Thesis (Ph.D.)--Brown University, 2008. / Vita. Adviser: Jimmy Xu. Includes bibliographical references (leaves 145-154).

The properties of tubulins from Brugia malayi, B. pahangi, Nippostrongylus brasiliensis and rat brain were compared. Tubulins from all nematodes and rat brain were partially purified by polylysine agarose chromatography, those of brain also by cycles of assembly/disassembly, and all by taxol-induced assembly. The tubulins were compared with respect to concentration ($ mu$g tubulin/mg soluble protein), drugs binding and isoforms. The tubulins of B. malayi and B. pahangi were similar. However, the tubulin from these filariae were different from those of N. brasiliensis. Even larger differences were detected between the nematode tubulins and those of rat brain. However, all tubulins reacted to $ alpha$- and $ beta$-tubulin monoclonal antibodies, and had similar mobility on SDS-PAGE. Different peptide maps were obtained for N. brasiliensis tubulin compared with rat brain tubulin. Tubulins of N. brasiliensis bound more mebendazole than did those of Brugia nematodes (B$ sb{ rm max}$: pmoles/$ mu$g tubulin). The binding of benzimidazoles to nematode tubulins was much higher than to rat brain tubulin. Benzimidazole binding to brain tubulin was influenced by the degree of assembly of the tubulin. This did not appear to be the case for the nematode tubulins. In vitro translation of B. malayi mRNA resulted in two isoforms for both $ alpha$- and $ beta$-tubulins in contrast to the 4 $ alpha$- and 4-5 $ beta$-isoforms found naturally. This suggest post translational modification of tubulin may take place in B. malayi. This study has characterized some of the differences that exist between mammalian tubulins and those of nematodes on the one hand, and between the tubulins of a gastrointestinal nematode (N. brasiliensis) and those of filariae (B. malayi and B. pahangi) on the other hand.

Le cytosquelette d'une cellule eucaryote est constitué de trois types de polymères différents qui sont l'actine, les filaments intermédiaires et les microtubules. Ces éléments confèrent à la cellule l'essentiel de ses propriétés mécaniques telles que le maintien de l'architecture ou la modification de sa forme pour permettre le déplacement cellulaire. Ils sont également impliqués dans le transport d'organites ou de nutriments d'un bout à l'autre de la cellule, dans la ségrégation des chromosomes lors de la mitose ou encore dans le processus de division cellulaire. Pour répondre aux différents besoins de la cellule, ces filaments sont extrêmement dynamiques et peuvent se désassembler pour se réassembler à un autre endroit de la cellule. Cette dynamicité est régulée par de nombreuses protéines accessoires qui vont être capables de modifier les propriétés intrinsèques des différents filaments (dynamique, mécanique et organisatrice). Parmi ces protéines régulatrices, l'on distingue tout particulièrement les MAPs, pour Microtubule Associated Proteins, capables de modifier la dynamique et la structure des microtubules. MAP6, ou encore STOP pour Stable Tubule Only Peptide, est une MAP neuronale qui fut initialement décrite pour sa capacité à protéger les microtubules d'une exposition au froid ou encore de drogues dépolymérisantes comme le nocodazole. Des souris délétées pour le gène MAP6 montrent des troubles cognitifs et comportementaux proches des patients atteints de schizophrénie, impliquant au moins en partie des défauts de stabilisation des microtubules. Cependant, les effets de la protéine sur les microtubules restaient encore à déterminer. Dans ce contexte, à l'aide de diverses approches biochimiques et vidéomicroscopiques, nous avons montré que la protéine MAP6 est capable d’interagir de façon directe avec les microtubules in vitro et permet leur stabilisation. Elle permet aussi de réguler la dynamique des microtubules en augmentant la vitesse de polymérisation de l'extrémité (+), de diminuer la fréquence de catastrophe et l'apparition d’événements de sauvetage, de façon similaire à d'autres MAPs comme Tau ou MAP2. Cependant, contrairement aux autres MAPs, nous avons montré que MAP6 présente une dualité d'action sur le bout (-) des microtubules en diminuant et figeant très rapidement la dynamique de cette extrémité. Cette dualité pourrait ainsi conférer à MAP6 un rôle essentiel de nucléateur de microtubules en figeant l'extrémité (-) du microtubule et en favorisant la polymérisation et la stabilisation de l'extrémité (+). De plus, la protéine MAP6 