacity to restore normal cell growth and differentiation through the action of nuclear retinoid receptors (RARs and RXRs) that are the main mediators and maintenance actions of tumors. In the study of carcinogenesis, the PDX model is an important tool because it maintains an architecture and microenvironment of the original tumor, improving an understanding of some pathways, among them in the EMT / MET process, the difference in tumor stem cells and which nuclear receptors may be influencing these routes. Objectives: To analyze changes in methodology and patterns of biological behavior - time of tumor formation and expansion and maintenance of histological and architectural patterns of the original tumor - in F0 and F1 without PDX model (patient derived xenograft) tumor and adjacent epithelium in Balb C / nude mice and to evaluate the gene expression of retinoid receptors, ALDH1 and EMT / MET process markers by RT-PCR in PDX of oral squamous cell carcinoma compared to a sample of donor patients in F ( 0) and F (1). Method: 24 Balb C / Nude mice, divided into 2 groups TG (I) - patient tumor graft (I) and TG (II) - patient tumor graft (II) subdivided into 4 groups of 3 animals: (A) - received PDX from the center of the tumor; (B) - received epithelial PDX adjacent to the tumor (surgical margin of safety); (C) received PDX from one animal of group (A); (D) received PDX from one animal of group (B). E After these phases, as samples collected for RT-PCR evaluation for comparison of gene expressions between an original sample (CT and EA) with F passages of PDX F (0) and F (1). Results: tumor formation in all groups - both the PDX of the tumor center fragment and the PDX of the adjacent epithelium. E The gene expression of the observed parameters did not differ without original tumor and F (0) differential passage in F (1) (p <0.05). Conclusions: The PDX technique for CPB is possible to be performed in a shorter time with a tumor fragment implantation. Tumors resulting from PDX presented the solution for new passages, as well as for their use in studies of the biological behavior of neoplastic cells. As for the epithelium adjacent to the tumor (surgical margin of safety), a presence of tumor cells with the potential to promote the growth of tumors has been observed and should therefore be better observed in the resections. The first pass PDX F (0) is the one that most closely resembles the 8 original tumor being the best for therapeutic tests and studies of oral SCC carcinogenesis.

Introdução: O carcinoma espinocelular (CEC) representa 7% de todos os novos casos de câncer no mundo, sendo o carcinoma espinocelular o tipo mais frequente. Tanto o comportamento biológico quanto o crescimento dos tumores devem ser melhores entendidos, uma vez que a sobrevida dos pacientes apresentou discreta melhora nas últimas décadas. Os modelos PDX foram desenvolvidos para estudar a biologia tumoral e principalmente os mecanismos de crescimento e proliferação através da manutenção da arquitetura e microambiente tumoral do tumor original. Os retinóides possuem a capacidade de restaurar o crescimento e a diferenciação de células normais através da ação dos receptores retinóides nucleares (RARs e RXRs) que são os principais mediadores destas ações que ao sofrerem alterações na sua expressão podem levar ao desenvolvimento e manutenção de tumores. No estudo da carcinogênese o modelo PDX é uma importante ferramenta pois mantém a arquitetura e microambiente do tumor original melhorando a compreensão de algumas vias, entre estas o processo de EMT/MET, na diferenciação das células tronco tumorais e quais receptores nucleares podem estar influenciando nestas vias. Objetivos: Analisar os padrões de comportamento biológico - tempo de formação e expansão do tumor e a manutenção dos padrões histológicos e de arquitetura do tumor original - em F0 e F1 no modelo PDX (xenoenxerto derivado de paciente) das amostras de centro de tumor e epitélio adjacente em camundongos Balb C/nude e avaliar a expressão gênica dos receptores retinóides, ALDH1 e marcadores do processo de EMT/MET por RT-PCR em PDX de carcinoma espinocelular oral em comparação com a amostra dos pacientes doadores nas passagens F(0) e F(1). Método: 24 camundongos Balb C/Nude, divididos em 2 grupos TG(I) – tumor graft paciente (I) e TG(II) – tumor graft paciente (II), subdivididos em 4 grupos de 3 animais: (A) – receberam PDX do centro do tumor; (B) – receberam PDX de epitélio