Dans les cellules, les microtubules interviennent dans de nombreux événements comme le maintien de l'architecture, la division du matériel génétique, la migration cellulaire ou encore le transport de vésicules et d'organites. Les modifications post-traductionnelles du le C-terminus de la tubuline, bloc de base des microtubules, apparaissent comme très impliquées dans la régulation de ces fonctions car elles régulent le recrutement de leurs nombreux partenaires protéiques. Durant ma thèse, je me suis particulièrement intéressée à une de ces modifications post traductionnelles : le cycle de détyrosination/tyrosination du C-terminus de l'α-tubuline. Ce cycle implique deux enzymes la Tubuline CarboxyPeptidase (TCP), qui clive la tyrosine à l'extrémité de l'α-tubuline, et la Tubuline Tyrosine Ligase (TTL) qui ré-additionne une tyrosine à la tubuline détyrosinée. Des études menées sur ce cycle et notamment la découverte de la TTL ont permis de montrer que la présence d'une tyrosine à l'extrémité C-terminale de l'α-tubuline est indispensable au développement neuronal et que son absence favorise la progression tumorale. La TCP quant à elle est encore inconnue et sa découverte apparaît essentielle afin de pouvoir appréhender le cycle de détyrosination/tyrosination dans sa globalité. Avec pour fil rouge l'identification de la TCP, mon travail s'est déroulé en trois temps. Je me suis tout d'abord intéressée à la protéine EB1. Cette protéine se lie à l'extrémité positive des microtubules où elle recrute de nombreux partenaires microtubulaires. EB1, présente le même C-terminus que l'α-tubuline et notamment une tyrosine terminale indispensable à la liaison des protéines à CAP-Gly. Dans des cellules et des tissus sains j'ai montré qu'EB1 n'existe pas sous forme détyrosinée ce qui souligne la spécificité de la TCP pour l'α-tubuline. Dans un second temps, j'ai participé à l'étude d'une famille de carboxypeptidases cytosoliques impliquées dans la neurodégénérescence, les CCPs, parmi lesquelles nous pensions trouver la TCP. Nous avons montré que quatre de ces enzymes (CCP1, 4, 5, et 6) retirent les glutamates présents de manière latérale au C-terminus de la tubuline. Les CCP1, 4 et 6 peuvent également cliver le dernier glutamate de la tubuline détyrosiné générant de l'α-tubuline où les deux derniers acides aminés ont été clivés (tubuline-Δ2). Aucune de ces carboxypeptidases ne se révélant être la TCP, j'ai mis en place une méthode biochimique dans le but de purifier cette enzyme. Après plusieurs étapes de purification à partir de cerveaux de souris, des préparations enrichies en activité carboxypeptidase ont été obtenues. Les analyses spectrométriques et bioinformatiques de ces préparations ont permis d'isoler des candidats TCP actuellement testés pour leur potentielle activité de détyrosination du C-terminus de l'α-tubuline. Si la TCP n'est pas présente parmi eux, les outils développés lors de cette étude devraient permettre une très prochaine identification de cette enzyme essentielle. / Microtubules control many aspects of cellular function. Those polymers of tubulin are involved in numerous events ranging from the maintenance of cell architecture to cell division and migration through the transport of vesicles and organelles. The post-translational modifications of the C-terminus of tubulin appear to be involved in the regulation of microtubule functions by recruiting different effectors at the growing end of microtubules. During my PhD, I focused on one of these post-translational modifications: the detyrosination/tyrosination cycle of the C-terminal α-tubulin. This cycle involves the enzymatic removal of the C-terminal tyrosine of α-tubulin by an uncharacterized tubulin carboxypeptidase (TCP) and the re-addition of a tyrosine residue by the Tubulin-Tyrosine-Ligase (TTL) isolated in 1975. On one hand, tubulin tyrosination is important in neuronal organization whereas TTL suppression in human cancers is associated with tumor aggressiveness. Those defects are in part due to the failure of microtubule partners to bind detyrosinated microtubules. My project was divided into three main parts. I have first studied EB1, a microtubule plus end tracking protein which recruits many proteins at the microtubule plus end. This protein ends with the same amino acids as does α-tubulin. As in tubulin, the tyrosine terminal is important for the binding of EB1 partners. I showed that EB1 does not exist under detyrosinated form underlying the TCP specificity. Then, I collaborated to identify the function of a carboxypeptidase family within which we thought we could find the TCP. Four members of this family are deglutamylating enzymes (CCP1, CCP4, CCP5 and CCP5). Three of them (CCP1, CCP4 and CCP6) can cleave the last glutamate of detyrosinated tubulin to generate tubulin without the last two C-terminus amino acids (Δ2-tubulin). However, none of them was identified as the TCP. I consequently developed a biochemical approach to find this enzyme. Extracts enriched in carboxypeptidase activity after purification steps from mice brain were analyzed by mass spec and bioinformatics. Some candidates are currently tested for their potential C-terminus α-tubulin detyrosinating activity. The tools developed here should allow for pending identification of the TCP.