est capable de modifier fortement la structure des microtubules. De part leur composition et leur rôle, les microtubules sont les éléments les plus rigides du cytosquelette et forment naturellement un tube creux linéaire. Or en présence de MAP6, les microtubules perdent cet aspect linéaire et adoptent une structure hélicoïdale (avec un pas d'environ 4,5 μm et une hauteur d'environ 1 μm) qui n'avait encore jamais été observée jusqu'à présent. La présence d'une telle population de microtubules dans la cellule pourrait ainsi apporter une certaine résistance mécanique ou encore permettre le maintien de l'architecture de l'axone. Enfin, nous avons montré que MAP6 peut aussi interagir de façon directe avec les filaments d'actines et les associer entre eux pour former des faisceaux. Dans les neurones, de nombreuses molécules ont été identifiées comme étant des régulateurs clés dans le « crosstalk » entre les filaments d'actines et les microtubules. L'interaction et la coordination entre les différents éléments du cytosquelette jouent un rôle essentiel dans la transmission et le relais du message synaptique. MAP6 pourrait être importante pour l'ensemble de ces mécanismes ce qui expliquerait les défauts de plasticité synaptique ainsi que les défauts cognitifs observés chez les souris KO MAP6. / The eukaryotic cell's cytoskeleton is constitued by three types of different polymers which are the actin filaments, the intermediate filaments and the microtubules. These elements confer on the cell the main part of its mechanical properties such as the architecture preservation or the modification of its shape to allow the cellular movement. They are also involved in the organelles or nutrients transport throughout the cell, in the chromosomes segregation during mitosis or still in the cellular division process. To answer the cell's various needs, these filaments are extremly dynamics and are able to dis-assemblate to re-assemblate in another place of the cell. Tis dynamic is regulated ny numerous proteins which are going to be capable of modifiying the intrinsic properties of the different filaments (dynamic, mechanic and structure). Among them are present the MAPs, for Microtubule-Associated Proteins, which will be able to influence the microtubule dynamics and structure. MAP6, also known as STOP for Stable Tubule Only Peptide, is a neuronal MAP which was initially described for its capacity to protect microtubule from cold or nocodazole exposure. KO MAP6 mice display cognitive and behavioral disorders close to patient with schyzophrenia, involving at least partially microtubules stabilization defects. However, the effects of the protein on the microtubules still remained to determine. In this context, using diverse biochemical and cideomicroscopy technics, we showed that MAP6 is able to directly interact in vitro with the microtubules and stabilizes them. It also regulates the microtubule dynamics by increasing the microtubule growth rate of the plus end extremity, decreases the shrinkage frequency and allows rescue of shrinking microtubules, similarly to other MAPs like Tau or MAP2. However, contrary to the other MAPs, we showed that MAP6 has another effect on the microtubule (-) end by decreazing and freezing its dynamics. This dual effect could confer to MAP6 an essential role of microtubules nucleation by stabilizing the new formed microtubule (-) end and by stabilizing and increasing the (+) end microtubule growth rate. Furthermore, MAP6 is also able to strongly modify the microtubule structure. Microtubules are the stiffest elements of the cytoskeleton and naturally form due to their composition linear hollow tubes. Yet in presence of MAP6, microtubules lose their usual shape and adopt a helical structure (4,5 μm pitch and approximatly 1 μm thickness) which had never been observed until now. The presence of such a population of microtubules in the neuron could thus provide a mechanical strength and allow the preservation of the axon architecture. Finally, we showed that MAP6 can also directly interact with the actin filaments to associate them and form bundles. In neurons, several molecules have been identified as key regulators in the " crosstalk " between actin filaments and microtubules. The interaction and coordination between the different cytoskeletal elements play a vital role in the synaptic transmission. MAP6 may be important for all these mechanisms which would explain the synaptic plasticity and cognitive defects observed in KO MAP6 mice.