adjacente ao tumor (margem de segurança cirúrgica); (C) receberam PDX de um animal do grupo (A); (D) receberam PDX de um animal do grupo (B). E Após estas fases, as amostras coletadas serão avaliadas por RT-PCR para comparação das expressões gênicas entre a amostra original (CT e EA) com os PDX´s nas passagens F(0) e F(1). Resultados: formação de tumores em todos os grupos – tanto do PDX de fragmento de centro do tumor quanto do PDX do epitélio adjacente. E A expressão gênica dos parâmetros observados não diferem no tumor original e passagem F(0) significativamente diferentes em F(1) (p<0,05). Conclusões: A técnida do PDX para o CEC é possível de ser realizada em menor tempo com a implantação de apenas um fragmento do tumor. Os tumores resultantes do PDX apresentaram tamanho suficiente para novas passagens, bem como para seu 6 uso em estudos de comportamento biológico das células neoplásicas. Quanto ao epitélio adjacente ao tumor (margem de segurança cirúrgica) constatou-se a presença de células tumorais com potencial de promover o crescimento de tumores devendo portanto ser melhor observada nas ressecções. O PDX de primeira passagem F(0) é o que mais se assemelha com o tumor original sendo o melhor para testes terapêuticos e estudos da carcinogênese do CEC oral. Keywords: CECP, modelo PDX, xenoenxerto, margem de segurança cirúrgica, , receptores retinóides, microdissecção a laser. / Introduction: Squamous cell carcinoma (SCC) represents 7% of all new cases of cancer in the world, with squamous cell carcinoma being the most frequent type. Both the biological behavior and the growth of the patients should be better understood, since the patients' survival show unobtrusive improvement in the last decades. PDX models were developed to study a tumor biology and especially the mechanisms of growth and proliferation through maintenance of the architecture and tumor microenvironment of the original tumor. Retinoids have a capacity to restore normal cell growth and differentiation through the action of nuclear retinoid receptors (RARs and RXRs) that are the main mediators and maintenance actions of tumors. In the study of carcinogenesis, the PDX model is an important tool because it maintains an architecture and microenvironment of the original tumor, improving an understanding of some pathways, among them in the EMT / MET process, the difference in tumor stem cells and which nuclear receptors may be influencing these routes. Objectives: To analyze changes in methodology and patterns of biological behavior - time of tumor formation and expansion and maintenance of histological and architectural patterns of the original tumor - in F0 and F1 without PDX model (patient derived xenograft) tumor and adjacent epithelium in Balb C / nude mice and to evaluate the gene expression of retinoid receptors, ALDH1 and EMT / MET process markers by RT-PCR in PDX of oral squamous cell carcinoma compared to a sample of donor patients in F ( 0) and F (1). Method: 24 Balb C / Nude mice, divided into 2 groups TG (I) - patient tumor graft (I) and TG (II) - patient tumor graft (II) subdivided into 4 groups of 3 animals: (A) - received PDX from the center of the tumor; (B) - received epithelial PDX adjacent to the tumor (surgical margin of safety); (C) received PDX from one animal of group (A); (D) received PDX from one animal of group (B). E After these phases, as samples collected for RT-PCR evaluation for comparison of gene expressions between an original sample (CT and EA) with F passages of PDX F (0) and F (1). Results: tumor formation in all groups - both the PDX of the tumor center fragment and the PDX of the adjacent epithelium. E The gene expression of the observed parameters did not differ without original tumor and F (0) differential passage in F (1) (p <0.05). Conclusions: The PDX technique for CPB is possible to be performed in a shorter time with a tumor fragment implantation. Tumors resulting from PDX presented the solution for new passages, as well as for their use in studies of the biological behavior of neoplastic cells. As for the epithelium adjacent to the tumor (surgical margin of safety), a presence of tumor cells with the potential to promote the growth of tumors has been observed and should therefore be better observed in the resections. The first pass PDX F (0) is the one that most closely resembles the 8 original tumor being the best for therapeutic tests and studies of oral SCC carcinogenesis.