Les cellules végétales sont entourées d’une paroi pecto-cellulosique rigide, soudant les cellules les unes aux autres et empêchant toute migration. Lors de la mitose, le positionnement du plan de division est donc un processus fondamental dans l’organisation des tissus puisque les cellules nouvellement formées restent à leur position initiale après la cytokinèse. Chez les plantes terrestres, le plan de division est déterminé lors de la transition G2/M du cycle cellulaire par l’anneau de préprophase (PPB), une structure transitoire corticale de microtubules. Les mécanismes mis en jeu pour la formation de la PPB sont encore inconnus. L’équipe dans laquelle j’ai effectué ma thèse a identifié un complexe régulateur, le complexe TTP, composé de TON1, de la famille de protéines TON1-Recruiting-Motif (TRMs) et d’une phosphatase de type 2A où FASS est la sous-unité régulatrice. TON1 et FASS sont impliquées dans l’organisation des microtubules corticaux en interphase, et sont indispensables à la formation de la PPB. La famille des protéines TRMs, identifiée récemment, est composée de 34 membres, dont certains sont capables de se lier aux microtubules et de recruter TON1 et FASS au cytosquelette. Les profils d’expression des TRMs et les analyses génétiques préliminaires suggèrent que certaines auraient un rôle en interphase, alors que d’autres pourraient être impliquées dans la formation de la PPB. Mon projet était d’identifier et de caractériser, si elles existent, les TRMs impliquées spécifiquement dans la formation de la PPB. L’analyse des données de transcriptome a révélé qu’un des gènes de la famille TRM, le gène TRM7, présente un pic d’expression en mitose. Nous avons d'abord montré que TRM7 est spécifiquement exprimée dans les tissus en division. L’utilisation d’une fusion génomique TRM7-3xYpet indique d'autre part que la protéine TRM7 n’est exprimée qu’au stade G2/M. Elle est localisée à la PPB et disparaît en début de métaphase, peu après dépolymérisation de la PPB. TRM7 est ainsi le seul marqueur spécifique de la PPB identifié à ce jour chez les plantes, puisque toutes les autres protéines localisées à la PPB marquent également les autres structures mitotiques ou le cytosquelette d’interphase. TRM7 fait partie d’un sous-groupe de trois TRM partageant environ 74% de similarité de séquence. L’analyse phénotypique du mutant trm7, ainsi que celui du triple mutant trm6 trm7 trm8 a montré que ce sous-groupe de protéines joue un rôle majeur dans la formation de la PPB. Près de la moitié des cellules du mutant trm7 présentent un stade préprophase aberrant alors que 100% des cellules du triple mutant au stade G2/M sont affectées, la très grande majorité se divisant sans former de PPB. Étonnamment, la morphologie de ces mutants est peu perturbée et le phénotype n’est en rien comparable au syndrome développemental sévère des mutants ton1 ou fass dépourvus de PPB. De plus, les plans de division ne sont pas aléatoires comme c’est le cas pour les mutants ton1 et fass. Nos résultats permettent donc d'apporter une nouvelle lumière sur le rôle de la PPB dans la détermination du plan de division. Pour la première fois, grâce au triple mutant trm6 trm7 trm8, nous avons réussi à découpler les fonctions interphasiques de la fonction mitotique du complexe TTP, ce qui était jusqu’alors impossible chez les mutants ton1 ou fass où les défauts en interphase et les défauts dus à l’absence de PPB étaient indissociables. Tous les composants du complexe TTP partageant des similarités avec des protéines centrosomales animales faisant partie du même complexe, nous avons exploré dans un projet annexe, la conservation des interactions au sein du complexe animal. Nous avons pu mettre en évidence, grâce au système double-hybride chez la levure, des interactions entre protéines animales et protéines végétales. / Plant cells are embedded within a semi-rigid pecto-cellulosic cell wall that prevents cell migration. As a consequence, three-dimensional cellular organization of tissues mostly results from polarized cell division, since new cells remain in place after mitosis with no possibility for subsequent relocation. In land plants, the division plane is determined pre-mitotically, during the G2 to M phase