Thèse de doctorat : sciences. Mécanique : Ecully, Ecole centrale de Lyon : 2004. / 152 réf.

Thèse de doctorat : sciences. Mécanique : Ecully, Ecole centrale de Lyon : 2004. / Titre provenant de l'écran-titre. 152 réf.

Reproduction de : Thèse de doctorat : Physique : Lyon 1 : 2005. / Titre provenant de l'écran titre. 182 réf. bibliogr.

La nucléation est l’étape est à l’origine de la cristallisation et c’est généralement elle qui va dicter les propriétés finales d’un cristal. Il est alors intéressant de comprendre les mécanismes qui gouvernent cette étape. Deux théories se confrontent aujourd’hui avec d’une part la théorie classique de la nucléation et d’autre part un modèle de nucléation en deux étapes. La théorie classique considère l’addition des monomères un par un pour former des clusters directement cristallins. Le modèle en deux étapes considère une première étape de concentration, au cours de laquelle les monomères vont former des agrégats denses, mais désordonnés, et une seconde étape de structuration qui permettra de réarranger les molécules au sein d’un cluster, pour obtenir une structure cristalline. Il semblerait que, dans le cas des protéines, le passage du mécanisme classique à celui en deux étapes se fasse par une augmentation des fluctuations de concentration en solution, ce qui se fait en se rapprochant de la spinodale de décomposition présente dans le diagramme de phase de certaines protéines. Ainsi, dans cette étude, nous développons des systèmes microfluidiques qui permettent d’étudier ces différents mécanismes. Dans un premier temps, nous avons conçus un dispositif utilisé pour déterminer des cinétiques de nucléation à l’aide de modèles probabilistes. Ensuite, nous avons adapté des systèmes microfluidiques à des grands équipements synchrotron, ce qui donne la possibilité de réaliser de la diffusion de rayons X aux petits angles. Ces deux approches complémentaires permettent alors d’obtenir des informations à l’échelle macroscopique et à l’échelle microscopique, et ainsi de participer à l’éclaircissement des zones d’ombre qui demeurent autour des mécanismes de nucléation. / Nucleation is the first step of crystallization and is the step that will give the final properties of crystals. It is therefore interesting to understand the mechanisms of this step. Nowadays, two theories exist : the classical nucleation theory and the two step theory. In the classical nucleation theory, monomers are added one by one to directly form crystalline clusters. In the two step theory, there is a first step of densification, in which monomers form dense amorphous aggregates and a second step of structuration in which aggregates arrange themselves to form crystalline clusters. It seems that for proteins, the two step mechanism is obtained by an increase of concentration fluctuations in solution, that happens when experimental conditions get closer to spinodal decomposition. In this study, experimental microfluidic devices are developped to study these mechanisms. Firstly, we developped microfluidic devices to determine nucleation kinetics with probabilistic models. Then, we coupled microfluidic devices with small angle X rays scattering from synchrotron sources. These two complementary studies give information on nucleation mechanisms on the macroscopic and microscopic scales.

Cette thèse porte sur le développement d’une plateforme microfluidique polyvalente pour la cristallisation des protéines alliant études statistiques, économie de matière, rapidité d’exécution et facilité d’utilisation. L’objectif est de développer un outil unique pour répondre aux différentes problématiques de la cristallisation des protéines : identification d’une condition de cristallisation robuste via le criblage et l’optimisation et co-cristallisation d’une protéine et de ligands pour le structure-based drug design. Une méthode microfluidique versatile à base de gouttes sans tensioactif est utilisée. Elle permet la génération de centaines voire milliers de gouttes de quelques nL dans lesquelles la cristallisation peut avoir lieu indépendamment. La composition des gouttes est contrôlée par les débits des différentes solutions et vérifiée en ligne par spectrométrie UV-vis. De nombreuses conditions de cristallisation différentes peuvent ainsi être testées rapidement : nature et concentration de(s) agent(s) de cristallisation, ajout d’un ligand... Les cristaux obtenus à l’aide de cette plateforme sont caractérisés in situ et ex situ par DRX.Cette plateforme est appliquée à la cristallisation de deux protéines, une protéine modèle, le lysozyme, et une protéine d’intérêt pharmaceutique, la quinone réductase 2. Ainsi, nous avons développé un outil adapté aux contraintes de l’industrie pharmaceutique pouvant être transféré dans un laboratoire de recherche pour une utilisation de routine par des non-spécialistes de la microfluidique. La plateforme permet une approche de criblage à haut débit (HTS) et tend vers l’automatisation à la fois du criblage et de la DRX. / The aim of this work is the development of a versatile microfluidique platform for protein crystallization, combining statistical studies, material saving, speed of execution and ease of use. The aim is to develop a unique tool to address the different issues of proteins crystallization: identification of a robust crystallization condition via screening and optimization, and co-crystallization of a protein with ligands for structure-based drug design. For this purpose, a versatile droplet-based microfluidic method without adding any surfactant is used. It allows the generation of hundreds or even thousands of droplets of a few nanoliters in which the crystallization takes place independently. Droplets composition is controlled by the flow rates of the different solutions using programmable syringe pumps and checked on-line by UV-visible spectroscopy. Many different crystallization conditions can thus be tested quickly: nature and concentration of crystallization agent(s), addition of a ligand, etc. In addition, the crystals obtained using this microfluidic platform are characterized in situ and ex situ by X-ray diffraction.The platform is applied to the crystallization of two proteins, first a model protein, lysozyme, and then a protein of pharmaceutical interest, quinone reductase 2. Thus we have developed a tool suitable to constraints of pharmaceutical industry, in order to be transferred to research laboratories for routine use by non-specialists of microfluidics. This platform permits a high throughput screening approach, or HTS, and tends to the automation of both screening and X-ray diffraction.