O eucalipto é uma das espécies arbóreas mais plantadas no mundo atualmente, principalmente devido ao seu uso como matéria prima para as indústrias de celulose, papel e madeireira. Eucalyptus globulus e seus híbridos possuem baixos teores de lignina e despertam grande interesse da indústria, já que essa característica facilita e diminui o custo do processo de extração da celulose. Entretanto, essa espécie é recalcitrante ao enraizamento adventício, o que dificulta a propagação vegetativa de suas mudas. Com o objetivo de melhor entender os mecanismos moleculares envolvidos na recalcitrância ao enraizamento em E. globulus, o presente estudo envolveu análises de parâmetros morfológicos, anatômicos e moleculares durante a rizogênese adventícia nesta espécie. A exposição à auxina exógena reverteu o fenótipo recalcitrante em E. globulus, aumentando significativamente a porcentagem de enraizamento. O câmbio vascular foi identificado como uma região de acúmulo de auxina e local de origem das raízes adventícias. Através de análises da expressão gênica em células do câmbio, observou-se que TOPLESS e IAA12, repressores da sinalização de auxina, e ARR1, envolvido na rota de sinalização de citocininas, parecem atuar como reguladores negativos do enraizamento adventício. A alta expressão destes genes em plantas controle foi significativamente diminuída com aplicação de auxina exógena. Comparativamente, em espécie de fácil enraizamento, E. grandis, a expressão destes genes se manteve em níveis mais baixos em ambas as condições de tratamento, e a concentração de ácido indol-3-acético endógeno em plantas controle mostrou-se mais elevada. Análises do padrão proteico durante o enraizamento em plantas de E. globulus tratadas ou não com auxina exógena identificaram proteínas envolvidas em diversos processos biológicos, principalmente estresse oxidativo e metabolismo energético. Diferenças interessantes foram identificadas ao comparar as diferentes condições e fases do enraizamento. Várias proteínas foram claramente relacionadas com o respectivo fenótipo apresentado pela planta em cada situação, principalmente considerando plantas controle. Os resultados aqui apresentados representam avanços relevantes no conhecimento sobre a rizogênese adventícia em plantas lenhosas, podendo ser utilizados como ferramentas no desenho de estratégias visando melhorar o enraizamento em genótipos recalcitrantes de valor para a indústria. / Eucalyptus is one of the most planted tree species in the world today, mainly due to its use as raw material for paper, cellulose and wood industries. Eucalyptus globulus and its hybrids have low lignin contents and are of great interest to industry, as this feature facilitates and reduces costs of the cellulose extraction process. However, this species is recalcitrant to adventitious rooting, making vegetative propagation by cuttings difficult. Aiming at a better understanding of the molecular mechanisms involved in rooting recalcitrance in E. globulus, this study analyzed changes in morphological, anatomical and molecular patterns during adventitious rooting in this species. Exogenous auxin exposure reversed the recalcitrant phenotype in E. globulus, significantly increasing rooting percentage. The vascular cambium was identified as a region of auxin accumulation and also the site from where adventitious roots originated. Gene expression analysis in cambium cells indicated that TOPLESS and IAA12, auxin signaling repressors, and ARR1, involved in cytokinin signaling pathway, appear to act as negative regulators of adventitious rooting. The high expression of those genes in control plants was significantly decreased by exogenous auxin treatment. Comparatively, in an easy-to-root species, E. grandis, the expression of these genes was significantlylower in both treatment conditions, and the concentration of endogenous indole- 3-acetic acid in control plants was higher. Analysis of the protein pattern during rooting in E. globulus plants treated or not with exogenous auxin allowed the identification of proteins involved in diverse biological processes, mainly oxidative stress and energy metabolism. Interesting differences were identified when comparing different rooting conditions or phases. Several proteins were clearly associated with the respective plant phenotype in each situation, particularly considering control plants. These results represent relevant advances in the knowledge about adventitious rooting in woody plants and can be used as tools in the design of strategies aiming at improving adventitious rooting in recalcitrant genotypes of industrial value.