Lors de son jaunissement, une feuille subit aussi bien des modifications morphologiques que métaboliques. Ce processus est appelé « sénescence ». Une meilleure compréhension des mécanismes de la sénescence représente un challenge très important non seulement pour la recherche fondamentale mais aussi pour de futures applications en biotechnologie. La thèse présentée ici porte sur d’importants aspects relatifs aux mécanismes cellulaires et métaboliques rencontrés lors de la sénescence foliaire et ce, en apportant une attention particulière à l’implication des mitochondries lors de ce processus. Dans un premier temps, nous avons développé deux méthodes pour isoler, à partir de feuilles d’Arabidopsis, soit des mitochondries conservant leurs fonctionnalités, soit des mitochondries hautement purifiées. Ces méthodes furent utilisées afin d’étudier le rôle des mitochondries dans l’équilibre redox des cellules mais aussi dans le but de déterminer les capacités mitochondriales lors de la sénescence foliaire. Plus précisément, nous avons comparé l’induction de la sénescence foliaire grâce à différents traitements à l’obscurité. Cette comparaison entre des feuilles individuellement placées à l’obscurité et des feuilles provenant d’une plante entièrement disposée à l’obscurité révéla des stratégies métaboliques très différentes. En intégrant des mesures de l’activité photosynthétique, de la respiration et de microscopie laser confocale avec des analyses de transcriptomique et de métabolomique, nous suggérons que le métabolisme d’une feuille provenant d’une plante placée longuement à l’obscurité entre dans un état de « veille » dans le but de maintenir la machinerie photosynthétique fonctionnelle le plus longtemps possible; dans ce cas, les capacités mitochondriales diminuent. A contrario, les mitochondries issues de feuilles individuellement soumises à l’obscurité sont beaucoup plus actives et peuvent par conséquent fournir l’énergie et les squelettes carbonés nécessaires à la dégradation des constituants cellulaires facilitant ainsi la remobilisation des nutriments. Par ailleurs, nous avons aussi mené des investigations sur la dynamique du cytosquelette lors d’une sénescence induite par l’obscurité. La mobilité mitochondriale fut affectée dans les feuilles individuellement soumises à l’obscurité par la dégradation précoce des microtubules ce qui ne fut pas le cas dans les feuilles issues d’une plante entièrement placée à l’obscurité. De plus, un certain nombre de MAPS (microtubules-associated proteins) semblent être impliquées dans l’agrégation des microtubules autour des chloroplastes. Dans son ensemble, cette thèse apporte d’importantes informations quant aux ajustements métaboliques ainsi qu’aux mécanismes cellulaires prenant place lorsque des feuilles d’Arabidopsis sont soumises à une obscurité prolongée. En particulier, nous pensons que les mitochondries ont un rôle prépondérant lors de la sénescence foliaire et que selon le statut métabolique de la plante, les régulations mitochondriales peuvent apparaître divergentes. / When switching from green to yellow, a leaf undergoes both morphological and metabolic changes. This process is known as senescence and improved understanding of its mechanisms is important both from a fundamental scientific perspective but also for biotechnological applications. The present thesis reports on several important aspects regarding the cellular and metabolic mechanisms occurring during leaf senescence with an emphasis on the mitochondrial contribution to this process. As a first step, we developed methods to isolate either highly functional crude mitochondria or highly purified mitochondria from leaves of Arabidopsis thaliana. These methods were further used to study mitochondrial contributions to cellular redox homeostasis and to estimate the mitochondrial capacities in leaves undergoing senescence. In particular, we compared the induction of senescence by different dark treatments in Arabidopsis. The comparison between individually darkened leaves and leaves from whole darkened plants revealed different metabolic strategies in response to darkness. Integrating data from measurements of photosynthesis, respiration and confocal laser microscopy with transcriptomic and metabolomic profiling, we suggested that metabolism in leaves of the whole darkened plants enter a “stand-by mode” with low mitochondrial activity in order to maintain the photosynthetic machinery for as long as possible. In contrast, mitochondria from individually darkened leaves are more active and may provide energy and carbon skeletons for the degradation of cell constituents, facilitating the retrieval of nutrients. We also investigated the dynamics of the microtubular cytoskeleton during dark-induced senescence. Mitochondrial mobility was affected by an early disruption of the microtubules in individually darkened leaves but not in whole darkened plants. In addition, several microtubules associated proteins (MAPs) seemed to be involved in the bundling of the microtubules around the chloroplasts. Altogether, the work presented in this thesis highlights several important steps regarding the metabolic adjustments and the cellular mechanisms in Arabidopsis leaves submitted to prolonged darkness. In particular, we suggest the mitochondria to fulfill specific and important functions during leaf senescence since the role of mitochondria in leaves experiencing prolonged darkness appears very dependant on the whole metabolic status of the plant.