Les anticorps sont des protéines en forme de Y, trouvées comme composant du sérum circulant, qui aident le système immunitaire à cibler et à répondre aux agents pathogènes et aux molécules étrangères, mais peuvent aussi contribuer à la maladie en réagissant aux protéines constitutives. Les anticorps sont produits par des Plasmocytes, qui les sécrètent dans la circulation. Parce qu'il n'y a pas de lien physique entre les plasmocytes et leurs anticorps sécrétés, la détection d'anticorps spécifiques d’un antigène est problématique. Dans cette thèse, j'explore l'utilisation de la microfluidique en gouttelettes pour générer et manipuler des compartiments aqueux homogènes dans lesquels des cellules sécrétant anticorps peuvent être isolées et analysées à haut débit a'échelle d'une seule cellule. Pour caractériser les cellules sécrétant des anticorps à l'intérieur des gouttelettes, j'utilise un nouveau test qui permet d'interroger les cellules en fonction de la spécificité de leur sécrétion. Ces compartiments de gouttelettes peuvent être triés pour le séquençage d'anticorps, ou analysés au cours du temps pour obtenir des informations cinétiques de l'interaction anticorps-antigène à l'intérieur de chaque gouttelette. En utilisant une nouvelle technologie, j'ai pu obtenir le répertoire d'anticorps de souris immunisées contre deux antigènes différents à partir de cellules sécrétant des anticorps spécifiques d’un antigène, avec des capacités égales ou supérieures aux technologies disponibles actuelles. Aussi, j'ai pu suivre le processus de maturation d'affinité des anticorps à l'échelle de la cellule unique, à la fois dans l'immunisation et la maladie auto-immune. Avec ces outils, je démontre comment la microfluidique peut être utilisée pour caractériser les réponses immunitaires et auto-immunes à travers l'évaluation de cellules sécrétant des anticorps. / Antibodies are Y shaped proteins, found as a component of circulating serum, that help the immune system target and respond to pathogens and foreign molecules, but can also contribute to disease when reacting to constitutive self-proteins. Antibodies are produced Plasma Cells, which secrete them into circulation. Because there’s no physical link between Plasma Cells and their secreted antibodies, the detection of antigen-specific antibodies is problematic. In this thesis I explore the use of droplet microfluidics to generate and manipulate homogeneous aqueous compartments in which single antibody secreting cells can be isolated and analyzed in a high-throughput manner. To characterize single antibody secreting cells inside the droplets I use a novel assay that allows to interrogate cells based on the specificity of their secretion. These droplet compartments can be sorted for single cell antibody sequencing, or analyzed over time to obtain kinetic information of the antibody-antigen interaction inside each droplet. Using new established technology I was able to obtain the antibody repertoire of mice immunized against two different antigens from single antigen-specific antibody secreting cells, with equal or better capacities than current available technologies. Also, I was able to follow the affinity maturation process of antibodies at the single-cell level, both in immunization and autoimmune disease. With these tools I demonstrate how microfluidics can be used to characterize the immune and the autoimmune responses through the evaluation of single antibody secreting cells.