O gênero Passiflora é o maior gênero da família Passifloraceae, que compreende mais de 500 espécies, a maioria originária de regiões neotropicais, sendo centenas distribuídas pela América Latina. Algumas dessas espécies apresentam importância econômica na produção de fruta in natura, suco concentrado, uso ornamental e medicinal com propriedades sedativas. Estudos do desenvolvimento reprodutivo e do fruto de espécies de Passiflora são fundamentais para melhor compreensão de aspectos do desenvolvimento que possam contribuir para a produção agronômica e compreensão da evolução de estruturas florais presentes em espécies desta família. A importância das sementes para a sua propagação, para estudos taxonômicos e a presença do arilo, estrutura de interesse fundamental para a comercialização de frutos e produção de suco em espécies desse gênero, estimulou a elaboração de um estudo comparativo entre duas espécies de interesse comercial, P. edulis e P alata, associando o estudo de características morfoanatômicas e moleculares. O presente projeto teve como objetivo caracterizar o desenvolvimento do embrião zigótico e arilo de Passiflora edulis Sims e Passiflora alata Curtis. Flores foram manualmente polinizadas e amostras coletadas periodicamente após a polinização, visando à obtenção de sementes em diferentes fases do desenvolvimento embrionário e do arilo. Primórdios do arilo são observados em pré-antese, quando o saco embrionário é organizado. Células epidérmicas na base do funículo sofrem divisões periclinais formando uma borda em torno da rafe. O desenvolvimento do primórdio do arilo é interrompido, observando-se a reativação de divisões celulares e o arilo recomeça o desenvolvimento em uma estrutura multicelular ao redor da semente em desenvolvimento. Aos 14 dias após a polinização o arilo já cobre dois terços da semente, crescendo rapidamente até a semente ser recoberta totalmente, desde o funículo, até o polo calazal. O endosperma é nuclear e seu desenvolvimento se inicia logo após a fertilização, através de divisões sucessivas, formando um sincício ao redor do proembrião, simultaneamente à diminuição tamanho do nucelo. A celularização do endosperma, com a deposição de paredes celulares é observada aproximadamente 20 dias após a polinização. A embriogênese se inicia com a primeira divisão do zigoto, observada aos 7 dias após a polinização. Essa primeira divisão é transversal dividindo o zigoto em duas células, assimetricamente. A célula apical sofre sucessivas divisões que levam a estádios subsequentes de desenvolvimento do embrião, tais como, 4-8 células, globular, coração e torpedo. Aproximadamente 30 dias após a polinização o embrião atinge o estádio cotiledonar e a partir de então apenas aumenta em tamanho consumindo o endosperma e ocupando seu espaço na semente. Essas observações permitiram que fossem definidos dois estádios específicos do desenvolvimento do arilo para futura captura por microdissecção a laser. A caracterização anatômica do desenvolvimento do embrião e do arilo em ambas as espécies subsidia o estabelecimento de estádios específicos do desenvolvimento que podem servir como alvos para estudos moleculares nessas espécies de Passiflora / Passiflora is the largest genus in Passifloraceae and most of the commercially used species develop an aril around the seed, which is commercially important for fresh fruit consumption, and concentrate juice. Reproductive developmental studies associating morphoanatomical and molecular characteristics are essential for a better understanding of particularities of this genus. The present project aimed to characterize the development of Passiflora edulis Sims and Passiflora alata Curtis zygotic embryo and aril. Pollination of flowers were done manually, fruits and ovaries were collected at regular intervals after pollination and processed for scanning and light microscopy, for analysis of embryos and aril in different stages of development. Aril primordium is observed in pre-anthesis when the embryo sac is organized. Epidermic cells at the base of the funiculus undergo periclinal divisions forming a rim surrounding the raphe. Aril development is arrested until after fertilization when cell divisions are reactivated and the aril resume development into a multicellular structure surrounding the developing seed from the funicle towards the chalazal end. At approximately 14 days after pollination the aril already covers two thirds of the seed, and grows rapidly until the whole seed is covered. The endosperm is nuclear and starts developing soon after