Thesis advisor: Laura Anne Lowery / Thesis advisor: David Burgess / While XMAP215 (CKAP5 / ch-TOG) has been best characterized for its microtubule polymerase function, recent studies have highlighted a novel role for XMAP215 in facilitating an interaction between microtubules and F-actin in the embryonic neuronal growth cone, a critical structure involved in neuronal outgrowth and guidance mechanisms. Microtubule and F-actin cytoskeletal cross talk and reorganization are important aspects of axonal guidance mechanisms, but how associated proteins facilitate this function largely remains a mystery. In addition, it has long been established that neuronal growth cone navigation depends on changes in microtubule (MT) and F-actin architecture downstream of guidance cues. However, the mechanisms by which MTs and F-actin are dually coordinated remain a fundamentally unresolved question. Here, I report that the well-characterized MT polymerase, XMAP215 (also known as ch-TOG / CKAP5), plays an important role in mediating MT–F-actin interactions within the growth cone. I demonstrate that XMAP215 regulates MT–F-actin alignment through its N-terminal TOG 1–5 domains. Additionally, I show that XMAP215 directly binds to F-actin in vitro and co-localizes with F-actin in the growth cone periphery. By working with lab colleagues, we also find that XMAP215 is required for regulation of growth cone morphology and response to the guidance cue, Ephrin A5. Our findings provide the first strong evidence that XMAP215 coordinates MT and F-actin interaction in vivo. It is here that I suggest a model in which XMAP215 regulates MT extension along F-actin bundles into the growth cone periphery and that these interactions may be important to control cytoskeletal dynamics downstream of guidance cues. Furthermore, I then go on to study this dual microtubule and F-actin role, diving deeper into the mechanism behind this novel ability of XMAP215. Here, I report that XMAP215 is capable of spatially localizing populations of microtubules into distinct domains in the growth cone through its less well-characterized microtubule-lattice binding activity. In addition, through the use of purified proteins and biochemical assays, I show that XMAP215 is capable of binding directly to F-actin, facilitated by its unique TOG5 domain. Finally, through biochemical means and super resolution imaging, I show that this novel function of XMAP215 is mediated by polymerase-incompetent mutants of XMAP215. Taken together, my findings show strong evidence of a non-microtubule-polymerase function of XMAP215, providing mechanistic insights into how microtubule populations can be guided by interaction with the F-actin cytoskeleton. In conclusion, I explore a novel and functionally important role for XMAP215 in facilitating interactions between microtubule and actin cytoskeletons, bridging the two structural components of the cell together. In this way, XMAP215 is now known as a distinct microtubule/F-actin regulator that governs microtubule exploration through the help of actin in neurons, in addition to its previously characterized function as a microtubule polymerase. While this thesis explores the very groundwork of XMAP215’s new novel function, there is still a great deal more to learn about the overall mechanism occurring, as well as an understanding of its role in various cell types. / Thesis (PhD) — Boston College, 2020. / Submitted to: Boston College. Graduate School of Arts and Sciences. / Discipline: Biology.