Au cours des dernières décennies, l'étude des puces microfluidiques capables d'exécuter des processus chimiques et biologiques sur quelques centimètres carrés a été un domaine de recherche actif. De telles plateformes offrent un environnement fermé et contrôlable qui permet une mesure reproductible et évite toute contamination externe. Cependant, ces environnements sont fermés, ce qui empêche l'utilisation de sondes de mesure ou d'effecteurs fixés à l'extérieur de la puce microfluidique. Pour répondre à ce besoin, nous proposons d'utiliser des microrobots rotatifs hélicoïdaux évoluant dans un fluide. Les microrobots proposés sont conçus grâce à la lithographie 3D par laser. Ils présentent une forme hélicoïdale de 5.5 µm de diamètre et environ 50 µm de longueur. Une couche mince ferromagnétique déposée sur ces microrobots permet de les propulser et de les contrôler grâce à un champ magnétique tournant homogène.Le premier défi est l'intégration stable de microrobots à l'intérieur d'un environnement microfluidique. Dans cette thèse, nous avons donc d'abord prouvé que ces microrobots peuvent utiliser leur propre mobilité pour s'intégrer individuellement à l'intérieur d'une puce microfluidique en utilisant un microcanal relié à un réservoir ouvert. Pour cela, nous avons développé un mouvement 3D où le microrobot évolue dans le fluide et deux mouvements 2D où il évolue sur une surface. En passant facilement d'un mouvement à l'autre, les microrobots peuvent utiliser les différents avantages de chaque mouvement pour obtenir une mobilité suffisante à cette intégration. Nous avons nommé ce modèle de microrobot "Roll-to-Swimm"(RTS).Ensuite, pour utiliser un microrobot comme capteur de force sur puce microfluidique, il est nécessaire de caractériser la force générée par l'hélice de chaque RTS. Une méthode de caractérisation est proposée, dans laquelle les différents paramètres d'environnement tels que le flux parasite, le gradient de température et l'impact des surfaces, sont contrôlées avec précision grâce à l'environnement microfluidique. Nous en concluons que le modèle de microrobot "RTS" peut appliquer une force de 10 à 45 piconewton avec une erreur maximale de 38 %. La composante principale de cette erreur (73 %) est due à l'évolution de l'aimantation du RTS. Par conséquent, les efforts visant à réduire cette erreur doivent d'abord se concentrer sur la propriété de magnétisation du RTS. Cette erreur peut également être temporairement réduite en caractérisant la RTS juste avant son utilisation dans une expérience.Enfin, nous présentons trois preuves de concept pour démontrer que notre méthode de caractérisation rapproche les microrobots hélicoïdaux des applications potentielles. Tout d'abord, nous mesurons la diminution de la force du RTS lorsqu'il pousse une microbille. Cette mesure est essentielle pour connaitre la force appliquée par le RTS sur un objet ou pour mesurer l'état de surface en utilisant des billes comme interface. Une microbille de 10 µm de diamètre à la pointe du RTS réduit la propulsion de 6 %. Deuxièmement, nous utilisons la caractérisation du RTS pour mesurer la vitesse locale de l'écoulement dans un canal. Puis nous proposons d'utiliser cette mesure de vitesse pour le contrôle du microrobot grâce à un contrôle automatique du RTS qui adapte le type de mouvement en fonction de la vitesse de l'écoulement. Ce contrôle a été testé expérimentalement avec différentes conditions d'écoulement. Troisièmement, nous utilisons la caractérisation du RTS pour effectuer des simulations numériques afin de trouver une stratégie de contrôle dans des microcanaux de taille inférieure à 20 fois le diamètre du RTS. Le modèle de cette simulation a été validé en comparant ces résultats avec des données expérimentales. Finalement, nous proposons un système de contrôle permettant de maintenir le RTS centré à l'intérieur de microcanaux courbes évoluant en 3D, en utilisant seulement une acquisition d'image en 2D. / Microfluidic chips that could perform chemical and biological processes on a few centimeter square footprint have been an active area of research in the past decades. Among other advantages, this platform offers a closed and controllable environment that allows reproducible measurements and avoids external contamination. However, such closed environments prevent the use of tethered probes to measure or apply a specific force on an element inside the microfluidic chip. Therefore we propose to use a helical rotating microrobot inside a microfluidic chip to answer this need. The proposed microrobots are designed with 3D laser lithography, and have a helical shape of 5.5 µm in diameter and around 50 µm length. A thin ferromagnetic layer is deposited on these microrobots which allows us to propel and control them with a homogenous external rotating magnetic field.The first challenge is the stable integration of these microrobots inside microfluidic environments. Therefore, in this thesis we first proved that these microrobots can use their own mobility to integrate themselves selectively (one by one) inside a microfluidic chip through a microchannel connected to an open reservoir. For this, we have developed a 3D motion where the microrobot evolves in the fluid and two different 2D motions where it evolves on a surface. By switching easily from one motion to another, the microrobots can use the different advantages of each motion to get sufficient mobility required for this integration. We named our microrobot design Roll-To-Swimm (RTS) in reference to this characteristic.Then in order to use a microrobot as on-chip force sensor, a precise characterization of the force generated by the helical shape is necessary for each RTS. A characterization method is proposed, where the different environment parameters (parasite flow, temperature gradient and impact of near surfaces on the flow) are controlled precisely thanks to the microfluidic environment. The characterization shows that the force range of the RTS is between 10 and 45 piconewton with a maximum error of 38 %. We also conclude that the main component of this error (73 %) is due to the evolution of the RTS magnetization. Therefore the efforts to reduce this error should first focus on the magnetization property of the RTS. This error can also be temporarily reduced by characterizing the RTS just before its use in another experiment.Finally, we present three different proofs of concept to demonstrate that our characterization method brings helical microrobots closer to potential on-chip force sensing applications. Firstly, we show that it is possible to measure the diminution of the RTS force when it is pushing a micro spherical bead. This is essential toward applying force on an object with this RTS or to use beads as an interface between the RTS and the surface to measure friction forces. A microbead with 10 µm in diameter at the tip of the RTS reduces it propulsion of 6 %.Secondly, we use the RTS characterization to measure local flow speed. We demonstrate this feature by measuring flow profiles in fluid channels. We show the potential use for of microrobot control by proposing an automatic control of the RTS that adapts the motion to the measured flow. This control has been tested experimentally with different flow conditions. Thirdly, we use the characterization of the RTS to perform numerical simulations in order to find a control strategy in small microchannels. Indeed we demonstrate that for microchannels below 20 times the RTS diameter, the channel walls have an impact on the RTS motions. The model of this simulation has been validated by comparing this result with experimental data. Finally we propose a control scheme for maintaining the RTS centered in a curved microchannel by only using a 2D image feedback.