fertilization through successive divisions forming a syncytium mostly at the chalazal region, and around the developing embryo, replacing the nucellus. Cell walls are formed and the endosperm begins cellularization approximately 20 days after pollination. Embryogenesis initiates with the first division of the zygote, approximately 7 days after pollination. This first cell division is transversal and asymmetrical; the apical cell undergoes successive divisions leading to the subsequent stages of embryo development such as 4- and 8-celled, globular, heart-shaped, torpedo. Approximately 30 days after pollination, the embryo reaches the cotyledonary stage and thereafter grows only in size, consuming the endosperm and occupying its space in the seed. The first division of the zygote was observed around seven days after pollination (DAP), with the mature embryo formed approximately 30 DAP. Initial development of the aril primordium is observed at the ovule basal region, before anthesis/pollination. Embryo and aril development occurs simultaneously. These observations allowed for the definition of two specific stages of aril development for laser-capture-microdissection and further molecular analysis aiming at the evaluation of the molecular basis of aril differentiation in Passiflora. The morphoanatomical characterization of embryo and aril development in these species will serve as a source of information for the definition of specific developmental stages, which can be targets for molecular studies in Passiflora

O eucalipto é uma das espécies arbóreas mais plantadas no mundo atualmente, principalmente devido ao seu uso como matéria prima para as indústrias de celulose, papel e madeireira. Eucalyptus globulus e seus híbridos possuem baixos teores de lignina e despertam grande interesse da indústria, já que essa característica facilita e diminui o custo do processo de extração da celulose. Entretanto, essa espécie é recalcitrante ao enraizamento adventício, o que dificulta a propagação vegetativa de suas mudas. Com o objetivo de melhor entender os mecanismos moleculares envolvidos na recalcitrância ao enraizamento em E. globulus, o presente estudo envolveu análises de parâmetros morfológicos, anatômicos e moleculares durante a rizogênese adventícia nesta espécie. A exposição à auxina exógena reverteu o fenótipo recalcitrante em E. globulus, aumentando significativamente a porcentagem de enraizamento. O câmbio vascular foi identificado como uma região de acúmulo de auxina e local de origem das raízes adventícias. Através de análises da expressão gênica em células do câmbio, observou-se que TOPLESS e IAA12, repressores da sinalização de auxina, e ARR1, envolvido na rota de sinalização de citocininas, parecem atuar como reguladores negativos do enraizamento adventício. A alta expressão destes genes em plantas controle foi significativamente diminuída com aplicação de auxina exógena. Comparativamente, em espécie de fácil enraizamento, E. grandis, a expressão destes genes se manteve em níveis mais baixos em ambas as condições de tratamento, e a concentração de ácido indol-3-acético endógeno em plantas controle mostrou-se mais elevada. Análises do padrão proteico durante o enraizamento em plantas de E. globulus tratadas ou não com auxina exógena identificaram proteínas envolvidas em diversos processos biológicos, principalmente estresse oxidativo e metabolismo energético. Diferenças interessantes foram identificadas ao comparar as diferentes condições e fases do enraizamento. Várias proteínas foram claramente relacionadas com o respectivo fenótipo apresentado pela planta em cada situação, principalmente considerando plantas controle. Os resultados aqui apresentados representam avanços relevantes no conhecimento sobre a rizogênese adventícia em plantas lenhosas, podendo ser utilizados como ferramentas no desenho de estratégias visando melhorar o enraizamento em genótipos recalcitrantes de valor para a indústria. / Eucalyptus is one of the most planted tree species in the world today, mainly due to its use as raw material for paper, cellulose and wood industries. Eucalyptus globulus and its hybrids have low lignin contents and are of great interest to industry, as this feature facilitates and reduces costs of the cellulose extraction process. However, this species is recalcitrant to adventitious rooting, making vegetative propagation by cuttings difficult. Aiming at a better understanding of the molecular mechanisms involved in rooting recalcitrance in E. globulus, this study analyzed changes in morphological, anatomical