Chemical modification is a powerful technique for probing functionally important amino acids. N-ethylmaleimide (NEM) reacts readily with exposed sulfhydryl groups, and has previously been shown to inhibit the activity of MT-motor proteins and tubulin assembly. This project seeks to investigate the mechanisms by which NEM affects motor function and inhibits MT minus end assembly. Recombinant motor domains of Drosophila kinesin (DK350 and DK375), Ncd (MC1), and squid kinesin (p181) were modified by NEM. NEM treatment was shown to affect the binding of MC1, but not recombinant kinesin proteins to MTs in the co-sedimentation assay. NEM treatment decreased the MT-stimulated ATPase rates of MC1 and DK350 in an NEM-concentration dependent manner, but did not affect the rate of DK375. Observed effects with DK375, p181, and MC1 were correlated with the number of labeled cysteines determined with [3H]NEM. As previously known, when NEM-treated tubulin was combined with untreated tubulin at certain ratios, assembly occurred only at the MT plus end. To investigate the mechanism by which NEM affects the polarity of tubulin assembly, tubulin was treated with NEM and assembly was analyzed using video-enhanced differential interference contrast microscopy. [3H]NEM was used to follow the time course of modification and to determine the number of modified sites per tubulin subunit. After 10 minutes, one cysteine was labeled on both a and b tubulin and this was sufficient to inhibit minus end assembly. Additionally, having one subunit labeled out of five tubulin subunits was sufficient to observe this effect. Protein digestion methods were used to aid in elimination of cysteines, to characterize potential critical cysteines in MC1, a, and b tubulin. / Master of Science

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La fonction barrière de la peau dépend en grande partie d’une différenciation appropriée des kératinocytes épidermiques. Au cours de ce processus, de nombreux changements ont lieu dans ces cellules tels que la diminution de la prolifération, le remodelage du cytosquelette, des changements dans l’expression génique, la dégradation du noyau et des organites de même que la formation d’une structure bien particulière : l’enveloppe cornée. Il est important que de tels évènements soient régulés de façon adéquate puisqu’un débalancement au sein de ces derniers peut mener à l’apparition de conditions pathologiques. La Dual Leucine zipper-bearing Kinase (DLK) est une Mitogen-Activated Protein Kinase Kinase Kinase dont l’expression est très forte au niveau de la couche granuleuse, soit la dernière couche de cellules vivantes avant la couche cornée de l’épiderme. Des études précédentes ont révélé que la surexpression de la DLK dans des kératinocytes en culture avait pour effet d’induire la différenciation terminale. Toutefois, les mécanismes par lesquels la DLK régule ce processus restent encore méconnus faisant en sorte que l’objectif général de cette thèse consiste à mieux les définir. L’hypothèse à la base de ces travaux est que la DLK est requise pour la différenciation des kératinocytes et que celle-ci y participe en favorisant la stabilisation des microtubules de même que l’expression ou l’activité de facteurs de transcription impliqués dans ce processus. Dans un premier temps, un modèle de peau reconstruite in vitro dans lequel l’expression de la DLK a été réduite par interférence à l’ARN a été développé. Il a été noté que la diminution de la DLK avait pour effets d’affecter la distribution de protéines de l’enveloppe cornée telles que la filaggrine et la transglutaminase 1 de même que d’inhiber la formation des couches granuleuse et cornée. Des analyses en immunofluorescence et en microscopie électronique ont permis d’observer des défauts au niveau des jonctions serrées et des desmosomes dans les peaux sous-exprimant la DLK révélant un rôle de cette kinase dans le bon maintien de ces deux types de jonctions cellulaires. L’impact de la DLK sur les microtubules a été étudié dans des kératinocytes en culture transduits à l’aide de vecteurs adénoviraux menant à la surexpression de la DLK de même que dans les peaux reconstruites présentant une expression réduite de cette kinase. Ces études ont permis de conclure que la DLK était non seulement en mesure d’induire la réorganisation et la stabilisation des microtubules en périphérie cellulaire, mais que celle-ci était également requise à la réalisation de ces processus. Afin de mieux décrire les mécanismes par lesquels la DLK assure la réorganisation des microtubules en périphérie cellulaire, les effets de la surexpression ou de la sous-expression de la DLK sur les protéines LIS1 et HSP27 (pour Heat shock protein 27 kDa), des régulateurs de la distribution des microtubules, ont été étudiés. Ces analyses ont permis de définir la DLK en tant qu’élément nécessaire à la bonne distribution en périphérie cellulaire de LIS1 et HSP27. Des études plus poussées ont révélé que l’expression de la DLK dans des kératinocytes en culture était non seulement en mesure d’induire la redistribution en périphérie cellulaire d’HSP27, mais également l’insolubilisation et la phosphorylation de cette protéine de choc thermique. Il a également été démontré que l’ensemble de ces processus dépendaient de l’activité de ERK (pour Extracellular-signal Regulated Kinase). Dans le but de définir l’importance des microtubules dans le