transition by the preprophase band (PPB), a transient, premitotic microtubule array. The molecular pathways leading to preprophase band formation are still largely unknown. Our team has identified a regulatory complex, the TTP complex, composed of TON1, TRM and a Protein Phosphatase 2A complex with FASS as the regulatory subunit. Both TON1 and FASS have been shown to be involved in cortical microtubules organization during both interphase and PPB formation. The TRM super family is a newly identified protein family composed of 34 members, some of which are microtubule-associated proteins able to recruit TON1 and FASS to the microtubules. Based on TRM expression profiles and preliminary genetic analysis, we hypothesized that some TRMs could have a role in interphase, while others could be involved in PPB formation. My project was to identify and characterize TRMs specifically involved in PPB formation, if any. Transcriptomic analysis using the Genevestigator tool revealed that one TRM gene, TRM7, has a peak of expression at mitosis. TRM7 promoter GUS fusion analysis confirmed that TRM7 is expressed in all dividing tissues and in situ hybridizations of shoot apical meristems revealed a patchy pattern of expression, typical of cell cycle-regulated genes. Remarkably, the genomic TRM7-3xYFP fusion is only expressed at the G2/M transition where it localizes to the PPB, persists beyond PPB degradation until the beginning of metaphase and then disappears. To our knowledge, this makes TRM7 the only PPB-specific marker identified in plants so far, since all other PPB-associated markers label others structures as well, both interphasic or mitotic. TRM7 is part of the TRM6-7-8 sub-family, which share 74% of similarity. Phenotypic analysis of the trm7 and trm6 trm7 trm8 triple mutant revealed a major role of this sub-group in PPB formation. Almost half trm7 cells and all trm6 trm7 trm8 cells displayed an abnormal preprophase stage, the vast majority of the triple mutant cells dividing without PPB. Surprisingly, the triple mutant phenotype is rather mild compare to the severe developmental syndrome of PPB-lacking ton1 or fass plants. Moreover, although often shifted, division plane positioning is far from being fully randomized as in ton1 and fass mutants. Our results show that, for the first time, we have fully uncoupled the mitotic function of the TTP complex from its interphasic function, contrarily to other TTP mutants analyzed so far, where division and interphase defects are indistinguishable. Moreover, these findings question the central role of the PPB in division plane positioning. All TTP components share similarities with animal proteins assembled within a complex at the centrosome. In a side project, we studied the conservation of protein interactions within the animal complex and were able to find cross-interactions between animal and plant proteins in yeast two-hybrid experiments.

Aluminium toxicity is the main factor limiting plant growth on acid soils. Aluminium inhibits root growth within few minutes after aluminium treatment. The mechanism and primary target of his action is still unknown. In this diploma thesis the effect of aluminium toxicity on dynamics of cortical microtubules WT and pldα1 plants was studied using the EB1a-GFP marker. Polymerization rate in both the transition and the elongation zone increased immediately after the aplication of aluminium. Nevertheless, microtubules in the transition zone are much more sensitive to aluminium, because the aluminium-induced increase in the polymerization rate was higher than in the elongation zone. Plants lacking PLDα1 showed higher dynamics on plus ends of cortical microtubules compared to WT during aluminium stress, which enabled them to react faster to stress stimuli. Mutants showed lower sensitivity to aluminium and 100 μM concentration of aluminium ions has beneficial effect on root growth in pldα1. These results suggest that PLDα1 influences microtubule dynamics. Microtubules in pldα1 plants were more dynamic and they polymerized faster in the response to aluminium, which was accompanied by decreased sensitivity to aluminium stress compared to WT. Changes in microtubule dynamics may play a role in aluminium...