and molecular patterns during adventitious rooting in this species. Exogenous auxin exposure reversed the recalcitrant phenotype in E. globulus, significantly increasing rooting percentage. The vascular cambium was identified as a region of auxin accumulation and also the site from where adventitious roots originated. Gene expression analysis in cambium cells indicated that TOPLESS and IAA12, auxin signaling repressors, and ARR1, involved in cytokinin signaling pathway, appear to act as negative regulators of adventitious rooting. The high expression of those genes in control plants was significantly decreased by exogenous auxin treatment. Comparatively, in an easy-to-root species, E. grandis, the expression of these genes was significantlylower in both treatment conditions, and the concentration of endogenous indole- 3-acetic acid in control plants was higher. Analysis of the protein pattern during rooting in E. globulus plants treated or not with exogenous auxin allowed the identification of proteins involved in diverse biological processes, mainly oxidative stress and energy metabolism. Interesting differences were identified when comparing different rooting conditions or phases. Several proteins were clearly associated with the respective plant phenotype in each situation, particularly considering control plants. These results represent relevant advances in the knowledge about adventitious rooting in woody plants and can be used as tools in the design of strategies aiming at improving adventitious rooting in recalcitrant genotypes of industrial value.

Atualmente observa-se que a proporção de pessoas com 60 anos ou mais está crescendo mais rápido do que a de outras faixas etárias. Um dos resultados desta transição epidemiológica é o aumento das doenças cujo fator de risco é o envelhecimento, entre elas, a doença de Parkinson. Embora muitas regiões exibam os sinais neuropatológicos da doença de Parkinson, a degeneração dos neurônios, contendo neuromelanina, da substância negra é considerada como sendo uma característica importante, representando o critério cardinal para o diagnóstico. No entanto, ainda não está claro por que certas regiões do cérebro, como a substância negra, são vulneráveis em algumas doenças neurodegenerativas e alguns neurônios vizinhos, às vezes morfologicamente indistinguíveis, permanecem preservados. Análises moleculares de populações de neurônios podem conduzir a uma melhor compreensão sobre a fisiologia dos mesmos, bem como os mecanismos envolvidos nos processos de doença. Na era pós genômica, realizar análises proteômicas são de grande interesse científico, pois permitem avanços no conhecimento dos processos biológicos. A técnica de microdissecção e captura a laser tem sido uma ferramenta importante e cada vez mais utilizada para aquisição de populações puras de células a partir de secções histológicas, evitando que áreas não pertencentes ao tecido alvo sejam dissecadas. A união destes métodos pode contribuir de maneira relevante para o entendimento fisiopatológico dos neurônios contendo neuromelanina da substância negra. No entanto, para que a microdissecção e captura a laser e as análises proteômicas sejam eficazes, é imprescindível a aplicação de um protocolo bem estruturado. Dentro desse contexto, o presente trabalho tem como objetivo criar um protocolo de microdissecção a laser de neurônios contendo neuromelanina em indivíduos cognitivamente normais, para subsequente análise proteômica. Os casos utilizados neste estudo são provenientes do Banco de Encéfalos Humanos do Grupo de Estudos em Envelhecimento Cerebral. Para o desenvolvimento da nossa proposta, contamos com a colaboração do Centro de Proteômica Médica da Universidade de Bochum, Alemanha. O protocolo foi desenvolvido baseado em outros previamente descritos na literatura e otimizado de acordo com objetivos pretendidos. Analisamos o plano anatômico de amostragem do tecido, o método de congelamento, a espessura do corte para a microdissecção, a solução utilizada para a coleta do tecido durante a microdissecção e o método de digestão proteolítica para posteriores análises proteômicas. Através de ensaios comparativos, alcançamos os resultados desejados e os mesmos foram validados através de análises por espectrometria de massas. Consequentemente, também fomos capazes de reconhecer fatores técnicos que possivelmente impossibilitariam um efetivo estudo do proteoma / Currently the worldwide proportion of people aged 60 years and over is growing faster than any other age group. This strikingly