Un des plus importants objectifs de la microfluidique est le développement des laboratoires sur puce dont le but est de réaliser des microcanaux capables de contenir et d'automatiser des analyses biologiques et chimiques. Dans cette technologie, les gouttes constituent des microréacteurs mobiles, pouvant encapsuler les réactifs d'une analyse. Le succès des laboratoires sur puce bas'es sur les gouttes dépend du développement de techniques pour les manipuler. L'objectif de cette thèse est le développement d'une technique de manipulation de microgouttes avec un faisceau laser. En particulier, on utilise le chauffage produit par le laser pour modifier les écoulements en altérant localement les propriétés physiques des fluides. Dans le cas d'une goutte isolée, le chauffage induit un gradient de tension interfaciale, ce qui crée des écoulements thermocapillaires à l'intérieur et à l'extérieur de la goutte. Ces écoulements sont `a l'origine d'une force qui repousse la goutte du laser. Dans une première partie, cette thèse montre les mécanismes physiques derrière la création de cette force et l'utilise pour implémenter le tri ou la rétention des gouttes dans un écoulement externe. Dans une deuxième partie, les écoulements thermocapillaires sont modulés temporellement pour induire le mélange du contenu d'une goutte qui est tenue par le forçage laser. Le chauffage laser est finalement utilisé pour déclencher la déstabilisation d'un jet liquide dans une géométrie de ``co-flow''. Dans cette géométrie, un liquide est injecté à l'intérieur d'un liquide externe qui coule parallèlement. Le liquide interne forme un filet qui se case en gouttes de taille variée. Le laser, dont la puissance est modulée de manière sinusoïdale, est utilisé pour modifier la viscosité du liquide interne, ce qui induit une déstabilisation locale de l'écoulement. Ceci permet de contrôler la fréquence de formation des gouttes et en conséquence leur taille en fonction de la fréquence du laser.