Les cellules ciliées sont les cellules sensorielles de la cochlée, l’organe de l’audition, et assurent la transduction des stimulations acoustiques en message nerveux compréhensible par le système nerveux central. Nous avons étudié le rôle du cytosquelette dans le transfert synaptique et dans le cadre d’une neuropathie auditive.La première partie de cette thèse a consisté à déterminer le rôle des filaments d’actine dans l’exocytose des cellules ciliées. Pour ce faire, nous avons infusé des toxines connues pour dépolymériser les filaments d’actine directement dans les cellules ciliées internes. Après 10 minutes d’infusion, nous avons mesuré l’exocytose des cellules ciliées à partir de l’enregistrement de la capacité membranaire, indice de la fusion vésiculaire. Dans nos expériences, la dépolymérisation de l’actine provoquait une augmentation de l’exocytose. De plus nos résultats suggèrent qu’une fraction des vésicules éloignées des canaux calciques se rapproche des sites de libération après dépolymérisation du réseau d’actine. Ces travaux ont donc permis d’identifier une sous-population de vésicules synaptiques dont la disponibilité aux sites de fusion est dépendante des filaments d’actine. La seconde partie de cette thèse porte sur les mécanismes à l’origine d’une neuropathie auditive, la surdité AUNA1. Cette dernière se caractérise par la surexpression cytoplasmique de la protéine Diaph3, dont la fonction est de réguler la nucléation de l'actine et des microtubules. Pour étudier AUNA1, nous avons montré que les souris transgéniques qui surexpriment la protéine Diap3 (protéine murine) développent une surdité progressive, similaire à la neuropathie auditive AUNA1 : soit une élévation des seuils auditifs et des otoémissions normales, témoins de l’activité des cellules ciliées externes (qui ont pour rôle d’amplifier les stimulations sonores). En outre, le potentiel de sommation, qui reflète l’activité in vivo des cellules ciliées internes est altéré chez les souris transgéniques. L’observation des cellules ciliées internes en microscopie électronique à balayage montre un gonflement de la plaque cuticulaire, qui est une plateforme dense en actine servant à ancrer les stétéocils. L’observation en microscopie confocale du réseau de microtubules montre que ce dernier entoure la plaque cuticulaire chez les souris sauvages. A l’inverse, les microtubules envahissent la plaque cuticulaire chez les souris transgéniques. L’ensemble de ces résultats a donc permis de montrer un défaut d’adressage des microtubules à l’origine de la surdité AUNA1. / Inner hair cells transduce sound stimulation into neurotransmitter release onto the afferent auditory nerve fibers. Here, we studied how cytoskeleton modulates the transduction capabilities of the inner hair cells. Exocytosis at the inner hair cell ribbon synapse is achieved through the coupling between calcium channels and glutamate-filled synaptic vesicles. Using membrane capacitance measurements, we probed whether the actin filament network regulates the exocytosis of synaptic vesicles at the auditory hair cell. Our results suggest that actin network disruption increases exocytosis and that actin filaments may spatially organize a sub-fraction of synaptic vesicles with respect to the calcium channel.The auditory neuropathy 1 (AUNA1) is a form of human deafness, which results from a point mutation in the 5’untranslated region of the Diaphanous homolog 3 (DIAPH3) gene. Strikingly, the DIAPH3 mutation leads to the overexpression of the Diaph3 protein, a formin family member involved in the cytoskeleton nucleation and stabilization. Here, we examined in further details the anatomical, functional and molecular mechanisms that account for AUNA1. We found out that the Diap3-overexpressing transgenic mice show a progressive threshold shift associated to a defect in the inner hair cells. While synaptic function was not affected, Diap3-overexpression results into a selective and early-onset alteration of the inner hair cells cuticular plate, a dense plateform anchoring the stereocilia bundle. Molecular dissection of the apical components revealed that the microtubule meshwork undergoes an aberrant targeting into the cuticular plate of the transgenics’ inner hair cells at early onset, leading to the inabilities of these sensory cells to transduce incoming sound stimulation at later stages.