epidemiological transition results in an increase of aging related diseases, including Parkinson\'s disease (PD). Although many brain areas exhibit the neuropathological signs of Parkinson\'s disease, the degeneration of neuromelanin containing cells in the substantia nigra is considered a hallmark feature, representing cardinal diagnostic criteria for PD. However, why certain brain regions -- such as the substantia nigra -- are vulnerable in some neurodegenerative diseases, while some neighboring morphologically indistinguishable neurons remain preserved, is still unclear. Molecular analysis of specific neuronal populations can lead us to a better understanding about the physiological role played by these neurons and mechanisms involved in disease\'s processes. In a post-genomic era, proteomic analyses are of great scientific interest since they allow a better understanding of the biological processes. The laser capture microdissection technique has also became an important tool in biological research, being increasingly used for acquisition of pure populations of cells from histological sections, preventing the dissection of areas outside the target tissue. The combination of these methods can significantly contribute to understand the pathophysiological role of the containing neuromelanin neurons of the substantia nigra. However, for an effective application of both techniques, laser capture microdissection and proteomic analysis, it is essential the application of an efficient protocol. In this context, this study aims to establish a protocol for laser microdissection of containing neuromelanin neurons in cognitively normal individuals for subsequent proteomic analyses. We selected cases from the Brain Bank of the Brazilian Aging Brain Study. A collaboration with the Medical Proteome Center, University of Bochum, Germany took part during the development of our proposal. Our protocol was developed based on previous published protocols and optimized according the intended aims. We analyzed anatomical planes for neuronal collection, freezing methods, thickness of tissue for microdissection sections, solution for tissue collection during laser microdissection and the proteolytic digestion methods. Through our comparative tests, we have achieved the desired results and validated them by mass spectrometry analyses. Consequently, we were also able to exclude technical factors that could possibly preclude one effective proteome analysis

Orientadores: Luciana Bolsoni Lourenço, Carmen Silvia Busin / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-23T12:08:20Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Gatto_KalebPretto_M.pdf: 33988822 bytes, checksum: 7e3f3565dac9a540ea7c353f51068d4f (MD5) Previous issue date: 2013 / Resumo: O resumo poderá ser visualizado no texto completo da tese digital / Abstract: The abstract is available with the full electronic document / Mestrado / Biologia Celular / Mestre em Biologia Celular e Estrutural

The human skin provides us with an excellent protective barrier and possesses a remarkable ability of constant renewal. Basal cell carcinoma is the most common type of skin cancer. The aim of this project was to verify results from an earlier study investigating the molecular differences between basal cell carcinoma (BCC) and basal cells of normal human epidermis. In that study microdissection of cell populations from BCC and basal cells of normal epidermis respectively was performed in five cases of confirmed BCC. Following RNA extraction and amplification, a gene expression analysis was performed using a 46 k human cDNA microarray. Comparison of expression profiles showed a differential expression of approximately 300 genes in BCC. An upregulation of signaling pathways previously known to be of importance in BCC development could be observed, as well as a downregulation of differentiation markers, MHC class II molecules, and proteins active in scavenging of oxygen radicals. We wanted to confirm these findings for a number of selected genes, using real time PCR. The focal point of this project was microdissection of cells from BCC and subsequent isolation of RNA. Microdissection based methods offer a possibility of selecting well defined cell populations for further analysis by using a focused laser beam. Initially tests in order to optimize the method were also performed, concerning the dehydration process and choice of slides used in microdissection. Isolation of RNA may, as we experienced, be associated with problems due to destruction of RNA by degrading enzymes.