Dans ce travail de thèse, nous avons développé deux méthodologies permettant d'acquérir rapidement et facilement des propriétés physico-chimiques, cinétiques et thermodynamiques de fluides complexes. Nous nous sommes focalisés sur le rôle de la concentration sur ces propriétés. Les deux méthodes développées sont basées sur la concentration en continu d'une solution aqueuse par évaporation contrôlée du solvant. Le premier outil est une goutte de quelques microlitres confinée entre deux plaques dont la hauteur est de 100µm. Dans cette géométrie à deux dimensions, l'évaporation est entièrement décrite par un modèle que nous avons développé. L'observation du séchage de la goutte couplée à des mesures locales de concentration par spectroscopie Raman, permet d'accéder quantitativement au diagramme de phase d'une solution de copolymères, et de mesurer l'activité ainsi que d'estimer le coefficient d'interdiffusion de la solution. Le second outil est une puce microfluidique permettant de concentrer des solutions aqueuses grâce à la pervaporation de l'eau à travers une membrane. Cet outil permet avec quelques microgrammes de soluté, de bâtir un gradient de concentration stationnaire le long d'un microcanal. Les techniques de spectroscopie Raman et de diffusion des rayons X aux petits angles permettent à nouveau de mesurer des propriétés physico-chimiques de la solution mais également de mettre en évidence le caractère discontinu du coefficient d'interdiffusion en fonction de la concentration, dépendant des mésophases présentes. / In this work, we developed two methods in order to access rapidly and easily physico-chemical, thermodynamic and kinetic properties of complex fluids. We focused on the role of the concentration on these properties. The two methods that we developed are based on the continuous concentration of an aqueous solution thanks to the evaporation of the solvent. The first tool is a microliter droplet confined between two circular plates with a cell height of about 100 µm. Within this two dimensional cylindrical geometry, the evaporation of the droplet is totally described by a model that we developed. The observation of the droplet evaporation combined to local Raman spectroscopy measurements permits us to build a quantitative phase diagram, to measure the activity of the solution and to estimate its mutual diffusion coefficient. The second tool is a microfluidic chip in which water is removed through a thin membrane. This device permits us to build with a few micrograms of solutes a stationary concentration gradient along a microchannel. Raman confocal spectroscopy and small angle X-ray scattering give access to the quantitative phase diagram and also permit to evidence that the mutual diffusion coefficient is discontinuous at some of the phase boundaries.

Les biopiles enzymatiques sont considérés comme des systèmes potentiellement utilisables pour la production d'énergie renouvelable dans des marchés niches. Une biopile est constituée de deux électrodes associées à des enzymes, catalyseurs biologiques, qui permettent la production d'énergie électrique à partir de réactions chimiques d'oxydoréduction. Ce travail présente la réalisation d'une biopile alcool/oxygène, au sein de laquelle l'alcool est oxydé à l'anode par l'alcool déshydrogénase alors que l'oxygène moléculaire est réduit en eau à la cathode par l'enzyme laccase, en présence de médiateurs spécifiques. L'objectif de ce travail a été tout d'abord de développer des bioélectrodes avec des enzymes immobilisées de manière à minimiser la quantité de biocatalyseur et augmenter sa stabilité. Dans un second temps, l'assemblage de biocathodes et de bioanodes a permis de fabriquer des biopiles à alcool macroscopique et microfluidique. Différentes poudres de carbone combinées à des polymères ont été utilisées pour immobiliser les enzymes et les médiateurs par encapsulation selon diverses configurations. Des analyses électrochimiques ont permis de mettre en évidence l'influence importante de certains paramètres comme la nature du carbone et du polymère, le pH et la température sur les performances des bioélectrodes. Une fois assemblées dans les configurations classique ou microfluidique, ces bioélectrodes ont conduit à des systèmes électrochimiques de génération d'énergie délivrant une densité de puissance maximale de 300μW/cm2 à 0,61V pour la biopile macroscopique et de 45μW/cm2 à 0,5V pour le système microfluidique. / Enzymatic biofuel cells (BFC) are systems of great interest for the production of renewable energy in niche markets. A BFC consists of two electrodes associated with enzymes as catalysts allowing energy production from oxydoreduction reactions. This work is devoted to the development of an alcohol/oxygen BFC for which alcohol is oxidized at the anode by alcohol dehydrogenase while molecular oxygen is reduced to water at the cathode by laccase, in the presence of specific mediators. The objective of this work was first to develop bioelectrodes with immobilized enzymes in order to minimize the amount of biocatalyst and increase its stability. In a second step, biocathodes and bioanodes were assembled to make macroscopic and microfluidic alcohol BFCs. Various carbon powders combined to polymers were used to immobilize enzymes and mediators in various configurations by entrapment. Electrochemical analysis have highlighted the significant influence of certain parameters like the nature of polymer and carbon, the pH or the temperature on the bioelectrodes performances. Once assembled in classical or microfluidic configurations, these bioelectrode led to electrochemical energy generation systems delivering a maximum power density of 300μW/cm2 at 0,61V for the macroscopic BFC and 45μW/cm2 at 0,5V for the microfluidic system.