Leishmania est un protozoaire parasite de l’ordre de Kinétoplastida de la famille des Trypanosomatidés, agent pathogène des leishmanioses. Au cours de cette thèse nous nous sommes intéressés à l’apoptose chez L. major. Bien que ce processus soit phénotypiquement identique à l’apoptose des mammifères, les protéines clés et les voies métaboliques impliquées restent largement inconnues. L’autophagie étant paradoxalement étroitement liée à l’apoptose, nous nous sommes également intéressés à ce processus de survie cellulaire. La première partie de ce travail a permis de décrire le phénotype autophagique et de montrer qu’apoptose et autophagie sont deux processus distincts mais également en lien étroit. Dans la deuxième partie, nous nous sommes focalisés sur la métacaspase de L. major LmjMCA. Nous avons observé un rôle de LmjMCA similaire à celui des caspases humaines au cours de l’apoptose, en lien avec son domaine catalytique. Nous avons montré que la surexpression de LmjMCA induit l’entrée en autophagie des cellules. Enfin, la troisième partie de ce travail s’est concentrée sur l’étude du cytosquelette. Nous avons ainsi pu établir un lien entre (dé)glutamylation, apoptose et autophagie. Nous avons mis en évidence que la polyglutamylation du cytosquelette, entraîne l’entrée en apoptose des cellules tandis que la déglutamylation du cytosquelette est associée au processus de survie cellulaire. Ce travail a permis de mieux caractériser les processus d’autophagie et d’apoptose chez Leishmania. Ces résultats permettent d’ouvrir des perspectives dans le développement de nouveaux outils thérapeutiques. / Leishmania is a protozoan parasite of the Kinetoplastida order and the Trypansomatid family and is the causative agent of leishmaniasis. In this thesis we focused on apoptosis in L. major. Although this process is phenotypically similar to mammal apoptosis, key proteins and metabolic pathways involved remain largely unknown. Autophagy being paradoxically closely linked to apoptosis, we were also interested in this cell survival process and its relationship with programmed cell death. The first part of this thesis has described the phenotypical changes during autophagy and shown that apoptosis and autophagy are two separate processes, but there is also a close relationship between these two mechanisms. In the second part of this thesis, we have demonstrated that LmjMCA has a role similar to the one of human caspases during apoptosis, through its catalytic domain. In addition, we have shown that LmjMCA overexpression induces autophagy entry after nutrient deprivation via its C-terminal domain.The third part of this work has focused on the study of the cytoskeleton. We could establish a link between (de)glutamylation, apoptosis and autophagy. Indeed, we have shown that cytoskeleton polyglutamylation induces cell death while cytoskeleton deglutamylation is associated with the cell survival process autophagy. This thesis allowed us to better characterize the autophagy and apoptosis processes in Leishmania and to identify the metacaspase as involved in the corresponding pathways. These results open perspectives in the development of new therapeutic tools.

Les cils et les flagelles sont des organites présents à la surface cellulaire. Ils sont conservés chez les eucaryotes chez lesquels ils jouent un rôle essentiel dans la régulation de nombreux processus physiologiques. La zone de transition (ZT) est une structure complexe, localisée à la base des cils, qui assure une fonction importante dans l'assemblage et la régulation du trafic des constituants ciliaires. Trois complexes protéiques ont été identifiés à la ZT : MKS-JBTS, NPHP1-4-8 et NPHP5-CEP290. D'autres protéines sont également situées à la ZT telles que CBY et AZI1 mais leur interaction avec ces trois modules reste encore peu connue. Chez l'Homme, des mutations de gènes codant des protéines de la ZT sont associées à des maladies génétiques rares, les ciliopathies. Deux modes d'assemblage des cils ont été décrits : la ciliogenèse compartimentée et la ciliogenèse cytosolique. Alors que la fonction de la ZT au cours de la ciliogenèse compartimentée a été bien étudiée, son rôle dans la ciliogenèse cytosolique reste peu connu. La Drosophile possède deux sortes de cellules ciliées, les neurones sensoriels et les flagelles de spermatozoides dont les cils s'assemblent selon ces deux modes d'assemblage. Au cours de ma thèse, j'ai utilisé ce modèle pour analyser la fonction des protéines de la ZT dans ces deux types cellulaires. Mes résultats montrent que les protéines MKS ne jouent pas un rôle essentiel dans l'assemblage de la ZT dans ces deux types cellulaires. J'ai aussi révélé que CBY et AZI1, coopèrent pour assembler la ZT et qu'elle est nécessaire à l'ancrage du corps basal à la membrane plasmique. De plus, mes travaux ont démontré que KLP59D, une kinésine dépolymérisante des microtubules, est indispensable à la régulation de l'élongation de l'axonème au cours de la ciliogenèse cytosolique. En conclusion, ce travail apporte de nouvelles connaissances sur la dynamique d'assemblage de la ZT des cils et sur les mécanismes qui contrôlent l'élongation de l'axonème / Cilia and flagella are cellular organelles that protrude at the cell surface. They are composed of a microtubular cytoskeleton and they are highly conserved across eukaryotic species from plantae to Human. In mammals, they play essential functions during development and regulate numerous physiological processes in adults. At the ciliary base a complex structure called transition zone (TZ) is necessary for cilia assembly and regulation of ciliary components trafficking inside the cilia. Three protein complexes have been identified at the TZ : MKS-JBTS, NPHP1-4-8 and NPHP5-CEP290. Other TZ proteins such as CBY and AZI1 have been studied but their interaction with these 3 modules is not