processus de différenciation des kératinocytes, des peaux reconstruites ont été traitées avec un agent induisant la dépolymérisation de cette composante cytosquelettique soit plus précisément le nocodazole. Un tel traitement produit un phénotype similaire à celui des peaux reconstruites sous-exprimant la DLK suggérant les microtubules comme d’importants effecteurs de la différenciation induite par la DLK. Dans la perspective de mieux définir les effets de la DLK sur la signalisation cellulaire et l’expression génique globale, nous avons eu recours à l’étude de la phosphorylation d’importants médiateurs de la signalisation moléculaire intracellulaire de même qu’à des analyses en micropuce à ADN d’échantillons provenant de peaux reconstruites sous-exprimant la DLK. Cette démarche a permis de révéler une hausse de la phosphorylation de ERK1/2, de JNK1/2/3, de GSK3 (pour Glycogene Synthase Kinase 1) et du récepteur à l’EGF (pour Epidermal Growth Factor). Les analyses en micropuce à ADN ont permis de révéler une réduction dans l’expression de nombreux gènes impliqués dans la formation de l’enveloppe cornée. Finalement, la réduction de c-Jun et de C/EBPα a pu être observée dans les noyaux de peaux reconstruites sous-exprimant la DLK révélant ainsi l’importance de cette kinase dans la régulation de ces facteurs de transcription dans un contexte de différenciation des kératinocytes. Globalement, nos travaux montrent que la DLK est requise pour la différenciation des kératinocytes et que celle-ci y contribue en assurant la réorganisation des microtubules en périphérie cellulaire, la consolidation des desmosomes et des jonctions serrées de même la régulation positive des facteurs c-Jun et C/EBPα. / Skin barrier function greatly depends on proper keratinocyte differentiation in the epidermis. During this process, many changes occur within the cell such as decrease in cell proliferation, cytoskeleton reorganization, changes in gene expression, nucleus and organelles elimination as well as cornified envelope formation. Keratinocyte differentiation must be finely orchestrated since misregulation of this process may lead to pathological conditions. The Dual Leucine zipper-bearing Kinase (DLK) is a Mitogen-Activated Protein Kinase Kinase Kinase showing a strong expression in the granular layer, the last layer composed of living cells before reaching the cornified layer. Previous studies revealed DLK capacity to induce keratinocyte terminal differentiation process. However, how DLK promotes such an event remains unknown. The main objective of this thesis is to identify mechanisms and potential effectors of the DLK-induced keratinocyte differentiation. Our hypothesis is that DLK is required for keratinocyte differentiation by promoting microtubule stabilization as well as the expression or the activity of transcription factors involved in this process. In order to test our hypothesis, a tissue-engineered skin (TES) model with a reduced DLK expression was produced using a RNA interference approach. Impaired distribution of cornified envelope proteins such as filaggrin and transglutaminase 1 as well as reduced granular and cornified layers were observed in TES with reduced DLK expression. In those samples, immunofluorescence and electron microscopy analyses pointed out desmosomal and tight junctional defects suggesting a role for DLK in the maintenance of these types of cell junctions. The impact of DLK expression on microtubules was also studied in TES with reduced DLK expression and in keratinocytes in culture overexpressing DLK following gene transduction using adenoviral vectors. These studies led to the conclusion that DLK not only promotes but is also required for microtubules reorganization and stabilization to cell periphery. To explain DLK capacity to induce such a process, effects of DLK depletion or overexpression on microtubule regulators such as LIS1 and HSP27 were investigated by immunofluorescence staining. These analyses revealed that DLK induces and is required for LIS1 and HSP27 relocalization to cell periphery. In additional studies, our results show that DLK expression in normal human keratinocytes in culture not only promotes HSP27 distribution to cell periphery but also induces HSP27 insolubilization and phosphorylation in an ERK-dependent manner. In order to more precisely define the role of microtubules in keratinocyte differentiation process, TES were treated with nocodazole, a microtubule depolymerizing agent. The effect of such a treatment was to reproduce the phenotype of DLK-depleted TES suggesting that microtubules are important effectors of DLK-induced keratinocyte differentiation. In an attempt to describe the impact of DLK on global gene expression, RNA samples of DLK-depleted TES were studied using microarray analyses. This approach revealed a reduction in the expression of many genes coding for cornified envelope proteins. Reductions of c-Jun and C/EBPα immunofluorescence staining were also noted in TES with a reduced DLK expression suggesting this kinase as a c-Jun and C/EBPα regulator in the context of keratinocyte differentiation. Globally, our works show that DLK is required for keratinocyte differentiation since it promotes microtubule reorganization to cell periphery, desmosomes and tight junction consolidation as well as c-Jun and C/EBPα localization to the nucleus.

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