yet elucidated. In Human, mutations of genes encoding TZ proteins are associated with several genetic diseases called ciliopathies. Two different modes of cilia assembly have been identified: compartimentalized and cytosolic ciliogenesis. While TZ function in compartimentalized ciliogenesis is well studied, its role in cytosolic ciliogenesis remains poorly understood. In Drosophila, there are only two types of ciliated cells, sensory neurons and sperm flagella, representative of these two ciliogenesis pathways. During my PhD, I used Drosophila to study the function of TZ proteins during cilia assembly in these two ciliated cell types. My data show that proteins of the MKS complex do not play an essential role in TZ assembly in the cilia of sensory neurons and in spermatozoon flagella. I also demonstrated that CBY and AZI1 cooperate to assemble the TZ components and that the TZ is necessary to dock the basal bodies to the plasma membrane, one of the first important step in cilia assembly. Finally, I showed that KLP59D, a microtubule-depolymerising kinesin, is required to control axoneme elongation during the cytosolic ciliogenesis. In conclusion, this work brings new insights into the understanding of the dynamic assembly of TZ proteins and the mechanisms that regulate flagella elongation

Les microtubules (MTs), qui sont composés de dimères d'α- et de β-tubulines, constituent un des composants du cytosquelette des cellules eucaryotes. De nombreuses protéines interagissent avec les MTs. Ces interactions, qui permettent aux MTs de remplir leurs fonctions, sont contrôlées spatialement et temporellement. Les MTs sont des structures hétérogènes. Cette hétérogénéité est générée d'une part par l'existence de différents isotypes d'α- et de β-tubulines qui peuvent composer un MT et, d'autre part, par des modifications post-traductionnelles (MPTs) portées par chaque isotype d'α- et de β-tubuline. Les nombreuses combinaisons que ces deux éléments génèrent pourraient réguler finement les interactions entre les MTs et leurs protéines associées et ainsi permettre aux MTs de remplir leurs fonctions.La polyglutamylation est une MPT réversible qui consiste à ajouter des chaînes de glutamates au niveau de l'extrémité C-terminale de l'α- et de la β-tubuline. Chez les mammifères, certaines Tubulin Tyrosin Ligase-Like (TTLL) contrôlent l'initiation de la chaîne en ajoutant le premier glutamate alors que d'autres sont responsables de l'élongation de la chaîne. La glutamylation est particulièrement enrichie dans le système nerveux des vertébrés. Cependant, son rôle est mal compris. Mon travail de thèse a permis de confirmer que seule l'α-tubuline est glutamylée dans le système nerveux de drosophile et d'identifier une glutamylase majeure présente dans le système nerveux de drosophile, la protéine dTTLL5. Chez les drosophiles mutantes pour dTTLL5, la glutamylation disparaît dans le système nerveux. Au contraire, lorsque dTTLL5 est surexprimé dans tous les neurones, la glutamylation augmente dans le système nerveux. En absence et en excès de glutamylation, les drosophiles sont viables et ne présentent pas de défaut majeur. J'ai également analysé la morphologie et le fonctionnement de la jonction neuromusculaire (JNM) chez la larve en absence et en excès de glutamylation des MTs. Les JNMs semblent normales et fonctionnelles en absence de glutamylation. De même, peu de défauts sont constatés lorsque les MTs sont davantage glutamylés. En conclusion, mon travail montre que la glutamylation des MTs n'apparaît pas essentielle pour le fonctionnement des motoneurones. Cette MPT est donc probablement impliquée dans des fonctions neuronales plus subtiles qui restent à explorer chez la drosophile. / Microtubules (MTs) are made of α- and β-tubulins dimers and are one of the cytoskeleton components in eukaryotic cells. Many proteins interact with MTs. MTs are able to fulfill their functions because of these interactions, which are spatially and temporally controlled. MTs are heterogeneous structures. This heterogeneity has two sources. Firstly, there exists several isotypes of α- and β-tubulins that can form a MT. Secondly, post-translational modifications (PTMs) are carried by α- and β-tubulins. Using both of these many combinations is possible and this heterogeneity could allow a fine-tuned regulation of MTs interactions with associated proteins in order to make MTs fufil their functions properly. MT polyglutamylation is a reversible PTM which consists of the addition of glutamyl side chains at the C-terminal tail of α- and β-tubulins. In mammals, the enzymes in charge of this PTM are called Tubulin Tyrosin Ligase-Like (TTLL). Some are responsible for the initiation of the side chain and are able to add the first residue, while others are in charge of the elongation of the side chain. MT polyglutamylation is enriched in the nervous system (NS) of vertebrates, however its exact role is not well understood. My work led to confirm that MT glutamylation is only carried by the α-tubulin in the drosophila NS and to identify a major glutamylase present in drosophila NS called dTTLL5. In dTTLL5 mutants, glutamylation marks disappear in the NS while the dTTLL5 over-expression in neurons causes an increase of MT glutamylation in the NS. In cases of lack and excessive glutamylation, drosophila are viable and they do not show any obvious defect. I analyzed the morphology and function of larval neuromuscular junction (NMJ) in cases of lack and excess of MT glutamylation. NMJs seem to be normal and functional without glutamylation. Likewise not much defect are observed in excess of glutamylation in drosophila NS. To conclude, my work shows that MT glutamylation appears not to be essential for the function of motoneurons. This PTM is likely involved in more subtle neuronal functions, which remain to investigate in drosophila.

La nucléoline est une des protéines les plus abondantes des nucléoles. Ses fonctions ne sont cependant pas restreintes à la biogénèse des ribosomes. En absence de nucléoline, un phénotype d’amplification du nombre de centrosomes en mitose, associé à des fuseaux multipolaires a été récemment rapporté. Notre étude vise à comprendre l’implication de la nucléoline dans l’apparition de ce phénotype et notamment ses conséquences sur l’organisation des microtubules.Par immunofluorescence, nous mettons en évidence que la fraction centrosomale de la nucléoline est spécifiquement associée au centriole mature en interphase, alors qu’en mitose seule une forme phosphorylée y est détectée.En interphase, les cellules déplétées en nucleoline présentent une amplification de leurs centrioles immatures, entourés par un réseau anormal de péricentrine, dénotant une perte de structuration de la matrice péricentriolaire. De plus, une désorientation du réseau microtubulaire causée par une capacité de nucléation ralentie et une perte d’ancrage des microtubules au centrosome mature est observée. Par des expériences de co-immunoprécipitation avec la tubuline γ, un lien avec le complexe d’initiation de la nucléation des microtubules est dévoilé.En conclusion, les résultats de ma thèse révèlent que structurellement la nucléoline est associée au centriole mature des cellules en interphase et que fonctionnellement elle stimule la nucléation des microtubules et participe à leur ancrage au centrosome mature pour orienter le réseau microtubulaire en interphase. La nucléoline pourrait ainsi être un des acteurs de la synchronicité entre centrosomes et nucléoles pour la régulation du cycle cellulaire. / Nucleolin is an abundant non-ribosomal protein of the nucleolus. Nevertheless its functions are not restricted to ribosome biogenesis. Without nucleolin, a phenotype of abnormally high centrosome numbers was recently reported in mitosis, associated with multipolar spindle formation. The purpose of our study is to understand nucleolin’s involvement in the appearance of this phenotype and specifically consequences on microtubule network organisation. By immunofluorescence, visual evidences of a centrosomal fraction of nucleolin are provided, specifically associated with the mature centriole of interphase cells. In mitosis, only a phosphorylated form of nucleolin is detected at the spindle poles.In interphase, nucleolin depleted cells exhibit immature centriole amplification surrounded by an abnormal mesh of pericentrine, showing a loss of pericentriolar matrix structuration. Furthermore, in most nucleolin depleted cells, a complete disorganisation of microtubule network is observed, caused by a slower microtubule nucleation capacity and a loss of microtubule anchoring at the mature centriole. Using co-immunoprecipitation with γ-tubulin, a major centrosomal protein, a link with the microtubule nucleation complex was highlighted.Taken together my thesis results reveal that in interphase cells, nucleolin is structurally associated with the mature centriole, and functionally stimulates microtubule nucleation and participates in their anchoring at the mature centrosome to orient microtubule network. Thus, nucleolin could be a major actor in the synchronicity between centrosome and nucleoli for cell cycle regulation.

Les cils/flagelles sont des organites conservés au cours de l’évolution qui peuvent permettre le mouvement de fluide, la locomotion ainsi que la chimiosensation, mécanosensation et la signalisation intracellulaire. Le cil est constitué d’un corps basal (à la base du cil) et d’un axonème émergeant à la surface cellulaire et entouré de membrane. L’axonème est constitué de neuf doublets de microtubules et une paire centrale dans le cas d'un cil motile. Leur dysfonctionnement peut conduire à des syndromes génétiques (ciliopathies) pouvant être fatale. Mon travail de thèse porte sur la caractérisation d’une nouvelle protéine centrosomale baptisé FOR20 (FOP Related protein of 20 kDa). Cette protéine très conservée possède un domaine LisH, permettant l’homodimérisation. FOR20 est retrouvée au centrosome et dans des satellites péricentriolaires. Les satellites sont des structures non membranaires enrichies en PCM1 se déplaçant le long des microtubules grâce à des moteurs, apportant certaines protéines au centrosome. L'utilisation de protéines mutées montre que la partie amino terminale de FOR20, incluant un domaine LisH fonctionnel, est responsable de cette localisation. L’inhibition d’expression de FOR20 dans des cellules ciliées, RPE1, diminue le pourcentage de cellules ciliées ainsi que la taille du cil. La distribution des satellites est perturbée et la protéine PCM1 est déplacée de la fraction insoluble à la fraction soluble en Triton-X100. Nos résultats suggèrent que FOR20 est une protéine impliquée dans la régulation de l’interaction des satellites avec les microtubules et les moteurs ainsi que dans le contrôle du transport d’éléments ciliaires au corps basal. / Cilia and flagella are evolutionary conserved organelles that generate fluid movement and locomotion, and play roles in chemosensation, mechanosensation and intracellular signalling. In complex organisms, cilia are highly diversified, which allows them to perform various functions. However, they retain a 9+0 or 9+2 microtubules structure connected to a basal body. Here, we describe FOR20 (FOP-related protein of 20 kDa), a previously uncharacterized and highly conserved protein that is required for normal formation of a primary cilium. FOR20 is found in PCM1-enriched pericentriolar satellites and centrosomes. FOR20 contains a Lis1-homology domain that promotes self-interaction and is required for its satellite localization. Inhibition of FOR20 expression in RPE1 cells decreases the percentage of ciliated cells and the length of the cilium on ciliated cells. It also modifies satellite distribution, as judged by PCM1 staining, and displaces PCM1 from a detergent-insoluble to a detergent-soluble fraction. The subcellular distribution of satellites is dependent on both microtubule integrity and molecular motor activities. Our results suggest that FOR20 could be involved in regulating the interaction of PCM1 satellites with microtubules and motors. The role of FOR20 in primary cilium formation could therefore be linked to its function in regulating pericentriolar satellites. A role for FOR20 at the basal body itself is also possible.

La migration des cellules est nécessaire au cours du développement. Chez l’adulte, elle contribue au renouvellement des tissus, à la cicatrisation et à la circulation des cellules immunitaires. Les cellules cancéreuses acquièrent des capacités de migration qui échappent aux mécanismes normaux de régulation. Elles peuvent ainsi envahir les tissus environnants et, éventuellement, former des métastases. Les astrocytes représentent une majorité de cellules gliales du système nerveux central. Ils migrent en réponse à des facteurs inflammatoires et interviennent ainsi dans la cicatrisation et la régénération des tissus lésés. Les astrocytes peuvent être à l’origine de tumeurs appelées gliomes qui représentent la majorité des tumeurs cérébrales primaires. Les formes les plus agressives, appelées glioblastomes, sont des tumeurs extrêmement invasives, ce qui les rend particulièrement difficiles à traiter. Les microtubules jouent un role crucial dans la migration des astrocytes et des cellules de gliomes (Etienne-Manneville, 2013a). Au cours de la migration, le réseau de microtubules est totalement réorganisé pour permettre la polarisation de la cellule. Formés par association de dimères de tubuline, leur régulation intervient de multiples manières comme par exemple au niveau de leur dynamique de polymérisation à la périphérie de leurs interactions avec les composants cellulaires ou par leurs modifications post-traductionnelles (Etienne- Manneville, 2010). En effet, les dimères de tubulines polymérisées, inclues dans les microtubules, peuvent être, entre autres, détyrosinées, acétylées, mono ou poly-glutamylées, et mono ou poly-glycylées (Janke and Chloë Bulinski, 2011). Durant la migration cellulaire, ces modifications post-traductionnelles peuvent notamment jouer un rôle dans la régulation du trafic intracellulaire. L’objectif majeur de mon projet de thèse est d’étudier les mécanismesIii de régulation des microtubules au cours de la migration des astrocytes normaux et tumoraux, et plus particulièrement le rôle des modifications post-traductionnelles de la tubuline. Je me suis focalisée sur trois principales modifications post-traductionnelles des microtubules durant la migration : la polyglutamylation, la détyrosination et l’acétylation. En premier lieu, j’ai étudié le rôle potentiel de la polyglutamylation dans la mise en place de la polarité cellulaire chez les astrocytes. Je n’ai pas observé d’effet de cette modification durant la migration… / The migration of cells is necessary during the development. At the adult, she contributes to the renewal of fabrics, to the healing and to the traffic of immune cells. Cancer cells acquire capacities of migration which escape the normal mechanisms of regulation...